專利名稱：一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用金屬表面的緩釋生長因子涂層的制備方法。
背景技術(shù)：
醫(yī)用金屬由于其良好的生物相容性和優(yōu)良的力學(xué)性能被廣泛用于外科整形、骨植入體等領(lǐng)域。但醫(yī)用金屬通常都是生物惰性的，其表面骨再生能力弱，新骨生長緩慢。這導(dǎo)致醫(yī)用金屬植入體內(nèi)后，與周圍骨組織之間不能快速形成牢固的鍵合。為了改善醫(yī)用金屬植入體與骨組織之間的整合能力，往往需要對其進(jìn)行表面改性。其中一種表面改性的方法是在醫(yī)用金屬植入體表面載入細(xì)胞生長因子來促進(jìn)骨組織的再生。常見的細(xì)胞生長因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)、血管生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)換生長因子(TGF_i32)等在骨修復(fù)過程中起著關(guān)鍵的作用。目前裝載生長因子的方法有直接將生長因子吸附在材料表面，但是這種方法無法實(shí)現(xiàn)生長因子的緩釋作用，而且生長因子暴露在生理環(huán)境中很容易受各種因素的影響而失活；也有將處理后的生物醫(yī)用金屬材料與生長因子以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，這種方式雖可以實(shí)現(xiàn)生長因子的固載，但是共價(jià)鍵結(jié)合方式往往會導(dǎo)致生長因子失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種醫(yī)用金屬表面的緩釋生長因子涂層的制備方法，該法制備的緩釋生長因子涂層的生長因子負(fù)載量高，生長因子能緩慢釋放與體內(nèi)新骨生長速度適配，且生長因子的活性強(qiáng)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)其發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是，一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其具體步驟如下:A、生長因子的包裹:
將對骨生長有促進(jìn)作用的生長因子溶解于濃度為0.5-2.5mg/ml的聚陰離子溶液中，得到含有生長因子的聚陰離子溶液，生長因子的濃度為0.5-10 μ g/ml。將所述的含生長因子的聚陰離子溶液與濃度為0.5-2.5mg/ml的帶氨基的聚陽離子溶液，按體積比1: 2-5的比例混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，得到載有生長因子的納米顆粒；B、氧化石墨烯的羧基化:將濃度為20mg/ml的ClCH2COONa溶液和濃度為20mg/ml的NaOH溶液按體積比1:1配制成混合溶液，再將80mg的氧化石墨烯加入4-6ml的混合溶液中反應(yīng)1.5-2.5h,使氧化石墨烯上的含氧基團(tuán)羧基化；然后將溶液透析并凍干，得到羧基化的氧化石墨烯粉。C、納米顆粒的固載:將B步得到的羧基化的氧化石墨烯粉與A步制得的載生長因子的納米顆粒進(jìn)行EDC/NHS催化反應(yīng)，使羧基化氧化石墨烯表面的羧基與納米顆粒表面的氨基形成酰胺鍵、載生長因子的納米顆粒固載于氧化石墨烯上；然后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥，再將干燥份溶于pH值6.0的緩沖溶液中，形成氧化石墨烯/納米顆粒溶液；
D、將接枝有多巴胺涂層的醫(yī)用金屬材料在C步的氧化石墨烯/納米顆粒溶液中浸提，使負(fù)載有生長因子的氧化石墨烯涂層通過靜電吸附結(jié)合在醫(yī)用金屬材料表面。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:一、與在基底材料表面上直接裝載生長因子相比，本發(fā)明先將生長因子包裹在納米顆粒中再與氧化石墨烯結(jié)合，在生長因子負(fù)載到材料表面的過程中，只依賴于生長因子與聚電解質(zhì)離子之間的靜電相互作用結(jié)合，不涉及化學(xué)反應(yīng)，生長因子的活性不會受到破壞，能很好地保持生長因子的活性。二、氧化石墨烯是表面帶有多種含氧基團(tuán)的石墨烯衍生物。它具有單原子層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)，比表面積很大，能將載有生長因子的納米顆粒包裹起來且負(fù)載量大，可以實(shí)現(xiàn)藥物的高效負(fù)載，并能較好的調(diào)控生長因子的緩慢釋放。上述的醫(yī)用金屬是鈦、鈦合金或不銹鋼。上述的生長因子是BMP-2、VEGF或TGF-β 2。這些生長因子對骨生長都有明顯的促進(jìn)作用。上述的聚陽離子是殼聚糖或聚賴氨酸，聚陰離子是肝素、硫酸軟骨素、海藻酸鈉或透明質(zhì)酸。下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其具體步驟如下:
Α、生長因子的包裹:將對骨生長有促進(jìn)作用的生長因子ΒΜΡ-2溶解于濃度為0.5mg/ml的硫酸軟骨素溶液中，得到含有BMP-2的硫酸軟骨素溶液，且BMP-2在硫酸軟骨素溶液中的濃度為
0.5 μ g/ml ；將所述的所述的含生長因子BMP-2的硫酸軟骨素溶液與0.5mg/ml的聚賴氨酸溶液，按1: 2的體積比例混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，得到載有BMP-2的納米顆粒；B、氧化石墨烯的羧基化:將濃度為20mg/ml的ClCH2COONa溶液和濃度為20mg/ml的Na0H80mg溶液按體積比為1:1配制成混合溶液，再將80mg氧化石墨烯加入6ml混合溶液中反應(yīng)2.5h，使氧化石墨烯上的含氧基團(tuán)羧基化；然后將溶液透析并凍干，得到羧基化的氧化石墨烯粉；C、納米顆粒的固載:將B步得到的羧基化的氧化石墨烯粉與A步制得的載生長因子的納米顆粒進(jìn)行EDC/NHS催化反應(yīng)，使羧基化氧化石墨烯表面的羧基與納米顆粒表面的氨基形成酰胺鍵、載生長因子的納米顆粒固載于氧化石墨烯上；然后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥，再將干燥份溶于pH值6.0的緩沖溶液中，形成氧化石墨烯/納米顆粒溶液；其中，EDC/NHS催化反應(yīng)為現(xiàn)有技術(shù)，其具體操作可以是:Cl、將B步制備的羧基化氧化石墨烯溶于2-嗎啉乙磺酸(MES) (0.1M)溶液中，得到濃度為lmg/ml的羧基化氧化石墨烯的MES溶液；向Iml羧基化氧化石墨烯的MES溶液中加入0.4mg濃度為2mM的EDC(1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)和0.6mg濃度為5mM的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，將pH調(diào)至5 6 ;室溫下反應(yīng)15min ;再向溶液中加入1.4μ I濃度為20mM的2-巰基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的 EDC ；C2、將A步制備的載有生長因子BMP-2的納米顆粒，均勻溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，得到納米顆粒濃度為lmg/ml的磷酸鹽緩沖溶液溶液，取Iml該溶液加入Cl步所得到的溶液中，調(diào)節(jié)PH至7.2，室溫下反應(yīng)2h。最后加入濃度為IOmM的羥胺(IOmM)中和未反應(yīng)的NHS。D、將接枝有多巴胺涂層的鈦合金在C步的氧化石墨烯/納米顆粒溶液中浸提，帶負(fù)電的負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯與帶正電的多巴胺涂層通過靜電吸附，從而使負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯結(jié)合在鈦合金表面。實(shí)施例二一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其具體步驟如下:A、生長因子的包裹:將對骨生長有促進(jìn)作用的生長因子VEGF溶解于濃度為1.5mg/ml的肝素溶液中，得到含有VEGF的肝素溶液，且肝素溶液中VEGF的濃度為5 μ g/ml ；將所述的含生長因子VEGF的肝素溶液與2.5mg/ml的殼聚糖溶液，按1: 4的體積比例混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，得到載有BMP-2的納米顆粒；B、氧化石墨烯的羧基化:將濃度為20mg/ml的ClCH2COONa溶液和濃度為20mg/ml的Na0H80mg溶液按體積比為1:1配制成混合溶液，再將SOmg氧化石墨烯加入5ml混合溶液中反應(yīng)2h，使氧化石墨烯上的含氧基團(tuán)羧基化；然后將溶液透析并凍干，得到羧基化的氧化石墨烯粉；C、納米顆粒的固載:將B步得到的羧基化的氧化石墨烯粉與A步制得的載生長因子的納米顆粒進(jìn)行EDC/NHS催化反應(yīng)，使羧基化氧化石墨烯表面的羧基與納米顆粒表面的氨基形成酰胺鍵、載生長因子的納米顆粒固載于氧化石墨烯上；然后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥，再將干燥份溶于pH值6.0的緩沖溶液中，形成氧化石墨烯/納米顆粒溶液；其中，EDC/NHS催化反應(yīng)為現(xiàn)有技術(shù)，其具體操作可以是:Cl、將B步制備的羧基化氧化石墨烯溶于2-嗎啉乙磺酸(MES) (0.1M)溶液中，得到濃度為lmg/ml的羧基化氧化石墨烯的MES溶液；向Iml羧基化氧化石墨烯的MES溶液中加入0.4mg濃度為2mM的EDC(1-乙基_3_(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺)和0.6mg濃度為5mM的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，將PH調(diào)至5 ;室溫下反應(yīng)15min ;再向溶液中加入1.4 μ I濃度為20mM的2-巰基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的 EDC ；C2、將A步制備 的載有生長因子VEGF的納米顆粒，均勻溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，得到納米顆粒濃度為lmg/ml的磷酸鹽緩沖溶液溶液，取Iml該溶液加入Cl步所得到的溶液中，調(diào)節(jié)pH至7.2，室溫下反應(yīng)2h。最后加入濃度為IOmM的羥胺(IOmM)中和未反應(yīng)的 NHS。D、將接枝有多巴胺涂層的鈦在C步的氧化石墨烯/納米顆粒溶液中浸提，帶負(fù)電的負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯與帶正電的多巴胺涂層通過靜電吸附，從而使負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯結(jié)合在鈦表面實(shí)施例三一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其具體步驟如下:A、生長因子的包裹:將對骨生長有促進(jìn)作用的生長因子TGF- β 2溶解于濃度為2.5mg/ml的海藻酸鈉液中，得到含有TGF- β 2的海藻酸鈉溶液，且TGF- β 2的濃度為10 μ g/ml ；將所述的含生長因子TGF-β 2的海藻酸鈉溶液與1.0mg/ml的殼聚糖溶液，按I: 5的體積比例混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，得到載有BMP-2的納米顆粒；B、氧化石墨烯的羧基化:將濃度為20mg/ml的ClCH2COONa溶液和濃度為20mg/ml的Na0H80mg溶液按體積比為1:1配制成混合溶液，再將80mg氧化石墨烯加入4ml混合溶液中反應(yīng)1.5h，使氧化石墨烯上的含氧基團(tuán)羧基化；反應(yīng)后將溶液透析并凍干，得到羧基化的氧化石墨烯粉；C、納米顆粒的固載:將B步得到的羧基化的氧化石墨烯粉與A步制得的載生長因子的納米顆粒進(jìn)行EDC/NHS催化反應(yīng)，使羧基化氧化石墨烯表面的羧基與納米顆粒表面的氨基形成酰胺鍵、載生長因子的納米顆粒固載于氧化石墨烯上；然后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥，再將干燥份溶于pH值6.0的緩沖溶液中，形成氧化石墨烯/納米顆粒溶液；其中，EDC/NHS催化反應(yīng)為現(xiàn)有技術(shù)，其具體操作可以是:Cl、將B步制備的羧基化氧化石墨烯溶于2-嗎啉乙磺酸(MES) (0.1M)溶液中，得到濃度為lmg/ml的羧基化氧化石墨烯的MES溶液；向Iml羧基化氧化石墨烯的MES溶液中加入0.4mg濃度為2mM的EDC(1-乙基_3_(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺)和0.6mg濃度為5mM的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)，將PH調(diào)至6 ;室溫下反應(yīng)15min ;再向溶液中加入1.4 μ I濃度為20mM的2-巰基乙醇(2-mercapto ethanol)中和多余的 EDC ；C2、將A步制備的載有生長因子TGF-β 2的納米顆粒，均勻溶于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，得到納米顆粒濃度為lmg/ml的磷酸鹽緩沖溶液溶液，取Iml該溶液加入Cl步所得到的溶液中，調(diào)節(jié)pH至7.5，室溫下反應(yīng)2h。最后加入濃度為IOmM的羥胺(IOmM)中和未反應(yīng)的NHS。D、將接枝有多巴胺涂層的不銹鋼在C步的氧化石墨烯/納米顆粒溶液中浸提，帶負(fù)電的負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯與帶正電的多巴胺涂層通過靜電吸附，從而使負(fù)載有納米顆粒的氧化石墨烯結(jié)合在不銹鋼表面。實(shí)施例四本例的操作與實(shí)施例一基本相同，不同的僅僅是:將實(shí)例一中制備納米顆粒的聚陰離子由硫酸軟骨素?fù)Q成透明質(zhì)酸。本發(fā)明中使用的接枝有多巴胺涂層的醫(yī)用金屬材料，可采用現(xiàn)有技術(shù)制得，如可采用以下方法制得:將2mg/ml的多巴胺溶于IOmM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-HCl)溶液中調(diào)節(jié)pH至8.5，再將酸洗、堿洗后的醫(yī)用金 屬材料浸泡到溶液里12h，然后沖洗醫(yī)用金屬材料三次，就在醫(yī)用金屬材料(鈦、鈦合金、不銹鋼)表面接枝上多巴胺涂層。
權(quán)利要求
1.一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其具體步驟如下: A、生長因子的包裹: 將對骨生長有促進(jìn)作用的生長因子溶解于濃度為0.5-2.5mg/ml的聚陰離子溶液中，得到含有生長因子的聚陰離子溶液，生長因子的濃度為0.5-10μ g/ml。
將所述的含生長因子的聚陰離子溶液與濃度為0.5-2.5mg/ml的帶氨基的聚陽離子溶液，按體積比1: 2-5的比例混合，并攪拌、離心、冷凍干燥，得到載有生長因子的納米顆粒; B、氧化石墨烯的羧基化: 將濃度為20mg/ml的ClCH2COONa溶液和濃度為20mg/ml的NaOH溶液按體積比1:1配制成混合溶液，再將80mg的氧化石墨烯加入4-6ml的混合溶液中反應(yīng)1.5-2.5h,使氧化石墨烯上的含氧基團(tuán)羧基化；然后將溶液透析并凍干，得到羧基化的氧化石墨烯粉。
C、納米顆粒的固載: 將B步得到的羧基化的氧化石墨烯粉與A步制得的載生長因子的納米顆粒進(jìn)行EDC/NHS催化反應(yīng)，使羧基化氧化石墨烯表面的羧基與納米顆粒表面的氨基形成酰胺鍵、載生長因子的納米顆粒固載于氧化石墨烯上；然后將反應(yīng)液透析、冷凍干燥，再將干燥份溶于PH值6.0的緩沖溶液中， 形成氧化石墨烯/納米顆粒溶液； D、將接枝有多巴胺涂層的醫(yī)用金屬材料在C步的氧化石墨烯/納米顆粒溶液中浸提，使負(fù)載有生長因子的氧化石墨烯涂層通過靜電吸附結(jié)合在醫(yī)用金屬材料表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其特征在于:所述的醫(yī)用金屬是鈦、鈦合金或不銹鋼。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其特征在于:所述的生長因子是BMP-2、VEGF或TGF-3 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，其特征在于:所述的聚陽離子是殼聚糖或聚賴氨酸，所述的聚陰離子是硫酸軟骨素、肝素、海藻酸鈉或透明質(zhì)酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醫(yī)用金屬表面緩釋生長因子涂層的制備方法，該方法以氧化石墨烯為生長因子載體；先將生長因子包裹在聚陽離子與聚陰離子形成的復(fù)合納米顆粒中；含有生長因子的納米顆粒通過與羧基化的氧化石墨烯反應(yīng)形成的酰胺鍵，使納米顆粒固定到氧化石墨烯上；通過浸提法將負(fù)載有生長因子的氧化石墨烯在經(jīng)過多巴胺處理的生物醫(yī)用金屬表面形成涂層。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)較高的生長因子載入量，同時(shí)保護(hù)因子的活性、實(shí)現(xiàn)因子的緩釋。
文檔編號A61L27/30GK103100114SQ20131002451
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月23日
發(fā)明者魯雄, 韓璐, 王振銘, 姜麗麗, 郭亞楠, 孫洪龍, 馮波, 翁杰 申請人:西南交通大學(xué)