專利名稱：葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物及其制備方法和應用。
背景技術：
抗腫瘤化學藥物因水溶性差、體內(nèi)非特異性分布、毒副作用較大等，無法充分發(fā)揮其治療功效。紫杉醇作為一線化療藥物，可促進微管裝配并阻止微管蛋白解聚，從而有效抑制癌細胞的快速分裂和增殖。但紫杉醇難溶于水，臨床使用的紫杉醇注射液是以聚氧乙烯蓖麻油/乙醇(1:1，v/v)作為溶媒，靜脈注射后可引起過敏反應、心血管毒性等毒副作用。采用藥物遞送系統(tǒng)可克服上述缺陷，其中水溶性聚合物載體與紫杉醇化學連接形成的聚合物藥物可改善紫杉醇溶解度，控制藥物釋放，提高腫瘤靶向性，減輕毒副作用。紫杉醇可直接與聚合物載體連接，但可能因空間位阻等因素藥物釋放速率過慢(Shahin M et al.，IntJ Pharm 2010，389:213-222)，可將紫杉醇先與二元羧酸或氨基酸等小分子連接后間接連接至聚合物載體，間接連接可提高藥物的反應活性，增加藥物水解位點。目前研究的基于紫杉醇的聚合物藥物多經(jīng)靜脈注射給藥，靜脈注射后藥物可直接進入血液循環(huán)；在癌癥的長期治療過程中，口服相對于靜脈注射更加方便，可提高病人順應性。紫杉醇的小腸滲透性差，易受到腸上皮細胞表面P-糖蛋白介導的藥物外排及細胞色素P450依賴的藥物代謝，口服生物利用度非常低。借助遞送載體可提高藥物的口服吸收，其中殼聚糖以優(yōu)良的理化性質(zhì)及易于進行結構與功能修飾而廣泛用于口服遞送載體的制備，但殼聚糖在生理環(huán)境下水溶性差，應用受到限制。殼聚糖可經(jīng)水解或酶解為低分子量殼聚糖(Mw〈10 kDa)，水溶性增強，將紫杉醇經(jīng)琥珀酰酯鍵與低分子量殼聚糖共價連接形成低分子量殼聚糖-紫杉醇聚合物藥物，可改善紫杉醇溶解性，提高紫杉醇口服生物利用度(LeeE et al., J Med Chem 2008，51:6442_6449)，口服低分子量殼聚糖-紫杉醇的體內(nèi)抑瘤率和靜脈注射紫杉醇溶液相當。但一般認為分子量大于50 kDa的分子或與其相當?shù)牧Ｗ?例如納米粒)有明顯的增強滲透滯留(EPR)效應，可被動靶向腫瘤組織。低分子量殼聚糖-紫杉醇聚合物藥物的分子量較小且不能自組裝形成納米粒，無法利用EPR效應提高抗腫瘤功效。利用配體與細胞膜上受體特異性識別作用，對藥物遞送載體進行靶向配體修飾可增加細胞對藥物遞送載體的攝取，增強主動靶向功效。小腸上皮細胞表面葉酸受體高表達，葉酸修飾的納米?？娠@著提高藥物的小腸轉運能力(Roger E et al., Mol Pharmaceutics2012,9:2103-2110);葉酸受體在多種腫瘤細胞( 如卵巢癌、肝癌、乳腺癌等)表面高表達且活性顯著高于正常細胞，葉酸修飾的納米粒可在腫瘤組織中高度蓄積，具有良好的腫瘤細胞革巴向性(Wang J et al., Biomacromolecules 2011,12:228-234)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種具有自組裝性能、可用于多種給藥途徑的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物及其制備方法和應用。本發(fā)明的基本方案如下:
琥珀酸酐經(jīng)吡啶催化開環(huán)，與紫杉醇連接合成琥珀酰紫杉醇；殼聚糖與碘甲烷反應合成殼聚糖季銨鹽；殼聚糖季銨鹽與琥珀酰紫杉醇經(jīng)催化縮合，并將靶向配體葉酸連接至殼聚糖季銨鹽，制得葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。該聚合物藥物因含有親水性聚合物鏈和疏水性藥物，在水中可自組裝形成納米粒。本發(fā)明依據(jù)殼聚糖季銨鹽的親水性、黏膜黏附和細胞黏附等作用，將紫杉醇通過琥珀酰酯鍵共價連接至殼聚糖季銨鹽，提高藥物水溶性，控制藥物釋放，增強藥物腫瘤靶向性；依據(jù)葉酸對于多種腫瘤細胞的主動靶向性，將葉酸共價連接至殼聚糖季銨鹽，實現(xiàn)聚合物藥物的腫瘤組織主動靶向，減小藥物對正常組織的毒副作用。本發(fā)明制備的葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物可通過口服和靜脈注射等多種給藥途徑提高藥物的抗腫瘤功效。具體說來，本發(fā)明提供的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，是抗腫瘤藥物紫杉醇經(jīng)琥珀酰酯鍵共價連接至殼聚糖季銨鹽，再將靶向配體葉酸連接至殼聚糖季銨鹽形成的聚合物藥物，該聚合物藥物在水中可自組裝形成納米粒。其中殼聚糖分子量范圍為10-500 kDa，紫杉醇載藥量為3_25%。所述的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，自組裝形成的納米粒平均粒徑為 100-500 nm。本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備方法如下:
(1)琥珀酸酐混懸于二氯甲烷，加入紫杉醇，攪拌，加入無水吡啶，攪拌反應24-72h ;減壓蒸餾，加水洗滌，離心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇；
(2)按照文獻報道方法(EurJ Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成殼聚糖季銨鹽；
(3)琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亞砜，加入催化劑，攪拌；將殼聚糖季銨鹽溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亞砜中，反應6-24 h；
(4)將葉酸溶于二甲基亞砜，加入催化劑，攪拌，加至步驟(3)得到的反應體系中，避光反應6-24 h ;純化，冷凍干燥，得葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。步驟(I)中，琥珀酸酐與紫杉醇的質(zhì)量比為1:1-1:10，吡啶用量為反應體系的0.25-2.0% (v/v)。步驟(2)中，合成殼聚糖季銨鹽反應時間為45-150 min ;所得殼聚糖季銨鹽以Cl—型陰離子交換樹脂純化、冷凍干燥；其中反應45、120和150 min所得的殼聚糖季銨鹽的季銨化度分別為15%、30%和45%。步驟(3)中，反應所用催化劑為1- ( 3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，且琥珀酰紫杉醇與1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比均為1:1-1:10，琥珀酰紫杉醇與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.4:1，殼聚糖季銨鹽水溶液濃度為10-30 mg/ml。步驟(4)中，葉酸與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.3:1，反應所用催化劑為1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，且葉酸與1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比均為1:1-1:10。本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，可通過口服和靜脈二種給藥途徑用于肝癌等多種癌癥的治療。本發(fā)明的優(yōu)點在于:
(I)依據(jù)殼聚糖季銨鹽良好的水溶性、黏附性及促進滲透等優(yōu)點，將紫杉醇經(jīng)生理條件下可裂解的連接鍵共價連接至殼聚糖季銨鹽，并將靶向配體葉酸連接至殼聚糖季銨鹽，制備一種新型葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。本發(fā)明的葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物可增強藥物小腸滲透性，不僅可通過EPR效應富集于腫瘤組織，也可通過靶向配體葉酸與腫瘤細胞表面特異性受體的識別、結合，增加腫瘤組織中藥物分布，提高藥物的抗腫瘤功效，降低對其它臟器的毒性。(2)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物水中自組裝形成納米粒，粒徑分布均勻，分散性較好，且在不同pH環(huán)境下粒徑穩(wěn)定。(3)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物可在體內(nèi)緩慢釋藥，可防止藥物到達靶點前對正常組織的毒性；酸性條件下聚合物藥物較穩(wěn)定，藥物釋放速率隨釋放介質(zhì)PH的增大而增大，可防止藥物在胃部損失，有利于聚合物藥物的腸道吸收。(4)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的小腸黏膜黏附率高于殼聚糖季銨鹽，可通過打開小腸上皮緊密連接和上皮細胞攝取顯著提高紫杉醇的小腸轉運效率。(5)本發(fā)明的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物可通過口服和靜脈注射二種給藥途徑用于肝癌等多種癌癥的治療；H22肝癌模型小鼠抑瘤效果研究中，口服和靜脈注射葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物`組的抑瘤率均顯著高于靜脈注射紫杉醇溶液組。(6)連接紫杉醇和葉酸可降低殼聚糖季銨鹽的正電荷，增強血液相容性。(7)本發(fā)明各種原料廉價易得，引入靶向基團的方法簡捷方便，連接鍵牢固，合成工藝簡單，條件可控，重復性好。本文所用術語:
如本文所用，術語“PTX”指紫杉醇。如本文所用，術語“ TMC”指N，N, N-三甲基殼聚糖季銨鹽。如本文所用，術語“EDC”指1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽。如本文所用，術語“NHS”指N-羥基琥珀酰亞胺。如本文所用，術語“FA”指葉酸。如本文所用，術語“ TMC-PTX”指殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。如本文所用，術語“FA-TMC-PTX”指葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。
圖1為葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的掃描電鏡圖(實施例13)。圖中標尺2 u rtio圖2為葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物(實施例12、13、14)在不同PH環(huán)境下的粒徑。圖3為葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物(實施例13)在pH 7.4 PBS中10天內(nèi)的釋放情況(A);在不同pH釋放介質(zhì)中的釋放情況(B)，其中，從下往上的曲線對應的 Ph 值依次為:1.2,4.5,5.0,5.3,5.7,6.0,6.5,7.0,7.4。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下例實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，濃度為質(zhì)量體積百分數(shù)(w/V)。實施例1琥珀酰紫杉醇的制備
稱取3 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，攪拌；加30 mg PTX，攪拌；加10 μ L無水吡啶，反應體系變澄清，攪拌24 h ；50 ° C減壓蒸餾，加10 mL水，攪拌15 min，離心收集沉淀；力口30 mL水洗滌沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。實施例2琥珀酰紫杉醇的制備
稱取6 mg琥珀酸酐，加4 mL二氯甲烷，攪拌；加30 mg PTX，攪拌；加20 μ L無水吡啶，反應體系變澄清，攪拌40 h ；50 ° C減壓蒸餾，加10 mL水，攪拌15 min，離心收集沉淀；力口30 mL水洗滌沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。實施例3琥珀酰紫杉醇的制備
稱取10 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲燒，攪拌；加30 mg PTX，攪拌；加30 μ L無水批啶，反應體系變澄清，攪拌55 h ；50 ° C減壓蒸餾，加10 mL水，攪拌15 min，離心收集沉淀；加30 mL水洗滌沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。實施例4琥珀酰紫杉醇的制備
稱取20 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲燒，攪拌；加30 mg PTX，攪拌；加50 μ L無水批啶，反應體系變澄清，攪拌65 h ；50 ° C減壓蒸餾，加10 mL水，攪拌15 min，離心收集沉淀；加30 mL水洗滌沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。實施例5琥珀酰紫杉醇的制備
稱取30 mg琥珀酸酐，加4 mL 二氯甲燒，攪拌；加30 mg PTX，攪拌；加80 μ L無水批啶，反應體系變澄清，攪拌72 h ；50 ° C減壓蒸餾，加10 mL水，攪拌15 min，離心收集沉淀；加30 mL水洗滌沉淀，離心收集沉淀，真空干燥。實施例6葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為10 kDa，反應時間為45 min，所得TMC的季銨化度為15% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:1:1，攪拌；力口入TMC溶液，反應6 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3,500 Da)，冷凍干燥。實施例7葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為30 kDa,反應時間為120 min,所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:3:3，攪拌；力口入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷凍干燥。實施例8葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為150 min，所得TMC的季銨化度為45% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應24 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光攪拌反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例9葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為200 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:7:7，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例10葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為500 kDa，反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:10:10，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例11葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取10 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例12葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取20 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWCO 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例13葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例14葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取60 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例15葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為1 20 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取80 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例16葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為10 kDa，反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于10 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；力口入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷凍干燥。實施例17葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為30 kDa,反應時間為120 min,所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于10 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于10 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；力口入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWCO 3,500 Da)，冷凍干燥。實施例18葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于6.7 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于13.3 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC, FA、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例19葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫 杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為200 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于60 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例20葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為500 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于80 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例21葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取12 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1: 1: 1，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應6 h;以水透析3 天(MWCO 3,500 Da)，冷凍干燥。實施例22葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取22 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:2: 2，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWCO 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例23葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照 文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取40 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:4:4，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應24 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例24葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取50 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:6: 6，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例25葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備
按照文獻報道方法(Eur J Pharm Biopharm 2004，57:77-83)合成TMC，殼聚糖重均分子量為100 kDa,反應時間為120 min，所得TMC的季銨化度為30% ;C1_型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥。稱取200 mg TMC溶于20 mL水；稱取40 mg琥珀酰紫杉醇(實施例3)溶于40 mL 二甲基亞砜，加入NHS和EDC，琥珀酰紫杉醇、NHS和EDC的摩爾比為1:5:5，攪拌；加入TMC溶液，反應12 h制備TMC-PTX ;稱取60 mg FA溶于二甲基亞砜，加入NHS和EDC，F(xiàn)A、NHS和EDC的摩爾比為1:10:10，攪拌，加至TMC-PTX反應體系中，避光反應12 h ;以水透析3天(MWC0 3, 500 Da)，冷凍干燥。實施例26掃描電鏡表征葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的形態(tài)
將實施例13的FA-TMC-PTX用適量水分散后滴加至云母片上，室溫自然干燥，黏于銅臺，噴金，掃描電鏡(SEM)觀察其形貌，見附圖1。由圖可見FA-TMC-PTX可自組裝形成納米粒，納米粒近似球形，表面光滑，粒徑為100-200 nm，粒徑分布均勻且分散性較好。實施例27葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的粒徑、電勢
將實施例12、13和14的FA-TMC-PTX用適量水分散，Zetasizer Nano電勢及粒度測定儀測定粒徑和Zeta電勢。粒徑測定參數(shù)=He-Ne激光(波長635 nm)，折光率和粘度分別為n=1.333和η =0.933 cp，測定溫度25。C。電勢測定參數(shù):He_Ne激光(波長635 nm)，散射角θ=14°，測定溫度25 ° C。每份樣品平行測定3次。測定結果見表I。如表I所示，水中FA-TMC-PTX形成的納米粒粒徑隨琥珀酰紫杉醇投料量的增大而先減小后增大，納米粒電勢均大于30 mV,表明納米粒較穩(wěn)定。實施例28不同pH環(huán)境下葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的粒徑 將實施例 12、13 和 14 的 FA-TMC-PTX 分別分散于 pH 1.2 HCl.pH 5.0 PBS,pH 6.8 PBS
和pH 7.4 PBS中，粒度測定儀測定粒徑。粒徑測定參數(shù)=He-Ne激光(波長635 nm)，折光率和粘度分別為n=l.333和η =0.933 cp，測定溫度25 ° C。每份樣品平行測定3次。測定結果見附圖2。由附圖2可見pH 1.2-7.4環(huán)境下FA-TMC-PTX形成的納米粒粒徑無顯著變化；FA-TMC-PTX 口服后經(jīng)過胃腸道進入血液并最終到達腫瘤組織，經(jīng)歷了不同的pH環(huán)境，而在不同PH環(huán)境下FA-TMC-PTX可保持穩(wěn)定的納米形態(tài)。實施例29葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的載藥量
精密配制I mg/mL FA-TMC-PTX (實施例12、13、14)，精密量取200 μ L，加水稀釋至2mL，測定227 nm處吸光值，計算聚合物藥物的載藥量(％)。如表I所示，F(xiàn)A-TMC-PTX的載藥量隨琥珀酰紫杉醇投料量的增大而增大。表I葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的粒徑、電勢和載藥量(n=3)
權利要求
1.種葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，其特征在于由下述過程制備獲得:殼聚糖經(jīng)季銨化修飾制得親水性殼聚糖季銨鹽，琥珀酸酐開環(huán)與紫杉醇化學連接制得疏水性琥珀酰紫杉醇，殼聚糖季銨鹽和琥珀酰紫杉醇共價連接，殼聚糖季銨鹽共價連接葉酸；其中琥珀酰紫杉醇與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.4:1，葉酸與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.3:1。
2.據(jù)權利要求1所述的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，其特征在于殼聚糖分子量范圍為10-500 kDa。
3.據(jù)權利要求1所述的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，其特征在于紫杉醇載藥量為3-25%。
4.據(jù)權利要求1-3之一所述的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物，其特征在于由該藥物自組裝形成的納米粒，粒徑為100-500 nm。
5.種如權利要求1-4之一所述的葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物的制備方法，其特征在于具體步驟如下: (1)琥珀酸酐混懸于二氯甲烷，加入紫杉醇，攪拌，加入無水吡啶，攪拌反應24-72小時；減壓蒸餾，加水洗滌，離心收集沉淀，真空干燥，得琥珀酰紫杉醇； (2)合成殼聚糖季銨鹽； (3)琥珀酰紫杉醇溶于二甲基亞砜，加入催化劑，攪拌；殼聚糖季銨鹽溶于水，加至含有琥珀酰紫杉醇的二甲基亞砜中，反應6-24小時； (4)葉酸溶于二甲基亞砜，加入催化劑，攪拌，加至(3)的反應體系中，避光反應6-24小時；純化，冷凍干燥，得葉酸修飾殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物。
6.據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(I)中琥珀酸酐與紫杉醇的質(zhì)量比為1:1-1:10，吡啶用量為反應體系的0.25-2.0%，v/v。
7.據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中反應時間為45-150min ；所得殼聚糖季銨鹽以Cl—型陰離子交換樹脂純化，冷凍干燥；其中反應45、120和150 min所得的殼聚糖季銨鹽的季銨化度分別為15%、30%和45%。
8.據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中琥珀酰紫杉醇與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.4:1，殼聚糖季銨鹽水溶液濃度為10-30 mg/mL，反應所用催化劑為1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，且琥珀酰紫杉醇與1- (3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比均為1:1-1:10。
9.據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟(4)中葉酸與殼聚糖季銨鹽的質(zhì)量比為0.05:1-0.3:1，反應所用催化劑為1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，且葉酸與1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比均為1:1-1:10。
10.利要求1-4之一所述的葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物在制備癌癥治療藥物中應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥物技術領域，具體為一種葉酸修飾的殼聚糖季銨鹽-紫杉醇聚合物藥物及其制備方法和應用。本發(fā)明的聚合物藥物由紫杉醇經(jīng)琥珀酰酯鍵共價連接至殼聚糖季銨鹽并連接腫瘤靶向配體葉酸而成。其制備方法為琥珀酸酐開環(huán)與紫杉醇化學連接合成琥珀酰紫杉醇，殼聚糖經(jīng)季銨化修飾制得殼聚糖季銨鹽，在催化劑作用下，琥珀酰紫杉醇共價連接至殼聚糖季銨鹽，并引入靶向配體葉酸；該聚合物藥物在水中可自組裝形成納米粒，其中以疏水性藥物為內(nèi)核，以殼聚糖季銨鹽為親水外殼。該聚合物藥物制備方法簡單、重復性和安全性良好，可通過口服和靜脈注射二種給藥途徑增強紫杉醇的靶向性和抑瘤功效。
文檔編號A61K31/337GK103083682SQ201310029010
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權日2013年1月25日
發(fā)明者印春華, 賀睿 申請人:復旦大學