一種重組超抗原seb突變體，其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組超抗原B型金黃色葡萄球菌腸毒素突變體，還公開(kāi)了其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明提取來(lái)源于天然金黃色葡萄球菌的腸毒素SEB基因組，得到基因組后針對(duì)與毒性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得本發(fā)明的金黃色葡萄球菌腸毒素突變體。本發(fā)明的SEB突變體活性增強(qiáng)且毒性減弱，可做為抗腫瘤免疫治療藥物或免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)藥物，具有較好的市場(chǎng)前景。
【專利說(shuō)明】一種重組超抗原SEB突變體，其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種金黃色葡萄球菌腸毒素，具體地說(shuō)涉及一種B型金黃色葡萄球菌腸毒素(SEB)，還涉及其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0002]目前從微生物的代謝產(chǎn)物中分離到30000種以上的天然產(chǎn)物，其中很大一部分都具有生物活性，它們有望被開(kāi)發(fā)成藥物。已經(jīng)面世的微生物相關(guān)藥物已過(guò)百種。超抗原(superantigen, SAg)是一種高效的免疫調(diào)節(jié)蛋白，它無(wú)需抗原遞呈細(xì)胞的加工，而直接與抗原遞呈細(xì)胞的MHC-1I抗原結(jié)合槽外側(cè)及T細(xì)胞受體V β片段結(jié)合，在APC外形成MHC-SAg-TCR三元復(fù)合體而激活T細(xì)胞，其誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖分化和細(xì)胞因子的分泌的能力是普通抗原的2000-50000倍，只需極低濃度(l-10pg/mL)即可激活T細(xì)胞庫(kù)中30% -70%的多克隆T細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫應(yīng)答。基于以上特點(diǎn)，超抗原作為一種理想的免疫調(diào)節(jié)劑有望開(kāi)發(fā)成一種新型的腫瘤免疫治療藥物。
[0003]金黃色葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是一類具有代表性的超抗原。國(guó)內(nèi)早在上世紀(jì)九十年代就將高聚生(HAS)用于臨床腫瘤治療，據(jù)報(bào)道其起效成分主要為腸毒素C2(SEC2)。高聚生臨床應(yīng)用于癌癥放、化療及手術(shù)治療后的聯(lián)合用藥，在提高癌癥患者的細(xì)胞免疫功能，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，保護(hù)化療患者的骨髓造血功能等方面都有明顯的作用，常見(jiàn)的副反應(yīng)為發(fā)熱和局部腫痛。超抗原SEB作為金葡菌腸毒素家族中的一員，其刺激T細(xì)胞能力遠(yuǎn)強(qiáng)于SEC2，國(guó)內(nèi)外對(duì)其在抗腫瘤方面的研究還比較少。我們實(shí)驗(yàn)室首次對(duì)SEB進(jìn)行無(wú)標(biāo) 簽表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行SEB分子改造奠定了基礎(chǔ)。
[0004]由于SEs屬于細(xì)菌外毒素，在一定濃度下會(huì)引起食物中毒，還有可能導(dǎo)致發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、中毒性休克等癥狀。近年來(lái)有研究顯示超抗原在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均能產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，高劑量和重復(fù)給藥會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能，從而導(dǎo)致抗腫瘤活性降低這在某種程度上限制了其在臨床抗腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。這種腸毒素活性和免疫抑制效應(yīng)影響了SEs作為超抗原在抗腫瘤免疫治療中的使用。然而，其毒性和超抗原活性間并無(wú)必然聯(lián)系(T.Harris, D.Grossman, J.KappIer, P.Marrack, R.Rich, M.Betley, Lack of completecorrelation between emetic and T-cell—stimulatory activities of staphylococcalenterotoxins.1nfection and immunity61 (1993) 3175.)，國(guó)外學(xué)者在研究 SEB 中毒救治疫苗時(shí)發(fā)現(xiàn)將組氨酸位點(diǎn)突變?yōu)槔野彼峥梢越档推涠拘?，但保持刺激淋巴?xì)胞增殖的能力(S.Korolev,D.Pinelis,V.Savransky,J.Komisar,P.Vogel,K.Fegeding,Toxicity of thestaphylococcal enterotoxin B mutants with histidine-to-tyrosine substitutions.Toxicology 187 (2003) 229-238.)。但目前尚未有將超抗原SEB進(jìn)行多點(diǎn)突變，而降低毒副作用，增強(qiáng)抗腫瘤活性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0005]為了進(jìn)一步提高SEB的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)、增強(qiáng)抗腫瘤活性并降低毒副作用，達(dá)到為腫瘤生物治療提供安全有效的候選藥物的目的，本發(fā)明提供一種重組超抗原SEB突變體。
[0006]本發(fā)明的重組超抗原SEB突變體，是在SEB的第32位組氨酸及173位的酪氨酸分別突變?yōu)楣劝滨０?Glutamine，Q)和谷氨酸(Glutamicacid，E)，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，其編碼核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0007]本發(fā)明還公開(kāi)了包含上述重組超抗原SEB突變體編碼基因的表達(dá)載體，該表達(dá)載體可以是原核表達(dá)載體，也可以是真核表達(dá)載體，在原核表達(dá)載體中，可以選擇包括pET-32a的多種表達(dá)載體。
[0008]本發(fā)明還公開(kāi)了上述包含上述表達(dá)載體的表達(dá)菌株，根據(jù)上述原核或真核表達(dá)載體可以選擇多種表達(dá)菌株。對(duì)應(yīng)原核表達(dá)載體可以選擇包括大腸桿菌的多種基因工程菌株，在大腸桿菌中可以選擇包括E.coli BL21(DE3)的多種基因工程表達(dá)菌株。
[0009]本發(fā)明還提供了上述重組超抗原SEB突變體的制備方法:
[0010]提取來(lái)源于天然金黃色葡萄球菌的基因組，擴(kuò)增得到腸毒素SEB基因，針對(duì)與毒性相關(guān)的32位組氨酸位點(diǎn)及173位的酪氨酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別突變?yōu)橹行园被峁劝滨０?Glutamine, Q)和酸性氨基酸谷氨酸(Glutamicacid,E)。突變體的獲得可采用本領(lǐng)域已知的多種方法實(shí)現(xiàn)上述目的。例如可以采用重疊PCR的方法，以重組質(zhì)粒pGEM-T-SEB為模板，采用引物對(duì)1、2擴(kuò)增得到SEB-H32Q，以引物對(duì)3、4擴(kuò)增獲得SEB-H32Q/K173E，其核苷酸序列如序列表中序列I所示。 [0011]得到突變基因SEB(H32Q/K173E)后克隆至克隆載體，可以選擇包括pGEM_T在內(nèi)的多種克隆載體，經(jīng)酶切后亞克隆至表達(dá)載體中，可以選擇包括pET-32a在內(nèi)的多種表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)，可以通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)等多種表達(dá)方式進(jìn)行表達(dá)，獲得可溶性的超抗原突變蛋白。獲得的超抗原突變體可以通過(guò)多種方式進(jìn)行純化，例如經(jīng)羧甲基纖維素鈉弱陽(yáng)離子柱(CM柱)分離純化，獲得超抗原活性增強(qiáng)的超抗原突變蛋白純品。
[0012]本發(fā)明還公開(kāi)了重組超抗原SEB突變體的用途。本發(fā)明進(jìn)行了以下試驗(yàn)。在細(xì)胞毒活性測(cè)試中，本發(fā)明的突變體蛋白在極低濃度范圍內(nèi)均能起到良好的殺傷腫瘤作用，對(duì)正常細(xì)胞殺傷較弱。在刺激人外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)增殖試驗(yàn)中，本發(fā)明的突變體在較低濃度下與野生型SEB(WtSEB)相比具有顯著性差異。在體內(nèi)抗腫瘤作用篩選試驗(yàn)中，SEB(H32Q/K173E)突變體表現(xiàn)現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤作用，與同劑量的wtSEB對(duì)照組相比有顯著差異。在兔發(fā)熱試驗(yàn)中，本發(fā)明的突變體引起新西蘭兔發(fā)熱的能力較野生型SEB下降明顯。
[0013]通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的重組超抗原SEB突變體活性增強(qiáng)且毒性減弱，可以用于制備臨床抗腫瘤免疫治療藥物和免疫功能調(diào)節(jié)藥物，具有良好的臨床應(yīng)用前景及重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0014]本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0015]1.本發(fā)明利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了超抗原活性和抗腫瘤效應(yīng)顯著增強(qiáng)且毒性降低的SEB突變蛋白，無(wú)標(biāo)簽，可成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。本發(fā)明可提供直接用于生產(chǎn)該超抗原突變蛋白的基因工程菌株。
[0016]2.本發(fā)明實(shí)現(xiàn)SEB突變體基因的異源表達(dá)，并提供了制備該超抗原突變蛋白的方法。操作簡(jiǎn)單易行，所得蛋白具有產(chǎn)量高，純度高，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的特點(diǎn)。此種高效表達(dá)純化的方法更適合醫(yī)藥工業(yè)化生產(chǎn)的需要。
[0017]3.本發(fā)明中的SEB突變體蛋白通過(guò)基因定點(diǎn)突變技術(shù)獲得，其在對(duì)SEB蛋白中與毒性相關(guān)的32位堿性氨基酸組氨酸進(jìn)行替換，從而使32位的組氨酸(Histidine，H)和173位的賴氨酸(Lysine，K)變?yōu)橹行园被峁劝滨０?Glutamine，Q)和酸性氨基酸谷氨酸(GlutamicacicbE)，獲得了活性提高、毒性減弱的超抗原，進(jìn)而得到適合臨床應(yīng)用的生物技術(shù)制劑。
[0018]4.本發(fā)明構(gòu)建并獲得的重組SEB突變體蛋白，提高了超抗原抗腫瘤活性并降低其致熱毒性，是作為腫瘤免疫治療和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑更為合適的超抗原候選藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0019]圖1SEB(H32Q/K173E)突變體蛋白重組表達(dá)載體的構(gòu)建。圖1A為重組克隆載體的BamH I和Nde I雙酶切結(jié)果。M為DNA marker ;1，2均為目的酶切產(chǎn)物。圖1B為酶切鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒(pET-32a)。其中M為DNA marker，1_6分別是突變體的重組質(zhì)粒的酶切鑒定。(酶切結(jié)果顯示，從pET32-(a)質(zhì)粒上切下了大小約為720bp的DNA片段，表明我們的目的片段成功插入pET32-(a)質(zhì)粒上。后經(jīng)生工生物公司測(cè)序驗(yàn)證確為突變序列。)
[0020]圖2SEB(H32Q/K173E)突變體蛋白 SDS-PAGE 及 Western Blot 鑒定。圖 2A 為本發(fā)明SEB(H32Q/K173E)突變體蛋白的表達(dá)純化電泳圖譜，M為低分子量蛋白Marker，I代表wtSEB，2 代表 SEB (H32Q/K173E)。圖 2B 為 Western Blot 鑒定結(jié)果，I 代表 wtSEB 陽(yáng)性對(duì)照，2代表SEB (H32Q/K173E )，3代表BSA陰性對(duì)照。
[0021]圖3超抗原體外殺傷試驗(yàn)。PBMC存在下，SEB (H32Q/K173E)突變體、wtSEB對(duì)正常人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC，人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，宮頸癌細(xì)胞系Hela，胃癌細(xì)胞系BGC-823生長(zhǎng)呈不同程度的抑制。(其中縱坐標(biāo)為抑瘤率，橫坐標(biāo)為各蛋白的劑量梯度)。各蛋白對(duì)細(xì)胞的殺傷作用IC50值詳見(jiàn)表1。
[0022]圖4不同濃度超抗原刺激下淋巴細(xì)胞增殖情況(其中縱坐標(biāo)為表示增殖的熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為各突變體蛋白的劑量梯度)。在本試驗(yàn)條件下，SEB(H32Q/K173E)突變體
0.01ng/ml-1000ng/ml均能刺激淋巴細(xì)胞顯著增殖(P < 0.01)，且極低劑量下(0.01ng/ml-0.lng/ml)刺激增殖能力優(yōu)于wtSEB。
[0023]圖5體內(nèi)抗腫瘤作用篩選試驗(yàn)圖示。圖5A為間隔3天給藥抑瘤效果圖。圖5B為連續(xù)給藥抑瘤效果圖。(不同給藥途經(jīng)下SEB(H32Q/K173E)突變體均顯示出良好的抗腫瘤效果，且較低劑量抑瘤作用明顯。)
[0024]圖6本發(fā)明中腸毒素SEB突變蛋白的新西蘭兔致熱活性檢測(cè)結(jié)果(其中縱坐標(biāo)為表示溫度上升值，橫坐標(biāo)為各突變體蛋白的作用時(shí)間)。在靜脈給予5 μ g/kg超抗原時(shí)，SEB(H32Q/K173E)突變體組新西蘭兔體溫升高明顯弱于wtSEB對(duì)照組。
【具體實(shí)施方式】:
[0025]實(shí)施例一重組超抗原SEB突變體的制備
[0026]一、材料:
[0027]1.1主要儀器
[0028]PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Whatman Biometra公司)，電熱恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)，AKTA FPLC蛋白純化儀(美國(guó)GE公司)，聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(美國(guó)BIORAD公司)
[0029]1.2菌株及主要試劑
[0030]天然金黃色葡萄球菌腸毒素SEB產(chǎn)毒株ATCC (14458)，購(gòu)自ATCC (美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)；pET-32 (a+)表達(dá)載體,購(gòu)自Novagen公司;大腸桿菌DH5 a、BL21 (DE3)為invitrogen公司產(chǎn)品；基因克隆載體pGEM-T,購(gòu)自Promega公司；Nde1、BamHI,購(gòu)自TaKaRaBiotechnology 公司；T4DNA 連接酶，購(gòu)自 New England BioLabs 公司；IPTG,購(gòu)自 AMRESC0公司；質(zhì)粒提取試劑盒，廣州東盛公司；基因組DNA提取試劑盒，賽百盛公司。
[0031]二、方法結(jié)果:
[0032]1.超抗原突變蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建:
[0033]根據(jù)GeneBank中的SEB Gen(AF410775))針對(duì)與毒性相關(guān)的32位組氨酸位點(diǎn)及173位的酪氨酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，分別突變?yōu)橹行园被峁劝滨０?Glutamine，Q)和酸性氨基酸谷氨酸(Glutamicacid，E)。具體為從天然金黃色葡萄球菌腸毒素SEB產(chǎn)毒株ATCC(14458)中提取基因組，用引物對(duì)I擴(kuò)增得到SEB基因，克隆至基因克隆載體pGEM_T，構(gòu)建質(zhì)粒pGEM-T-SEB ;用重疊PCR的方法，以重組質(zhì)粒pGEM_T_SEB為模板，采用引物對(duì)2、3擴(kuò)增得到SEB-H32Q，以引物對(duì)4、5擴(kuò)增獲得SEB-H32Q/K173E，其核苷酸序列如序列表中序列I所示。 [0034]引物對(duì)I 為，SElB-F:5，_ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc_3，，見(jiàn)序列表中序列 3 和 SEB-R:5’-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc_3’,見(jiàn)序列表中序列6 ；
[0035]引物對(duì)2 為，SEB-F: 5，-ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc-3，，見(jiàn)序列表中序列 3 和 32Q-R:5’ -gatttaacgtttattgctgatacctgattatc-3’，見(jiàn)序列表中序列 4 ；
[0036]引物對(duì)3 為，32Q-F:5’ -gataatcaggtatcagcaataaacgttaaatc-3’，見(jiàn)序列表中序列 5 和 SEB-R:5，-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc-3，，見(jiàn)序列表中序列 6
[0037]引物對(duì)4 為，SElB-F:5，_ccatatggagagtcaaccagatcctaaaccagatgagttgc_3，，見(jiàn)序列表中序列 3 和 173E-R:5’ -gttaaattcatagagttccttatttttcacc-3’，見(jiàn)序列表中序列 7
[0038]引物對(duì)5 為，173E-F:5’-ggtgaaaaataaggaactctatgaatttaac-3’見(jiàn)序列表中序列8 和 SEB-R:5，-gcggatccctttttctttgtcgtaagataaacttcaatcttc-3，，見(jiàn)序列表中序列 6 ；
[0039]取接種于LB培養(yǎng)基的天然金黃色葡萄球菌腸毒素SEB產(chǎn)毒株，提取基因組DNA，作為PCR的模板，以引物對(duì)I擴(kuò)增出腸毒素SEB基因。PCR反應(yīng)條件如下:

IOxPCR Buffer (含 MgCh)2.5μ1
I Ommol dNTPsI μL
DNA模板ΙμL
[0040]20pmol 混合引物(Pc+Pb)Ι.ΟμΙ
Taq DNA 聚合酶2.5U
ddH20將體積補(bǔ)至25μ1
[0041]PCR 反應(yīng)參數(shù)為 96°C 5min、94°C 60s、72°C 60s,50°C 60s,25 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin。采用1.5%瓊脂糖電泳觀察所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。
[0042]將PCR產(chǎn)物克隆至基因克隆載體pGEM-T，構(gòu)建出克隆質(zhì)粒pGEM_T_SEB，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。
[0043]取接種于LB培養(yǎng)基的含pGEM-T-SEB質(zhì)粒的DH5 α菌體，提取質(zhì)粒DNA，作為PCR的模板。PCR反應(yīng)條件如下:
【權(quán)利要求】
1.一種重組超抗原SEB突變體，其特征在于在SEB的第32位組氨酸及173位的酪氨酸分別突變?yōu)楣劝滨０泛凸劝彼?，其氨基酸序列如序列表中序?所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組超抗原SEB突變體，其特征在于其編碼核苷酸序列如序列表中序列I所示。
3.包含權(quán)利要求1或2所述突變體編碼基因的表達(dá)載體，其特征為原核表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求3所述表達(dá)載體，為pET-32a-mSEB。
5.包含權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的基因工程表達(dá)菌株，其特征為大腸桿菌。
6.權(quán)利要求5所述表達(dá)菌株，為大腸桿菌BL21(DE3)。
7.權(quán)利要求1或2所述重組超抗原SEB突變體的制備方法，包括如下步驟: (1)提取金葡菌基因組，并克隆得到wtSEB基因；； (2)采用重疊PCR的方法，分別擴(kuò)增獲得32位和173位兩個(gè)突變位點(diǎn)的左右兩側(cè)的重疊PCR產(chǎn)物； (3)以獲得的重疊PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得序列表中序列I所示的SEB突變基因; (4)將得到的SEB突變基因克隆至原核表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其中原核表達(dá)載體為pET-32a，大腸桿菌為BL21(DE3)。
9.權(quán)利要求1或2所述重組超抗原SEB突變體在制備腫瘤免疫治療藥物中的用途。
10.權(quán)利要求1或2所述重組超抗原SEB突變體在制備免疫功能調(diào)節(jié)劑中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK103965302SQ201310031999
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月29日
【發(fā)明者】姜永強(qiáng), 江華, 鄭玉玲, 谷麗維, 鄭欣, 王君, 王燕子 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所