專利名稱：一種tat-lbd-nep1-40融合蛋白、構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域，具體涉及將LBD引入TAT-NEP1-40融合制備TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白。同時，本發(fā)明還涉及TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白穿過血腦屏障并富集于缺血區(qū)，用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的治療。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷、中風(fēng)、腦出血、脊髓損傷等具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)。如何降低神經(jīng)功能受損程度和如何更好地使受損神經(jīng)元功能得到更好地改善，提高患者的生存質(zhì)量，對患者及其家庭、社會都有重要意義，是一個世界性的難題。目前，對于CNS損傷引起的神經(jīng)功能障礙尚無有效治療藥物。因 此，尋找新型有效的治療腦CNS損傷藥物是研究熱點(diǎn)。以往普遍認(rèn)為成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)損傷引起的神經(jīng)功能障礙難以恢復(fù)的主要原因為神經(jīng)元不能再生。近二十年來的研究已有突破性進(jìn)展，目前認(rèn)為CNS再生困難的原因除促進(jìn)再生的營養(yǎng)因子不足外，另一重要的原因是中樞的抑制性再生環(huán)境。近幾年來，主要抑制受損神經(jīng)再生的基因一 Nogo及其受體(Nogoreceptor, NgR)的發(fā)現(xiàn)，為CNS損傷的研究掀開了新的一頁，被譽(yù)為是“探索中樞神經(jīng)損傷修復(fù)漫長道路中的一個里程碑”。新近Neuron發(fā)表的研究,應(yīng)用基因敲除(knockout)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)敲除Nogo-A和NgR改善脊髓損傷后再生和可塑反應(yīng),應(yīng)用NgR拮抗劑(NgRecto)治療，促進(jìn)軸突再生和脊髓損傷的功能恢復(fù)。同樣應(yīng)用Nogo-A抗體(IN-1，7B12)和NgR拮抗劑(NgRecto)治療，顯著改善MACO導(dǎo)致的行為學(xué)結(jié)果，促進(jìn)軸突可塑性。為此，Lee等在《Nature Review Drug Discovery》撰寫“Targeting the Nogo receptor to treat centralnervous system injuries” 的論文，提出 “NgR as a drug discovery target”,認(rèn)為以調(diào)控NgR為治療目標(biāo)，可大大促進(jìn)CNS損傷后神經(jīng)元的功能恢復(fù)，逆轉(zhuǎn)其災(zāi)難性的后果。目前NgR成為CNS損傷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和關(guān)注焦點(diǎn)，認(rèn)為阻斷它可影響腦缺血的發(fā)展和結(jié)果，促進(jìn)和增強(qiáng)神經(jīng)功能恢復(fù)。Nogo-66是Nogo-A分子胞外的袢狀結(jié)構(gòu)，與NgR結(jié)合從而觸發(fā)下游信號通路阻斷神經(jīng)的再生。NEPl_40(Nogo extracellular peptide residuesl-40)是 Nogo-66 氨基端40個殘基組成的多肽，保留有Nogo-66與NgR結(jié)合的能力，但不觸發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。NEP1-40作為NgR拮抗劑已經(jīng)應(yīng)用于脊髓損傷動物模型，可以促進(jìn)皮質(zhì)脊髓軸突的生長和5-羥色胺能神經(jīng)纖維的出芽，并上調(diào)軸突生長蛋白SPRRlA以及突觸的形成，可以顯著促進(jìn)實(shí)驗動物運(yùn)動功能的恢復(fù)。NEP1-40作為NgR拮抗劑，具有高選擇性和有效性使其有望成為治療脊髓損傷、腦外傷、中風(fēng)和慢性進(jìn)行性多發(fā)性硬化等軸突再生障礙性疾病的新藥。然而，目前研究中所使用的NEP1-40都是經(jīng)化學(xué)合成，其成本較高，且由于血腦屏障(BBB)、血脊屏障、細(xì)胞膜等的存在，大于6個氨基酸的多肽一般不能穿過這些屏障，而達(dá)不到有效的藥物治療濃度，目前主要是通過顯微定位注射或植入微型泵等手術(shù)的形式給藥。顯微注射存在誘發(fā)腦內(nèi)出血等潛在危險，并且只能維持短時期；植入微型泵較好，但存在難以通過血脊屏障、血腦屏障的問題，使NEP1-40的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用受到了極大的限制。目前，已通過應(yīng)用TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)研制出的新型蛋白TAT-NEP1-40融合蛋白可順利通過血腦屏障，減小腦缺血損傷。但是，TAT蛋白靶向性較差，進(jìn)入腦內(nèi)后廣泛分布，不能集中作用于缺血損傷部位。因此，如何使TAT-NEP1-40靶向作用于CNS損傷部位成為現(xiàn)今研究的重點(diǎn)。
層粘連蛋白Laminin是CNS重要的胞外基質(zhì)。在缺血性腦損傷時，Iaminin在缺血區(qū)域內(nèi)高表達(dá)(Liebkind RTE.，et al.，2007)，因此，其可成為治療蛋白聚集于缺血損傷區(qū)域的一個潛結(jié)合靶向區(qū)域，明顯增強(qiáng)藥物濃度和治療效率，使治療蛋白更有效的發(fā)揮靶向治療損傷神經(jīng)元的作用。集聚蛋白(Agrin)是神經(jīng)肌肉接頭突觸后分化的一個關(guān)鍵分子，層粘連蛋白和集聚蛋白的氨基端(N-terminal domain of agrin,NtA)有很強(qiáng)的親和能力，NtA可以作為與層粘連蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。有研究顯示:通過構(gòu)建含有神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF和層粘連蛋白結(jié)合區(qū)域NtA的融合蛋白，可以靶向聚集于腦缺血損傷區(qū)域，并且高效、持續(xù)的發(fā)揮BDNF的治療作用，而對正常組織和細(xì)胞沒有任何副作用(Han, Q.，et al.，2011)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于CNS損傷治療的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白，它由人類免疫缺陷病毒的TAT結(jié)構(gòu)域與LBD結(jié)構(gòu)域和治療功能片段NEP1-40融合制成。本發(fā)明的另一個目的是提供一種構(gòu)建CNS損傷治療的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白的方法。本發(fā)明的再一個目的是TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白用于制備哺乳動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物的應(yīng)用。該藥物能夠用于在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷、脊髓損傷的治療。為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)任務(wù)，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白，其特征在于:該融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下:cDNA 序列:CTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC。蛋白序列:-LPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSCKVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTCDTRIFFVNPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNS。進(jìn)一步地，TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白是將TAT、LBD與NEP1-40融合制得，具體按照下述步驟構(gòu)建:步驟一:從Genebank獲取LBD基因和NEP1-40序列，然后將LBD基因和NEP1-40序列之間通過GGCGGTGGCGGITCA序列連接，合成LBD-NEP1-40基因序列，且使得LBD-NEP1-40的基因序列兩端分別含有Nco I和Xho I序列，整個LBD-NEP1-40的基因序列為:ACCATGGCC-CT GCCGGGCGCAT CGGGCACCT G TCCGGMCGCGCAC TGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC-CTCGAG ;其中基因下劃線為Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)；步驟二:將合成得到的LBD-NEP1-40的基因序列裝載到pUC57載體中，得到PUC57-LBD-NEP1-40 載體；步驟三；選用含限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I的人類免疫缺陷病毒的TAT序列的PTAT-HA作為表達(dá)載體；步驟四:用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I酶切pTAT-HA和pUC57-LBD-NEPl-40載體，回收酶切產(chǎn)物，其中PTAT的酶切產(chǎn)物為線性pTAT載體，pUC57-LBD-NEPl-40的酶切切產(chǎn)物為LBD-NEP1-40基因片段；步驟五:將步驟四得到的兩種酶切產(chǎn)物即線性pTAT載體和TAT-LBD-NEP1-40基因片段用T4連接酶連接通過克隆篩選得到重組質(zhì)粒pTAT-LBD-NEPl-40表達(dá)載體；步驟六:將重組質(zhì)粒pTAT-LBD-NEPl-40表達(dá)載體經(jīng)過DNA測序分析正確后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，挑選5 8個陽性的菌落克隆在氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，采用IPTG預(yù)誘導(dǎo)表達(dá)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白；步驟七:將誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌蛋白依次采用SDS-PAGE、考馬斯亮蘭R250染色，確定誘導(dǎo)表達(dá)的條件和陽性菌落克隆，然后在16 22°C，0.2mMIPTG條件下大量表達(dá)TAT-LBD-NEP1-40 融合蛋白；步驟八:將誘導(dǎo)表達(dá)的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的細(xì)菌經(jīng)過超聲破碎菌體，釋放出目的蛋白后，經(jīng)過Ni離子整合的親和層析柱純化，純化后的蛋白經(jīng)過超濾濃縮為2mg/ml，存放在-80 °C的冰箱中冷藏。本發(fā)明的特點(diǎn)是:將來源于人類免疫缺陷病毒HIV-1TAT的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain, PTD)、特異結(jié)合缺血區(qū)的 LBD 與 NEP1-40 融合，構(gòu)建pTAT-LBD-NEPl-40重組質(zhì)粒，經(jīng)表達(dá)、純化得到具有生物活性的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白。本發(fā)明所述TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，可用于包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷、脊髓損傷等多種CNS損傷的治療。所述TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白保留了 NEP1-40對NgR的選擇性拮抗活性，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、透過BBB的優(yōu)點(diǎn)，克服了 NEP1-40的局限性，而LBD使NEP1-40更具有靶向性，用于腦損傷治療，可降低藥物對其他組織的副作用，使治療蛋白靶向聚集于損傷區(qū)域。TAT融合蛋白系統(tǒng)是一種很好的蛋白傳送工具，打破了蛋白質(zhì)通常只能通過細(xì)胞表面受體和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將所攜帶的生物信息傳遞到細(xì)胞內(nèi)的規(guī)律，能有效解決大分子蛋白質(zhì)不能穿透血腦屏障(BBB)的問題，在臨床應(yīng)用大分子藥物治療腦血管疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明利用TAT介導(dǎo)蛋白質(zhì)的方法，將TAT-PTD的編碼基因與外源蛋白LBD、NEP1-40基因連接，表達(dá)融合蛋白，所得到的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白不僅保留了 TAT原有的穿透力，而且不影響外源蛋白的活力。為了提高有效的藥物濃度，同時降低藥物對其他組織的副作用，因此治療蛋白如何靶向聚集于損傷區(qū)域是需要解決一個關(guān)鍵問題。在腦缺血性腦損傷過程中，層粘連蛋白(Laminin, LN)高表達(dá)于腦缺血區(qū)域,聚集蛋白agrin的N端序列可以與LN特異性結(jié)合,這種可與LN特性結(jié)合的序列被命名為laminin-binding domain (LBD)。通過構(gòu)建將LBD與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)相結(jié)合的融合蛋白，發(fā)揮靶向治療腦缺血損傷的作用。本發(fā)明應(yīng)用C57小鼠、采用免疫熒光組織化學(xué)分析和Westen Blot的方法證實(shí)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，結(jié)果顯示TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白可穿過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)并降低腦梗死面積，表明TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，對C57小鼠具有腦保護(hù)作用。同時，本發(fā)明將純化后的TAT-LBD-NEP1-40通過腹腔注射的方式給于全腦缺血模型后的C57小鼠，檢測TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白對腦缺血后損傷軸突的變化和腦神經(jīng)功能是否有改善作用。免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示，融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40、TAT- P -Gal在大鼠腦組織細(xì)胞均呈陽性反應(yīng)，而注射No-TAT- P -Gal融合蛋白的C57小鼠腦組織均為陰性反應(yīng)，說明TAT可介導(dǎo)蛋白質(zhì)通過血腦屏障轉(zhuǎn)導(dǎo)入腦組織，而且TAT-LBD-NEP1-40可顯著改善局灶腦缺血引起的神經(jīng)功能障礙、減少梗死容積和促進(jìn)損傷神經(jīng)元突觸再生，表明TAT-LBD-NEP 1-40具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)作用可進(jìn)入腦組織，對腦缺血損傷具有保護(hù)作用。本發(fā)明的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白保留了 NEP1-40對NgR的選擇性拮抗活性，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、透過BBB的優(yōu)點(diǎn)，克服了 NEP1-40的局限性，而LBD使NEP1-40更具有靶向性，用于腦損傷治療，可降低藥物對其他組織的副作用，使治療蛋白靶向聚集于損傷區(qū)域，可用于包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷、脊髓損傷等多種CNS損傷的治療。本發(fā)明可大量制備、成本低、活性高，用于包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷以及脊髓損傷等多種CNS損傷的治療，促進(jìn)神經(jīng)組織的再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物。


圖1.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白穿過血腦屏障轉(zhuǎn)導(dǎo)入腦組織內(nèi)表達(dá)示意圖。圖為 C57BL/6J 小鼠分別腹腔注射 40nmol 的 TAT-P -Gal、TAT-LBD-NEP 1-40 和No-TAT-LBD-NEP1-40 后 lh, 4h 和 12h，C57BL/6J 小鼠的大腦取出行 Westernblot 和免疫熒光染色分析。圖1A為Western blot分析結(jié)果；圖1B為免疫熒光染色分析結(jié)果，箭頭表示免疫熒光陽性細(xì)胞，Scale bars=100umo圖2.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白對腦梗死容積的影響。圖2A為各組代表性的TTC染色，白色為腦梗死區(qū)域；圖2 B為4組腦梗死容積(mm3)。圖3.TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白促進(jìn)軸突生長示意圖。圖為C57BL/6J小鼠腹腔注射40nmol的TAT-LBD-NEP 1-40和PBS后28d，C57BL/6J小鼠的大腦取出行免疫熒光染色分析。圖3A為海馬區(qū)免疫熒光染色分析結(jié)果；圖38為皮層區(qū)免疫熒光染色分析結(jié)果，箭頭表示生長出的軸突。圖4.TAT-LBD-NEP 1-40對C57BL/6J小鼠神經(jīng)功能的改善作用。圖為分別應(yīng)用水迷宮和高架十字迷宮評估小鼠神經(jīng)功能的改善作用數(shù)據(jù)圖。圖4A為水迷宮；圖4B高架十
字迷宮。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的具體內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白藥效試驗為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明構(gòu)建的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白進(jìn)行如下藥效研究，試驗情況如下:需要說明的是下列藥效試驗中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆:實(shí)驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件；又如David等人，細(xì)胞實(shí)驗指南(New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press, 1998)中所述的條件。

(一)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)功能鑒定1、TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)的鑒定 9 只 SD 大鼠隨機(jī)分為 3 組:TAT-LBD-NEP 1-40 組、TAT- ^ -Gal 組和 No-TAT- ^ -Gal組(n=3)，每組大鼠分別腹腔注射IOnmol的TAT-LBD-NEP1_40、TAT-P -Gal (陽性對照)和No-TAT-^-Gal (陰性對照)融合蛋 白，分別于lh、4h、12h后，用2%戊巴比妥鈉深麻醉，迅速開胸經(jīng)左心室至升主動脈插管， 先以生理鹽水洗去血液，隨后用冷的(4° C)含4%多聚甲醛的0.lmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)先快后慢灌流固定2h，然后取腦置于20%蔗糖中(4° C)直至組織沉底。冰凍切片機(jī)切制連續(xù)冠狀切片，片厚14 iim，置于-20° C存放。切片加入封閉液室溫封閉lh，加入抗6XHis鼠源單抗(I: 2000)，放入4° C冰箱過夜。取出后PBS洗滌3次，每次5min，加入FITC標(biāo)記的驢抗鼠IgG(l: 400)，避光，室溫反應(yīng)2h。再用PBS適度洗滌，封片后在BX60熒光顯微鏡下觀察并采圖。2、結(jié)果TAT-LBD-NEP 1-40穿過血腦屏障在腦內(nèi)表達(dá)。免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40、TAT-P -Gal在大鼠腦組織細(xì)胞均呈陽性反應(yīng)，而注射No-TAT-P-Gal融合蛋白的大鼠腦組織均為陰性反應(yīng)，說明TAT可介導(dǎo)蛋白質(zhì)通過血腦屏障，參見圖1。(二)、TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白對腦梗死容積的影響1、動物分組32只雄性SD大鼠，體質(zhì)量(300-350) g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，隨機(jī)分為 4 組:對照組(Control)、TAT-LBD-NEP 1-40 組、No-TAT-LBD-NEPl-40 組和 TAT-P -Gal組(n=8)。大鼠局灶腦缺血模型方法如下，各組分別于栓塞120min后再灌注時腹腔注射PBS (pH7.3) 4ml、TAT-LBD-NEP 1-40, No-TAT-LBD-NEPl-40 和 TAT- ^ -Gal (均為 40 u mo I 溶解于 PBS4ml)。2、局灶腦缺血模型制作大鼠術(shù)前禁食12h，不禁水。大鼠用4%異氟醚誘導(dǎo)麻醉，2%異氟醚吸入維持麻醉深度，保留自主呼吸。術(shù)中體溫由肛溫探頭連接多功能監(jiān)測儀監(jiān)測，并用烤燈維持在37 37.5° C。參照我們以前的報道，大腦MCAO模型采用右側(cè)頸內(nèi)動脈尼龍線線栓法，即動物麻醉后取頸正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈及頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸總動脈、頸外動脈，于頸總動脈分叉下方剪一切口，將一預(yù)先用乙醇燈燒成圓頭的尼龍線(3-0，Ethicon,日本)置入頸內(nèi)動脈17.5_，直到有輕微阻力感為止。栓塞120min后抽出尼龍線，恢復(fù)再灌注，縫合皮膚。大鼠麻醉蘇醒后放回鼠籠，自由飲食。3、腦梗死容積測量再灌注24h后,動物用2%戍巴比妥鈉深麻醉后處死,迅速取出鼠腦,置于冰鹽水中l(wèi)Omin，取冠狀面均勻切成2mm厚腦片，迅速放入2%TTC溶液(37°C )中染色30min，然后用4%多聚甲醛緩沖液固定。24h后用數(shù)碼相機(jī)(Kodak，DC240, USA)拍照，輸入計算機(jī)，用圖像處理軟件(Adobe，Photoshop .0)計算梗死面積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2mm)為總的梗死容積。4、實(shí)驗結(jié)果腦梗死容積圖2A為各組一只大鼠缺血再灌注24h后的腦切片(2mmX6)，粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū)。缺血再灌注24h后腦梗死容積，對照組為(309.5±36.4)mm3、TAT-LBD-NEP 1-40 組為(107.6±23.1)mm3、No-TAT-LBD-NEPl-40 組為(296.2 ±72.5)mm3、TAT- ^ -Gal 組為(269.3 ±68.0)mm3。TAT-LBD-NEP 1-40 組梗死容積明顯小于對照組、No-TAT-LBD-NEPl-40 組和 TAT- ^ -Gal 組(P=0.002 和 0.004)，而 Control 組、No-TAT-LBD-NEPl-40 組和 TAT-P -Gal 組比較無差別(P=0.903)，見圖 2B。

(三)、TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白促進(jìn)軸突生長1、動物分組12只雄性C57/BL6小鼠，體重2(T25g由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，隨機(jī)分為2組:對照組(Contix)I)、TAT-LBD-NEPl-40組(n=6)。全腦缺血模型如下，各組分別于栓塞20min后再灌注時腹腔注射PBS (pH7.3)0.5ml、TAT-LBD-NEPl_40(以250mg/kg的劑量溶于 0.5mlPBS 中)2、全腦缺血模型制作術(shù)前禁食6h，禁水2h。2%異氟醚吸入維持麻醉深度，保留自主呼吸。術(shù)中檢測腦血流，模型成功標(biāo)準(zhǔn)為夾閉5min的腦血流下降70%。取頸部正中切口，仔細(xì)分離雙側(cè)頸總動脈(CCA)，夾閉20min后恢復(fù)再灌注，縫合皮膚。小鼠麻醉蘇醒后放回鼠籠，自由飲食。3、組織切片制備小鼠腦缺血再灌注后連續(xù)28d給藥，在第28天深麻醉下開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管剪開左心耳，用生理鹽水20mL左右快速沖洗，隨后用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(4° C，pH7.4)灌注約30mL固定，后固定2h后小心取出大腦，浸入20%蔗糖溶液，放置于4° C冰箱中至腦沉于底部。用冷凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚IOii m，-20°C保存切片。4、免疫熒光鑒定軸突生長切片加入封閉液室溫封閉lh，加入抗MAP鼠源單抗(I: 400)，放入4° C冰箱過夜。取出后PBS洗滌3次，每次5min，加入兔抗鼠IgG(l: 1000)和Neurotrace (1:2000)，避光，室溫反應(yīng)2h。再用PBS適度洗滌，封片后在BX60熒光顯微鏡下觀察并采圖。
5、實(shí)驗結(jié)果免疫熒光組織化學(xué)結(jié)果顯示:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40組軸突明顯較PBS組增多。圖3A是海馬區(qū)域，圖3B是皮層區(qū)域。(四)、TAT-LBD-NEP1-40對小鼠神經(jīng)功能的改善作用。1、動物分組16只雄性C57/BL6小鼠，體重2(T25g由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供，隨機(jī)分為2組:對照組(Contix)I)、TAT-LBD-NEPl-40組(n=8)。全腦缺血模型如下，各組分別于栓塞20min后再灌注時腹腔注射PBS (pH7.3)0.5ml、TAT-LBD-NEPl_40(以250mg/kg的劑量溶于0.5mlPBS中)全腦缺血模型制作方法同前。2、行為學(xué)實(shí)驗方法(I)水迷宮獲得性訓(xùn)練(Acquisition phase):將水池分為4個象限,平臺置于其中一個象限區(qū)的中央。將小鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個起始位置之一。記錄動物找到水下平臺的時間(S)。在前幾次訓(xùn)練中，如果這個時間超過60s，則引導(dǎo)動物到平臺，讓動物在平臺上停留15s。(2)高架十字迷宮迷宮包括兩個開放端(16厘米*5厘米)，兩個閉口端(16厘米X 5厘米X 12厘米)，中間平臺(5厘米X5厘米)，高出地面25厘米。每 只動物實(shí)驗一次，每只小鼠單獨(dú)放入開口端的末端，面對迷宮中心，小鼠用四肢從開口端到閉口端說用的時間即為移動延時時間(TLT), 一旦小鼠在180s內(nèi)沒有進(jìn)入閉口端，輕柔的把它推入閉口端并計TLT為180s，在測完TLT后動物允許自由探索10s。3、實(shí)驗結(jié)果(I)水迷宮:圖4A所示，在訓(xùn)練第二天，:融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40組與PBS組有明顯差異(p〈0.01)。融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40組可明顯降低小鼠的游泳潛伏期。(2)高架十字迷宮:圖4B所示，融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40組與PBS組組間存在明顯差異(P〈0.05)。應(yīng)用融合蛋白TAT-LBD-NEP 1-40治療后小鼠的記憶功能明顯改善。
權(quán)利要求
1.一種TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，其特征在于:該融合蛋白的cDNA序列和蛋白序列如下: cDNA序列:ATG CGG GGT TCT CAT CAT CAT CAT CAT CAT GGT ATG GCT AGCATG ACT GGT GGA CAGCAA ATG GGT CGG GAT CTG TAC GAC GATGAC GAT AAG GAT CGA TGG GGA TCC AAG CTT GGCTAC GGC CGCAAG AM CGC CGC CAG CGC CGC CGC GGT GGA TCC ACC ATG GCCCTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC ； 蛋白序列:MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRRQRRRGGSTMALPGASGTCPERALERREEEANVVLTGTVEEILNVDPVQHTYSCKVRVWRYLKGKDLVARESLLDGGNKVVISGFGDPLICDNQVSTGDTRIFF VNPAPPYLWPAHKNELMLNSSLMRITLRNLEEVEFCVEDKPGGGGSRIYKGVIQAIQKSDEGHPFRAYLESEVAISEELVQKYSNSo
2.構(gòu)建權(quán)利要求1所述的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，其特征在于:TAT-LBD-NEP1_40融合蛋白是將TAT、LBD與NEP1-40融合制得，具體按照下述步驟構(gòu)建: 步驟一:從Genebank獲取LBD基因和NEP1-40序列，然后將LBD基因和NEP1-40序列之間通過GGCGGTGGCGGITCA序列連接，合成LBD-NEP1-40基因序列，且使得LBD-NEP1-40的基因序列兩端分別含有Nco I 和Xho I序列，整個LBD-NEP1-40的基因序列為:ACCATGGCC-CTGCCGGGCGCATCGGGCACCTGTCCGGAACGCGCACTGGAACGTCGTGAAGAAGAAGCAAATGTTGTCCTGACGGGTACGGTTGAAGAAATTCTGAACGTTGATCCGGTCCAGCATACCTATAGCTGCAAAGTCCGTGTGTGGCGCTACCTGAAAGGCAAGGATCTGGTGGCACGTGAAAGTCTGCTGGACGGCGGTAATAAGGTGGTTATTTCCGGCTTTGGTGATCCGCTGATCTGTGACAACCAAGTCAGTACCGGTGATACGCGCATCTTTTTCGTTAATCCGGCACCGCCGTATCTGTGGCCGGCACATAAAAACGAACTGATGCTGAATAGCTCTCTGATGCGTATTACGCTGCGCAACCTGGAAGAAGTGGAATTTTGCGTTGAAGATAAACCGGGCGGTGGCGGTTCACGTATCTACAAAGGCGTTATTCAGGCGATCCAAAAGTCGGACGAAGGTCACCCGTTCCGCGCCTACCTGGAATCGGAAGTCGCAATCTCAGAAGAACTGGTGCAAAAATACAGCAACAGC-CTCGAG ;其中基因下劃線為Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)； 步驟二:將合成得到的LBD-NEP1-40的基因序列裝載到pUC57載體中，得到PUC57-LBD-NEP1-40 載體； 步驟三；選用含限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I的人類免疫缺陷病毒的TAT序列的pTAT-HA作為表達(dá)載體；其中TAT的核苷酸序列為:ATA GGC AGG AAG AAG CGT AGA CAG AGACGT AGA ； 步驟四:用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I酶切pTAT-HA和pUC57-LBD-NEPl-40載體，分別回收酶切產(chǎn)物，其中pTAT-HA的酶切產(chǎn)物為線性pTAT載體，pUC57-LBD-NEPl-40的酶切產(chǎn)物為TAT-LBD-NEP1-40基因片段；步驟五:將步驟四得到的酶切產(chǎn)物，即線性PTAT載體和TAT-LBD-NEP 1-40基因片段采用T4連接酶連接通過克隆篩選得到重組質(zhì)粒pTAT-LBD-NEPl-40表達(dá)載體； 步驟六:將重組質(zhì)粒pTAT-LBD-NEPl-40表達(dá)載體經(jīng)過DNA測序分析正確后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，挑選5 8個陽性的菌落克隆在氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，采用IPTG預(yù)誘導(dǎo)表達(dá)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白； 步驟七:將誘導(dǎo)表達(dá)后的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白依次采用SDS-PAGE、考馬斯亮蘭R250染色，確定誘導(dǎo)表達(dá)的條件和陽性菌落克隆，然后在16 22°C，0.2mM IPTG條件下大量表達(dá)TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白； 步驟八:將誘導(dǎo)表達(dá)的TAT-LBD-NEP 1-40融合蛋白的細(xì)菌經(jīng)過超聲破碎菌體，釋放出目的蛋白后，經(jīng)過Ni離子整合的親和層析柱純化，純化后的蛋白經(jīng)過超濾濃縮為2mg/ml，存放在_80°C的冷藏。
3.權(quán)利要求1所述的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白用于制備哺乳動物腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的藥物用于在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷、脊髓損傷的治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白、構(gòu)建及其在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的應(yīng)用。用本發(fā)明構(gòu)建的TAT-LBD-NEP1-40融合蛋白，保留了NEP1-40對Nogo受體的選擇性拮抗活性，具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、易透過血脊屏障、血腦屏障的優(yōu)點(diǎn)，克服了NEP1-40的局限性，可以避免顯微注射或植入微型泵的方式注射NEP1-40引起神經(jīng)組織額外傷害以及NEP1-40難以通過血脊屏障、血腦屏障不能達(dá)到相應(yīng)的生物學(xué)濃度的不足。本發(fā)明可大量制備、成本低、活性高，用于包括腦缺血缺氧、腦出血、腦創(chuàng)傷以及脊髓損傷等多種CNS損傷的治療，促進(jìn)神經(jīng)組織的再生和神經(jīng)功能恢復(fù)，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的藥物。
文檔編號A61K47/48GK103113473SQ20131003269
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者王強(qiáng), 茍興春, 李立亞, 熊利澤 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)