專(zhuān)利名稱(chēng)：粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及其突變體(mG-CSF)與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域(3DHSA)的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬長(zhǎng)效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及制備粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
背景技術(shù)：
人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是由單核細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的一種分子量約為20KD的糖蛋白類(lèi)調(diào)節(jié)因子，其等電點(diǎn)約為6.0。G-CSF作用于骨髓中性粒細(xì)胞系造血前體細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化、成熟和釋放。成熟人體內(nèi)G-CSF有177個(gè)氨基酸(a型)和174個(gè)氨基酸(b)型兩種異構(gòu)體，b型分子的螺旋含量很高，晶體構(gòu)型含有四個(gè)α螺旋，屬于長(zhǎng)鏈螺旋細(xì)胞因子家族。鑒于b型的生物學(xué)活性及穩(wěn)定性均顯著高于a型，b型分子深受研究者的推崇。重組人G-CSF已廣泛用于骨髓移植和腫瘤的治療，此外，重組人粒細(xì)胞集落刺激因子還被用于治療急性白血病、再生障礙性貧血等疾病。G-CSF在輔助腫瘤治療方面的作用主要是增加白細(xì)胞數(shù)目，降低化療和放療的風(fēng)險(xiǎn)。目前已有多種以b型為基礎(chǔ)的重組人粒細(xì)胞制劑被批準(zhǔn)上市，如非格司亭(filgrastim),來(lái)格司亭(Ienograstim),那托司亭(nartograstim)。其中非格司亭和那托司亭為大腸桿菌表達(dá)的非糖基化形式的重組人G-CSF，而來(lái)格司亭是CHO細(xì)胞表達(dá)的帶糖基化修飾的G-CSF。非格司亭氨基酸序列即在天然G-CSF的N端附加一個(gè)蛋氨酸，那托司亭為非格司亭的突變體，共涉及天然G-CSF中5個(gè)氨基酸的定點(diǎn)突變，具體突變位點(diǎn)及方式為T(mén)hr I Ala, Leu 3 Thr, Gly 4 Tyr, Pro5 Arg, Cys 17 Ser0但是，天然和基因重組的人G-CSF易被腎小球?yàn)V過(guò)和體內(nèi)蛋白酶降解，在體內(nèi)的循環(huán)半衰期比較短，生物利用度非常低，為維持發(fā)揮作用的藥效濃度需要頻繁或高劑量給藥，增加了患者的疼痛和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，延長(zhǎng)粒細(xì)胞集落刺激因子的半衰期是目前各國(guó)學(xué)者研究的重點(diǎn)。為延長(zhǎng)粒細(xì)胞集落刺激因子的體內(nèi)半衰期，可對(duì)其進(jìn)行特定修飾。一種途徑是通過(guò)與某些特定組分耦聯(lián)達(dá)到增加G-CSF表觀分子量，從而降低腎臟的清除率。另一種途徑是與惰性蛋白融合，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用保護(hù)下阻止蛋白酶與蛋白的接觸，從而降低G-CSF被體內(nèi)蛋白酶降解的風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)聚乙二醇修飾、抗體Fe片段融合及白蛋白融合均可有效改善G-CSF的體內(nèi)半衰期。但是，聚乙二醇化修飾需要特殊的化學(xué)試劑，產(chǎn)物均一性差，分離純化困難，造成產(chǎn)品的價(jià)格昂貴。為保證Fe融合蛋白二硫鍵的正確折疊需要選用成本很高的哺乳動(dòng)物表達(dá) 系統(tǒng)，另外，F(xiàn)e融合蛋白的分子量偏大易造成融合蛋白分子擴(kuò)散通過(guò)粘膜的速率較低，進(jìn)而影響藥效。人血清白蛋白是人血漿中的主要成分，具有維持血漿滲透壓的功能，同時(shí)充當(dāng)內(nèi)源和外源多種物質(zhì)或藥物載體的作用。一方面由于其分子量比較大，正常情況下不易被腎小球?yàn)V過(guò)，另一方面可與體內(nèi)新生的Fe受體(FcRn)結(jié)合，通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用耐受體內(nèi)蛋白酶的降解，其體內(nèi)半衰期為19天?；诎椎鞍椎纳鲜鎏攸c(diǎn)，美國(guó)人類(lèi)基因組科學(xué)公司首先開(kāi)發(fā)了白蛋白融合技術(shù)，目前已有多種白蛋白融合蛋白藥物處于臨床實(shí)驗(yàn)階段。
雖然白蛋白融合技術(shù)已成功應(yīng)用于延長(zhǎng)多種蛋白或多肽類(lèi)藥物分子的半衰期，但是仍有一些亟待改進(jìn)的方面。首先，由于白蛋白分子量約為66.5KD，在融合其他蛋白或多肽時(shí)會(huì)產(chǎn)生明顯的空間位阻作用導(dǎo)致融合蛋白的活性明顯降低。其次，在酵母分泌表達(dá)白蛋白及其融合蛋白時(shí)易發(fā)生降解現(xiàn)象，且降解片段理化性質(zhì)與融合蛋白十分相近，增加了后續(xù)分離純化的難度。最后，白蛋白融合蛋白在儲(chǔ)存的過(guò)程中容易發(fā)生聚合現(xiàn)象，臨床應(yīng)用中容易誘發(fā)免疫反應(yīng)。已有研究證實(shí)人血清白蛋白的第三結(jié)構(gòu)域(3DHSA)是人血清白蛋白與FcRn結(jié)合的關(guān)鍵部位，獨(dú)立的3DHSA仍然具有與FcRn結(jié)合的能力，其作為伴侶分子能夠延長(zhǎng)藥物半衰期。此外，在表達(dá)人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域時(shí)未見(jiàn)降解現(xiàn)象，且其分子量大小適中，便于基因操作，較白蛋白融合更便于滿(mǎn)足延長(zhǎng)不同分子半衰期的需要。利用重疊延伸PCR(0verlapping PCR)方法，將3DHSA與效應(yīng)分子進(jìn)行直接融合，一方面可有效降低融合時(shí)產(chǎn)生的空間位阻效應(yīng)，另一方面避免因連接肽的引入所導(dǎo)致降解和潛在免疫原性等問(wèn)題。基于上述的理論與實(shí)踐可以推測(cè)，將G-CSF及其突變體與3DHSA融合時(shí)所構(gòu)建的蛋白將同時(shí)具有G-CSF與3DHSA的雙重生物學(xué)活性，可用于中性粒細(xì)胞減少癥的治療，并延長(zhǎng)G-CSF的體內(nèi)半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題在于克服粒細(xì)胞集落刺激因子體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，設(shè)計(jì)制備集粒細(xì)胞集落刺激因子與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的特性為一體的新型融合蛋白分子。本發(fā)明的融合蛋白在保留G-CSF生物活性的基礎(chǔ)上，使其體內(nèi)半衰期得到適當(dāng)延長(zhǎng)，提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的創(chuàng)新藥物分子。技術(shù)方案:兩種融合蛋白，即粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列分別包括SEQ NO:1與SEQ NO:2，SEQ NO:1與SEQ NO:
3。所述的融合蛋白氨基酸序列包括SEQ NO:1與SEQ NO:2，SEQ NO:1與SEQ NO:3，在不損害融合蛋白特性的原則下，對(duì)SEQ NO:2和SEQ NO:3部分氨基酸殘基的取代、缺少或加入得到的多肽分子。所述融合蛋白的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的氨基酸序列分別與SEQ NO:2和SEQ NO:3至少85%以上同源的氨基酸序列。所述融合蛋白的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的氨基酸序列分別與SEQ NO:2和SEQ NO:3至少95%以上同源的氨基酸序列。所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ NO:14和SEQ NO:15。所述的融合蛋白在制備治療粒細(xì)胞減少癥作用藥物的應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō):
本發(fā)明的技術(shù)方案:通過(guò)PCR技術(shù)分別擴(kuò)增獲得3DHSA-G10，3DHSA_mG10，HlO-G-CSF和ΗΙΟ-mG-CSF基因片段；利用重疊延伸PCR技術(shù)分別實(shí)現(xiàn)3DHSA-G10和HlO-G-CSF, 3DHSA-mG10和ΗΙΟ-mG-CSF的無(wú)縫連接，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物并對(duì)其依次進(jìn)行酶切和膠回收，酶切回收后的3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合基因分別與酶切回收的pPICz a A載體片段連接構(gòu)建重組表達(dá)載體；將線(xiàn)性化充分的重組表達(dá)載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方式插入宿主細(xì)胞畢赤酵母GS115的基因組中，從MD平板上挑取轉(zhuǎn)化出的克隆進(jìn)行試管培養(yǎng)并誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)上清，根據(jù)是否有相應(yīng)分子量的誘導(dǎo)條帶出現(xiàn)鑒定陽(yáng)性重組菌株。融合基因的獲得、重組表達(dá)載體的構(gòu)建、重組菌株的鑒定、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化、生物學(xué)活性及藥代動(dòng)力學(xué)特性研究步驟詳見(jiàn)具體的實(shí)施方案。本發(fā)明提供了用上述方法制備重組人粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，該融合蛋白包括與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域完全同源的第一區(qū)和與人粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體至少85%同源的第二區(qū)，優(yōu)選的是包括與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域序列完全同源的第一區(qū)和與人粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體序列相同的第二區(qū)，或95%以上同源且活性增強(qiáng)的衍生物。所述衍生物是指在不損害融合蛋白特性的條件下對(duì)二區(qū)部分氨基酸殘基的取代、缺失或加入而得到的一系列多肽分子。在本發(fā)明的融合蛋白中，人血清白蛋白的第三結(jié)構(gòu)域與粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的相對(duì)位置既可以是3DHSA- (m) G-CSF，又可以是(m) G-CSF-3DHSA，優(yōu)選為3DHSA-(m)G-CSF,即人血清白蛋白的第三結(jié)構(gòu)域與粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的N末端連接。二者選擇直接融合，中間不引入任何連接肽，以避免因連接肽的引入而導(dǎo)致的蛋白降解和潛在免疫原性方面的問(wèn)題。本發(fā)明還提供分別編碼人粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域融合蛋白(3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF)的DNA序列，該序列包括與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域核苷酸序列相同的第一區(qū)(SEQN0:4)和與粒細(xì)胞集落刺激因子(SEQN0:5)及其突變體(SEQN0:6)核苷酸序列相同的第二區(qū)。SEQ NO:4 是 3DHSA DNA 序列；SEQNO:5 是 G-CSF DNA 序列；SEQNO:6 是 mG-CSF DNA 序列；SEQNO:4，SEQNO:5 和 SEQNO:6 均自 5’ 端至 3’ 端本發(fā)明的又一目的是提供攜帶編碼本發(fā)明融合蛋白相應(yīng)DNA序列的重組表達(dá)載體。該重組表達(dá)載體包括pPICz a A、pPIC9、pGAPz α B,優(yōu)選pPICz a A。其中優(yōu)選pPICz α A載體，該載體本身分子量小便于基因操作，同時(shí)具有強(qiáng)AOXl啟動(dòng)子和MFa分泌信號(hào)肽等元件。AOXl啟動(dòng)子啟動(dòng)能力強(qiáng)，在甲醇作為唯一碳源時(shí)可高效啟動(dòng)目的基因的分泌表達(dá)。本發(fā)明的再一目的是提供表達(dá)本發(fā)明融合蛋白編碼基因的宿主，該宿主是可通過(guò)化學(xué)和電擊轉(zhuǎn)化的方法將完整或線(xiàn)性化的重組融合蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)入的細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞，其中優(yōu)選酵母細(xì)胞，優(yōu)選酵母是畢赤酵母，優(yōu)選畢赤酵母是GS115。優(yōu)選的酵母表達(dá)系統(tǒng)除了具有類(lèi)似原核表達(dá)系統(tǒng)遺傳背景清楚、易操作、繁殖能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)要求低、易于工業(yè)放大等優(yōu)點(diǎn)外，同時(shí)具有真核細(xì)胞的蛋白翻譯后修飾能力，易于大量生產(chǎn)高質(zhì)量的重組蛋白。GSl 15缺陷型菌株便于轉(zhuǎn)化后的篩選，而且其自身分泌雜蛋白少便于純化，糖基化程度低，可有效避免因釀酒酵母過(guò)度糖基化修飾引起免疫原性的問(wèn)題。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 ，即含有本發(fā)明融合蛋白基因的細(xì)胞，可通過(guò)提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定、菌落Dot blotting、SDS-PAGE檢測(cè)細(xì)胞的誘導(dǎo)上清篩選重組菌株或可選擇小鼠抗人G-CSF和HSA的抗體對(duì)上述方法所篩選重組菌株的培養(yǎng)上清進(jìn)行Western blotting鑒定?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)含有本發(fā)明融合蛋白基因的宿主生產(chǎn)本發(fā)明中的融合蛋白。宿主培養(yǎng)既可選擇搖瓶也可選擇生物反應(yīng)器，優(yōu)選生物反應(yīng)器。宿主的培養(yǎng)包括兩個(gè)階段，第一階段旨在宿主的大量生長(zhǎng)，第二階段主要用于誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。可以綜合利用多種手段自含有本發(fā)明融合蛋白基因宿主的培養(yǎng)液中分離并純化融合蛋白。如超濾、鹽析、醇沉、制備電泳、層析等技術(shù)以及上述技術(shù)的優(yōu)化組合。有益效果:1、本發(fā)明首次利用重疊延伸PCR技術(shù)成功的將SEQ NO:4和SEQ NO:5，SEQ NO:4和SEQ NO:6核苷酸序列進(jìn)行了直接拼接，成功構(gòu)建了兩種融合蛋白，其克服粒細(xì)胞集落刺激因子體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，其為集人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域與人粒細(xì)胞集落刺激因子的特性為一體的新型高效融合蛋白分子。2、本發(fā)明構(gòu)建了適合酵母分泌表達(dá)的重組表達(dá)載體并利用電擊轉(zhuǎn)化的方式將其插入畢赤酵母基因組中，綜合利用菌落印跡和SDS-PAGE對(duì)電擊轉(zhuǎn)化出的畢赤酵母GSl 15菌落進(jìn)行了快速的篩選，既降低了篩選工作量又保證了準(zhǔn)確率。3、本發(fā)明利用藍(lán)色瓊脂糖重力柱和丁基疏水柱純化得到了較高純度的兩種融合蛋白:3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF，純化所得融合蛋白均保留了 G-CSF的生物活性，二者在體內(nèi)的半衰期分別為3.4h和4.5h，約為G-CSF的1.6和2.1倍，提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的創(chuàng)新藥物分子。


圖1 為質(zhì)粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 的構(gòu)建示意圖。圖2為融合基因 3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的鑒定圖3 為重組質(zhì)粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 的酶切鑒定結(jié)果，圖A和B中M為Marker，Al泳道為重組質(zhì)粒pPICz a A-3DHSA-G-CSF，Α2泳道為重組質(zhì)粒 pPICz a A-3DHSA-G-CSF 的酶切產(chǎn)物，BI 泳道為重組質(zhì)粒 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF，B2泳道為重組質(zhì)粒pPICz a A-3DHSA-mG-CSF的酶切產(chǎn)物。圖4為陽(yáng)性重組克隆的篩選及鑒定，其中A和B分別為pPICz a A_3DHSA-G_CSF和pPICz a A-3DHSA-mG-CSF的菌落印跡結(jié)果結(jié)果，C和D分別為pPICz a A-3DHSA-G-CSF和pPICz a A-3DHSA-mG-CSF 的 SDS-PAGE 檢測(cè)結(jié)果。圖5為融合蛋白的Western blotting鑒定，圖A為小鼠抗人G-CSF抗體檢測(cè)結(jié)果，其中M為Marker，I泳道為3DHSA-G-CSF，2泳道為G-CSF，3泳道為3DHSA-mG_CSF，圖B為小鼠抗人HSA抗體檢測(cè)結(jié)果，其中M為Marker，I泳道為3DHSA-G-CSF，2泳道為HSA，3泳道為3DHSA-mG-CSF。圖6為誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響，圖A和圖B分別為3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG-CSF的SDS-PAGE結(jié)果，其中M為Marker，I 9泳道分別是誘導(dǎo)時(shí)間為24h，36h,48h，60h，72h，84h，96h，108h 和 120h 的結(jié)果。圖7為純化后融合蛋白的純度鑒定，其中M為Marker，圖Al為3DHSA-G-CSF，圖BI為 3DHSA-mG-CSF。
圖8為融合蛋白的體外活性測(cè)定。圖9為融合蛋白的半衰期測(cè)定。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用DH5 a、GSl 15和pPICz a A購(gòu)自Invitrogen,模板質(zhì)粒pPICz a A-HSA-G-CSF (SEQ NO:7)的構(gòu)建參考 CN 01124114.4。各實(shí)施例中所用質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根(北京)生化有限公司，人G-CSF Elisa試劑盒購(gòu)自達(dá)科為(深圳)科技有限公司，各種限制性?xún)?nèi)切酶、各種DNA聚合酶、T4DNA連接酶、核酸marker及小分子量蛋白marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，吉賽欣購(gòu)自華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，重組HSA購(gòu)自武漢禾元生·物技術(shù)公司，小鼠抗人HSA和G-CSF抗體購(gòu)自美國(guó)Santa公司，HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，藍(lán)色瓊脂糖填料和丁基疏水填料購(gòu)自GE公司，酵母粉和蛋白胨購(gòu)自0X0ID，YNB和博萊霉素購(gòu)自Invitrogen，其他試劑均為分析純，購(gòu)自鼎國(guó)(北京)股份有限公司。實(shí)施例13DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合基因的克隆3DHSA-G10和3DHSA_mG10的擴(kuò)增，所用引物如下:P1: 5 ’ TCTCTCGAGAAGAGAGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAAT3 ’ (5 ’ 端帶有 Xho I 酶切位點(diǎn)，CTCGAG)，引物 SEQ NO:8。P2:5，CCAGCGGGGTTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3，，引物 SEQ NO: 9。P3:5，ATGTGGGTGCTAAGCCTAAGGCAGCTTGAC3，，引物 SEQ NO: 10。PCR方法如下:50 μ L體系中加入:10 μ mo I/L的上下游引物各2 μ L (擴(kuò)增3DHSA-G10所用引物為Pl和Ρ2，3DHSA_mG10所用引物為Pl和P3)，2.5 μ mol/L的d NTP4 μ L, IOXPremistar buffer 5 μ L, 5U/ μ L 的 Premistar DNA 聚合酶 0.5 μ L，pPICz a A-HSA-G-CSF質(zhì)粒(SEQ NO:7) I μ L，不足部分由滅菌雙蒸水補(bǔ)齊，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min, 94°C變性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸lmin,重復(fù)25個(gè)循環(huán)。HlO-G-CSF和HlOiG-CSF的擴(kuò)增，所用引物如下:P4:5，TTTGGGTTTGACCCCGCTGGGACCGGCAAG3，，引物 SEQ NO: 11。P5:5’ CGTCTCGAGTTAGGGCTGGGCAAGGTGGC3，(5，端帶有 Xho I 酶切位點(diǎn)，CTCGAG)，引物 SEQ NO:12oΡ6:5’ TTTGGGTTTGGCACCCACATACAGAGCCAGCTCCCTGCCCCAGAGCTTCCTGCTCAGAG 3，，引物 SEQ NO: 13。PCR方法如下:50 μ L體系中加入:10 μ mol/L的上下游引物各2 μ L (擴(kuò)增3H10-G-CSF 所用引物為 Ρ4 和 Ρ5, HlO-mG-CSF 所用引物為 P6 和 P5)，2.5 μ mol/L 的d NTP4 μ L, IOXPremistar buffer5 μ L, 5U/ μ L 的 Premistar DNA 聚合酶 0.5 μ L,pPICz a A-HSA-G-CSF質(zhì)粒(SEQ NO:7) I μ L，不足部分由滅菌雙蒸水補(bǔ)齊，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min,94°C變性lmin,56°C退火lmin,72°C延伸lmin,重復(fù)25個(gè)循環(huán)。利用重疊延伸PCR 法分別將 3DHSA-G10 與 HIO-G-CSF，3DHSA_mG10 與 HlO-mG-CSF進(jìn)行融合:分別切膠回收3DHSA-G10，3DHSA_mG10，H10-G-CSF 和 HlOiG-CSF 基因片段的 PCR產(chǎn)物并稀釋30倍，于50 μ L體系中加入:10ymol/L的Pl和P5各2 μ L，2.5 μ mol/L的dΝΤΡ4μ L, 10XLA Taq buffer5 μ L，5U/μ L 的 LA Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，稀釋后的回收片段各 I μ L (擴(kuò)增 3DHSA-G-CSF 所用模板為 3DHSA-G10 與 H10-G-CSF，擴(kuò)增 3DHSA-mG_CSF 所用模板為3DHSA-mG10與HlO-mG-CSF)不足部分由滅菌雙蒸水補(bǔ)齊，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min,94°C變性 lmin,56°C退火 lmin, 72。。延伸 lmin30s,重復(fù) 25 個(gè)循環(huán)。通過(guò)I %瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物，對(duì)比DL2000，在加樣泳道約IOOObp大小出現(xiàn)融合基因條帶，如圖2。切膠回收目的基因片段，分別對(duì)回收的目的基因片段和pPICzaA進(jìn)行Xho I單酶切，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收融合基因片段及載體片段，用T4DNA連接酶將上述回收產(chǎn)物連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取轉(zhuǎn)化的單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)8h，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切所得大小片段分別與載體和融合基因片段大小吻合，如圖3。將上述克隆送南京思普金測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，命名為pPICz a A-3DHSA-G-CSF和pPICz aA-3DHSA-mG-CSF。實(shí)施例2重組菌株的篩選提取pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 質(zhì)粒，經(jīng) Sal I 單酶切進(jìn)行線(xiàn)性化，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切產(chǎn)物，
1.5kV電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，30°C靜置2h，將轉(zhuǎn)化物均勻涂布在4塊含有l(wèi)mol/L山梨醇的MD平板上，30°C倒置培養(yǎng)3天，將轉(zhuǎn)化出的克隆對(duì)應(yīng)標(biāo)記好同時(shí)轉(zhuǎn)接于新制備的兩塊MD平板上，30°C倒置培養(yǎng)3天，將紫外照射處理好的PVDF膜輕放在其中一塊MD平板菌落上方，同時(shí)在膜上放置紫外照射處理好的濾紙2張，用3mL無(wú)水甲醇將濾紙表面全部浸潤(rùn)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出PVDF膜和濾紙，按照Western blotting流程對(duì)PVDF膜依次進(jìn)行封閉、洗滌、孵育小鼠抗人G-CSF抗體、洗滌、孵育HRP標(biāo)記的兔抗小鼠Ig 二抗、洗漆和顯色。(參見(jiàn)Scorer CA等Biotechnologyl22:181-184.1994)根據(jù)是否出現(xiàn)有色菌落圈初步判定陽(yáng)性重組菌株，如圖4(A)和4(B)。在另一塊MD平板上挑取有菌落圈形成的對(duì)應(yīng)單菌落并接種于IOmLBMGY (30mg磷酸氫二鉀，118mg磷酸二氫鉀，134mg無(wú)氨基培養(yǎng)基，IOOmg酵母粉，200mg蛋白胨，2yg生物素，0.1mL甘油，ρΗ6.0)液體培養(yǎng)基中30°C、200r/min培養(yǎng)24h, 2000r/min離心5min,棄上清,用等體積的BMMY (30mg磷酸氫二鉀，118mg磷酸二氫鉀，134mg無(wú)氨基培養(yǎng)基，IOOmg酵母粉,200mg蛋白胨,2 μ g生物素,0.1mL無(wú)水甲醇，pH6.0)液體培養(yǎng)基重懸菌體，30°C、200r/min每12h往BMMY中加入100 μ L的無(wú)水甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)120h后，8000r/min離心lOmin，收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證，如圖4(C)和4(D)。對(duì)比蛋白Marker根據(jù)蛋白電泳條帶的粗細(xì)將陽(yáng)性克隆中相對(duì)表達(dá)量最高的菌株命名為 GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF。實(shí)施例33DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定將篩選到的GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 單菌落接種至裝有100ml BMGY(0.3g磷酸氫二鉀，1.18g磷酸二氫鉀，1.34g無(wú)氨基培養(yǎng)基，Ig酵母粉，2g蛋白胨，20 μ g生物素，ImL甘油，ρΗ6.0)的500ml錐形瓶中，220r/min, 30°C培養(yǎng)24h，2000r/min離心5min，收集菌體。用IOOml的BMMY (0.3g磷酸氫二鉀，1.18g磷酸二氫鉀，1.34g無(wú)氨基培養(yǎng)基，Ig酵母粉,2g蛋白胨,20 μ g生物素，ImL無(wú)水甲醇，pH6.0)重懸菌體沉淀，每12h補(bǔ)加ImL無(wú)水甲醇,持續(xù)誘導(dǎo)五天。8000r/min離心IOmin,收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，融合蛋白表達(dá)量隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷提高，如圖5 (A)和5 (B)。采用 Western blotting 鑒定融合蛋白 3DHSA-G-CSF 和 3DHSA-mG_CSF 的 G-CSF 和 HSA 抗原性，分別設(shè)定G-CSF (參見(jiàn)Yun Bai等PNAS20:7292-7296，2005)和HSA作為陽(yáng)性對(duì)照(參見(jiàn) YangHe 等 PNAS47:19078-19083，2011)如圖 6(A)和 6 (B)。實(shí)施例43DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的純化及純度鑒定GS115/pPICz a A-3DHSA-G-CSF 和 GS115/pPICz a A-3DHSA-mG_CSF 陽(yáng)性重組菌株發(fā)酵液離心所得上清過(guò)0.45 μ m濾膜后用純水稀釋三倍，用藍(lán)色瓊脂糖填料富集并純化目標(biāo)蛋白，收集的目的蛋白峰用丁基疏水填料純化融合蛋白，5mM醋酸鈉緩沖液透析純化所得的融合蛋白后冷凍干燥保存，命名為3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF，其氨基酸序列為SEQNO:14和SEQ NO:15。采用SDS-PAGE法對(duì)純化所得融合蛋白的純度進(jìn)行檢測(cè)，如圖7 (A)和7 (B)0實(shí)施例53DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的促NFS-60細(xì)胞增殖活性用MTT法測(cè)定純化所得融合蛋白3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的促NFS-60細(xì)胞增殖活性。將傳代培養(yǎng)正常的NFS-60細(xì)胞(美國(guó)ATCC)用RPM1-1640培養(yǎng)基離心洗滌三次，將細(xì)胞按I X IO5個(gè)/mL的密度懸浮于富含5%馬血清、5%胎牛血清的不含G-CSF的RPM1-1640培養(yǎng)基中(V/V)。于96孔板中每孔加入50 μ L細(xì)胞懸液，設(shè)6復(fù)孔培養(yǎng)，除空白夕卜，每孔中加入不同濃度的待測(cè)樣品，同時(shí)選取吉賽欣(重組人G-CSF的商品名)為陽(yáng)性對(duì)照藥，370C ,5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT工作液20 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，每孔加入裂解液100 μ L，混勻后，放入酶標(biāo)儀，于波長(zhǎng)570nm處測(cè)定吸光度，記錄測(cè)定結(jié)果?；钚苑治鼋Y(jié)果顯示:兩種融合蛋白均具有劑量依賴(lài)性刺激NFS-60細(xì)胞增殖的作用，如圖8。實(shí)施例63DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的體內(nèi)半衰期測(cè)定采用G-CSF終濃度 為lmg/kg的體重劑量，對(duì)6周齡的ICR雄性小鼠皮下分別注射吉賽欣和兩種融合蛋白，分別于給藥后的0.25h, 0.5h, lh, 2h, 4h, 8h, 12h, 24h和36h進(jìn)行眼眶取血，常溫靜置30min后，2000r/min離心lOmin，取上清，利用人G-CSF預(yù)包被El isa試劑盒檢測(cè)血清中G-CSF的濃度。將血藥濃度數(shù)據(jù)輸入PKsolver進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，擬合血藥濃度曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，3DHSA-G-CSF和3DHSA-mG_CSF的半衰期為分別為3.4h和4.5h，為G-CSF的1.6倍和2.1倍，如圖9。
權(quán)利要求
1.粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于它是由粒細(xì)胞集落刺激因子及突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域在基因水平直接融合后表達(dá)的重組蛋白；所述人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ N0:1所示；所述粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的氨基酸序列為SEQNO:2和SEQNO:3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列分別包括SEQNO:1與SEQNO:2, SEQNO:I與SEQNO:3，或不損害融合蛋白特性的原則下，對(duì)SEQ NO:2和SEQ NO:3部分氨基酸殘基的取代、缺少或加入得到的多肽分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于所述粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體氨基酸序列與SEQ NO:2和SEQ NO:3至少85%以上同源的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于所述粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體氨基酸序列與SEQ NO:2和SEQ NO:3至少95%以上同源的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其特征在于:粒細(xì)胞集落刺激因子與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的氨基酸序列為SEQNO:14、粒細(xì)胞集落刺激因子的突變體與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的融合蛋白的氨基酸序列為SEQNO:15o
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的融合蛋白在制備治療粒細(xì)胞減少癥作用藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬長(zhǎng)效融合蛋白藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)及其突變體(mG-CSF)與人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域(3DHSA)的融合蛋白；融合蛋白中所述的人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ NO1，粒細(xì)胞集落刺激因子及其突變體的氨基酸序列為SEQ NO2和SEQ NO3；所述的本發(fā)明首次成功構(gòu)建了兩種融合蛋白，其克服粒細(xì)胞集落刺激因子體內(nèi)半衰期短的缺點(diǎn)，其為集人血清白蛋白第三結(jié)構(gòu)域與人粒細(xì)胞集落刺激因子的特性為一體的新型融合蛋白分子。本發(fā)明的融合蛋白在保留G-CSF生物活性的基礎(chǔ)上，其在體內(nèi)的半衰期分別為3.3h和4.4h，約為G-CSF的1.6倍和2倍，提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的創(chuàng)新藥物分子。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103102418SQ201310042159
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者高向東, 趙述強(qiáng), 張瑜, 姚文兵, 田浤, 劉超, 陳曉菲 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)