專利名稱：協(xié)日嘎四味有效部位及其制備方法、質(zhì)量檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蒙藥的有效部位，特別涉及協(xié)日嘎四味有效部位及其制備方法、質(zhì)量檢測方法以及在藥品和保健食品等領(lǐng)域的應(yīng)用，屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
協(xié)日嘎四味由姜黃、黃柏、桅子、蒺藜4味中藥組成，蒙醫(yī)臨床較常用，具有利尿、清瀉濕熱功能；主要用于小便閉止，尿頻，尿急，尿中帶血，膀胱刺痛，是蒙醫(yī)治療膀胱熱證的首選方劑。協(xié)日嘎四味中主要含有酚酸類、生物堿類、萜類等成分，但是迄今未見涉及協(xié)日嘎四味的有效部位及其制備方法和用途的專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種協(xié)日嘎四味有效部位及其制備方法，還在于提供一種協(xié)日嘎四味有效部位的質(zhì)量檢測方法，還在于提供一種以協(xié)日嘎四味有效部位為活性成分的藥物或功能性食品。本發(fā)明中協(xié)日嘎四味有效部位的原料藥組成為:姜黃100-200重量份、黃柏50-130重量份、桅子60-180重量份、蒺藜100-200重量份。本發(fā)明中協(xié)日嘎四味黃酮有效部位的原料藥組成優(yōu)選為:姜黃150重量份、黃柏90重量份、桅子120重量份、蔡藜150重量份。

所述蔡藜為蔡藜科植物蔡藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果實(shí)經(jīng)微炒制得。本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位的原料藥，可以是市售協(xié)日嘎四味中各味藥材的飲片，也可以是這些植物的莖、葉、花穗、果實(shí)、地下根莖及根等任一部位或全部植株，優(yōu)選的
藥材來源為---姜黃:姜科植物姜黃(Curcuma longa L.)的干燥根莖。黃柏:蕓香科植
物黃檗(Phellodendron amurense Rupr.)或黃皮樹的樹皮。桅子:于雙子葉植物藥菌草科植物山桅(Gardenia jasminoides Ellis)的果實(shí)。蔡藜(微炒):蔡藜科植物蔡藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果實(shí)經(jīng)微炒制得。其中所述的協(xié)日嘎四味各味藥材包括未經(jīng)任何炮制處理的原藥材、飲片以及炮制品。本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法可以采用以下任意一種方法，或這些方法的任意組合進(jìn)行制備:1、溶劑萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50%_95%乙醇回流提取2-3次，溶劑用量為5 15體積份，每次提取1-2小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物，先將提取物混懸于水中，使藥材與分散后溶液體積比為1:3 — I:10 (w/v);然后用低極性的溶劑，溶劑用量為1-3倍提取物的水溶液，萃取2-4次，得到脂溶性成分；再用中等極性的溶劑，溶劑用量為1-3倍提取物的水溶液，經(jīng)2-5次萃取其中的成分；與之前萃取得到的脂溶性成分混合得到協(xié)日嘎四味有效部位。
所述低極性的溶劑為石油醚、乙醚、己烷、汽油中的任意一種溶劑或任意幾種溶劑的混合物；所述中等極性的溶劑為氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇中的任意一種溶劑或任意幾種溶劑的混合物。2大孔吸附樹脂法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50%-95%乙醇回流提取2-3次，溶劑用量為5 15體積份，每次提取1-2小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物，先將提取物混懸于水中，使得藥材量與分散后溶液體積比為1:10-1:2.5 (w/v);通過相當(dāng)生藥量的6-10體積倍的大孔吸附樹脂，吸附流速2BV/h，樹脂柱徑高比為1:4 1:13，以1-5倍樹脂體積的水洗脫進(jìn)行除雜，除雜流速為2 6BV/h ；以5-12倍樹脂體積的50% -70%乙醇洗脫，洗脫流速為I 3BV/h，收集50% -70%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，再以5-12倍樹脂體積的71% -90%乙醇洗脫，洗脫流速為4 9BV/h，收集71% -90%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，將50% -70%乙醇洗脫物與71% -90%乙醇洗脫物混合即為協(xié)日嘎四味有效部位。其中所用的大孔樹脂是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性任意一種類型，如AB-8、D3520、D101、 D4020、HPD400、S_8、HZ-806等，其中優(yōu)選為弱極性或中等極性的樹脂，如AB-8、D4020、D101等。其中所用的洗脫劑還可以為水或含水的乙醇、甲醇、丙酮等，優(yōu)選為O 100%的乙醇。其中50% -70%乙醇洗脫物與71 % -90%乙醇洗脫物混合可以是洗脫物直接混合，也包括將71 % -90%乙醇洗脫物用β -環(huán)糊精包合或用磷酸氫鈣吸收后再與50% -70%乙醇洗脫物混合。β -環(huán)糊精與71 % -90%乙醇洗脫物量為4:1 6:1，包合溫度為65 75°C，包合時(shí)間為1.5-3小時(shí)。3、超臨界CO2流體萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，加30-90%甲醇，超臨界流體萃取2-3次，每次提取1-3小時(shí)，溶劑用量為8L，將所得的提取物混懸于水中，然后用低極性的乙酸乙酯，萃取其中的成分，得協(xié)日嘎四味有效部位；可以對協(xié)日嘎四味原材料直接進(jìn)行萃取，也可以對上述任一方法和步驟所獲得的產(chǎn)物進(jìn)行萃取。萃取時(shí)可以使用或不使用以下任一種類溶劑及溶劑混合物:水、醇類、酮類及酯類溶劑。4、液-液逆流萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50% -80%乙醇回流提取2-4次，溶劑用量為5-15體積份，每次提取1-3小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物；先將提取物混懸于水中，然后用低極性溶劑萃取得到脂溶性成分，然后用中等極性的溶劑萃取獲得其中的萜類、酚類、生物堿類成分，將脂溶性成分與萜類、酚類、生物堿類成分混合得協(xié)日嘎四味提取物。脂溶性成分與萜類、酚類、生物堿類成分可以是直接混合，也可以將脂溶性成分用β-環(huán)糊精包合或用磷酸氫鈣吸收后再與萜類、酚類、生物堿類成分混合。β-環(huán)糊精與脂溶性成分量為4:1 6:1，包合溫度為65 75°C，包合時(shí)間為1.5-3小時(shí)。本發(fā)明所述的重量份與體積份的關(guān)系為g/mL的關(guān)系。本發(fā)明所述的協(xié)日嘎四味有效部位，其中總萜類、總酚類、總生物堿類成分百分含量的總和為5 99% (w/w)，其中優(yōu)選為50 99% (w/w)。本發(fā)明所述的協(xié)日嘎四味提取物中酚類活性成分最主要的是姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、1，7-bis (4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1, 4, 6-heptarien-3_one、l, 7-bis (4-hydroxyphenyl) -1, 4, 6-heptatrien-3_one 等成分。本發(fā)明所述的協(xié)日嘎四味提取物中萜類活性成分最主要的是京尼平苷、羥異桅子苷、山桅子苷、桅子苷、京尼平甙酸、京尼平苷龍膽二糖苷、桅子酮苷、10-乙酰京尼平苷、桅子酸、熊果酸等成分。本發(fā)明所述的協(xié)日嘎四味提取物中生物堿類活性成分最主要的是小檗堿、巴馬亭、藥根堿、黃柏酮、黃柏內(nèi)酷、關(guān)黃柏內(nèi)酷A、關(guān)黃柏內(nèi)酷B、關(guān)黃柏酸胺A等成分。本發(fā)明所述的協(xié)日嘎四味提取物中主要的酚類化合物結(jié)構(gòu)見表1:表I主要的酚類化合物結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種協(xié)日嘎四味有效部位，其特征在于有效部位中總萜類、總酚類、總生物堿類成分百分含量的總和為5 99%，百分含量以w/w計(jì)。
2.如權(quán)利要求1所述的協(xié)日嘎四味有效部位，其特征在于有效部位中總萜類、總酚類、總生物堿類成分百分含量的總和為50 99%，百分含量以w/w計(jì)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于該方法為以下任意一種方法，或這些方法的任意組合: 溶劑萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50%-95%乙醇回流提取2-3次，溶劑用量為5 15體積份，每次提取1-2小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物，先將提取物混懸于水中，使藥材與分散后溶液體積比為1:3 — 1:10，以w/v計(jì)；然后用低極性的溶劑，溶劑用量為1-3倍提取物的水溶液，萃取2-4次，得到脂溶性成分；再用中等極性的溶劑，溶劑用量為1-3倍提取物的水溶液，經(jīng)2-5次萃取其中的成分；與之前萃取得到的脂溶性成分混合得到協(xié)日嘎四味有效部位； 大孔吸附樹脂法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50%-95%乙醇回流提取2-3次，溶劑用量為5 15體積份，每次提取1-2小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物，先將提取物混懸于水中，使得藥材量與分散后溶液體積比為1:10-1:2.5，以w/v計(jì)；通過相當(dāng)生藥量的6-10體積倍的大孔吸附樹脂，吸附流速2BV/h，樹脂柱徑高比為1:4 1:13，以1-5倍樹脂體積的水洗脫進(jìn)行除雜，除雜流速為2 6BV/h ；以5-12倍樹脂體積的50% -70%乙醇洗脫，洗脫流速為I 3BV/h，收集50% -70%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，再以5-12倍樹脂體積的71% -90%乙醇洗脫，洗脫流速為4 9BV/h，收集71% -90%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，將50% - 70%乙醇洗脫物與71% -90%乙醇洗脫物混合即為協(xié)日嘎四味有效部位； 超臨界C(V流體萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，加30-90%甲醇，超臨界流體萃取2-3次，每次提取1-3小時(shí)，溶劑用量為8L，將所得的提取物混懸于水中，然后用低極性的乙酸乙酯，萃取其中的成分，得協(xié)日嘎四味有效部位； 液-液逆流萃取法:取協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片0.5-1.5重量份，50% -80%乙醇回流提取2-4次，溶劑用量為5-15體積份，每次提取1-3小時(shí)，減壓回收溶劑，得提取物；先將提取物混懸于水中，然后用低極性溶劑萃取得到脂溶性成分，然后用中等極性的溶劑萃取獲得其中的萜類、酚類、生物堿類成分，將脂溶性成分與萜類、酚類、生物堿類成分混合得協(xié)曰嘎四味提取物； 其中協(xié)日嘎四味復(fù)方藥材飲片的原料藥組成為: 姜黃100-200重量份、黃柏50-130重量份、桅子60-180重量份、蒺藜100-200重量份，所述蔡藜為蔡藜科植物蔡藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果實(shí)經(jīng)微炒制得。
4.如權(quán)利要求3所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于溶劑萃取法所用低極性的溶劑為石油醚、乙醚、己烷、汽油中的任意一種溶劑或任意幾種溶劑的混合物；所述中等極性的溶劑為氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇中的任意一種溶劑或任意幾種溶劑的混合物。
5.如權(quán)利要求3所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂法中所用的大孔樹脂是非極性、弱極性、中等極性、弱堿性或弱酸性任意一種類型。
6.如權(quán)利要求5所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂法中所用的大孔樹脂是弱極性或中等極性的樹脂。
7.如權(quán)利要求3所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于大孔吸附樹脂法所得50% -70%乙醇洗脫物與71% -90%乙醇洗脫物，液-液逆流萃取法所得脂溶性成分與萜類、酚類、生物堿類成分，其混合方式為直接混合；或者是用β_環(huán)糊精包合或用磷酸氫鈣吸收后再混合，具體為:將71% -90%乙醇洗脫物用β -環(huán)糊精包合或用磷酸氫鈣吸收后再與50% -70%乙醇洗脫物混合，β -環(huán)糊精與71% -90%乙醇洗脫物量為4:1 6:1，包合溫度為65 75°C，包合時(shí)間為1.5-3小時(shí)；或?qū)⒅苄猿煞钟忙?_環(huán)糊精包合或用磷酸氫鈣吸收后再與萜類、酚類、生物堿類成分混合，β -環(huán)糊精與脂溶性成分量為4:1 6:1，包合溫度為65 75°C，包合時(shí)間為1.5-3小時(shí)。
8.如權(quán)利要求3所述的協(xié)日嘎四味有效部位的制備方法，其特征在于其中協(xié)日嘎四味黃酮有效部位的原料藥組成為: 姜黃150重量份、黃柏90重量份、桅子120重量份、蒺藜150重量份，所述蒺藜為蒺藜科植物蔡藜TribulusterrestrisL.的干燥成熟果實(shí)經(jīng)微炒制得。
9.如權(quán)利要求1或2所述的協(xié)日嘎四味有效部位的質(zhì)量檢測方法，其特征在于該方法包括如下含量測定方法中的任意一種或幾種: 協(xié)日嘎四味有效部位中總酚的含量測定:精密吸取濃度為23.68μ g/ml的姜黃素對照品溶液0.5，1.0, 1.5,2.0,2.5,3.0和3.5ml，置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%十二烷基硫酸鈉2.0ml及1: 0.9的0.6%三氯化鐵一 0.9%鐵氰化鉀混合溶液1.0ml,混勻，在暗處放置5min，加0.lmol/L鹽酸溶液至刻度，在暗處放置20min，以顯色劑為空白，在720nm波長處測定吸收度；以姜黃素對照品取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；精密稱取協(xié)日嘎四味有效部位樣品各3份，每份30mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理5分鐘，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5.0mL于IOmL量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為樣品溶液；分別精密吸取上述樣品溶液1.0mL置25ml量瓶中，加無水乙醇至5ml，加0.3%十二烷基硫酸鈉2.0ml及1: 0.9的0.6%三氯化鐵一 0.9%鐵氰化鉀混合溶液1.0ml，混勻，在暗處放置5min，加0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，在暗處放置20min，以顯色劑為空白，在720nm波長處測定吸收度；外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，即得本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位中總酚以姜黃素計(jì)為15% 26% ； 協(xié)日嘎四味有效部位中總萜的含量測定:精密吸取0.0948mg/mL的桅子苷對照品溶液0.2,0.4,0.6,0.8和1.0mL,置IOmL具塞刻度試管中；向試管中緩慢滴加濃度為Img/HiL的香草醛-濃硫酸溶液，并不時(shí)振搖試管；最后定容至5mL，搖勻，室溫靜置lOmin，于438nm處測定吸光度；以桅子苷對照品取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；精密稱取協(xié)日嘎四味有效部位樣品各3份，每份25mg，置50mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理5分鐘，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5.0mL于IOmL量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為樣品溶液；分別精密吸取上述樣品溶液1.0mL置IOmL具塞刻度試管中；向試管中緩慢滴加濃度為lmg/mL的香草醛-濃硫酸溶液，并不時(shí)振搖試管；最后定容至5mL,搖勻，室溫靜置IOmin,于438nm處測定吸光度；外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，即得本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位中總萜以桅子苷計(jì)為25% 36% ； 協(xié)日嘎四味有效部位中總生物堿的含量測定:精密吸取0.0592mg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液0.5ml, 1.5ml, 2.5ml, 3.5ml, 4ml, 5.5ml置IOml具塞刻度試管中，揮干溶劑，分別加6ml溴麝香草酚藍(lán)試液溶解樣品，再加入6ml氯仿，用力振搖2min，傾入分液漏斗中，靜置30min，取氯仿層，同法萃取三次，取氯仿層置25ml容量瓶中，并用氯仿補(bǔ)足至刻度；以相應(yīng)試劑為空白，于415nm測定吸光度，以鹽酸小檗堿對照品取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；精密稱取協(xié)日嘎四味有效部位樣品各3份，每份30mg，置25mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲處理5分鐘，用70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品溶液；分別精密吸取上述樣品溶液1.0mL置IOml具塞刻度試管中，揮干溶劑，分別加6ml溴麝香草酹藍(lán)試液溶解樣品，再加入6ml氯仿,用力振搖2min,傾入分液漏斗中,靜置30min,取氯仿層，同法萃取三次，取氯仿層置25ml容量瓶中，并用氯仿補(bǔ)足至刻度；以相應(yīng)試劑為空白，于415nm測定吸光度；外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算含量，即得本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位中總生物堿以鹽酸小檗堿計(jì)為12% 28% ； 協(xié)日嘎四味有效部位中桅子苷、姜黃素、鹽酸小檗堿的含量測定:色譜條件:色譜柱:Elite C18色譜柱，4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流動(dòng)相:乙腈-0.4%磷酸二氫鉀水溶液，乙腈以A表示，0.4%磷酸二氫鉀水溶液以B表示，梯度洗脫條件:0 15min，8%A — 18%A ；15 18min，18%A — 45%A ；18 22min，45%A — 27%A ；22 35min，，27%A — 12%A ；35 40min, 12%A — 45%A ；40 55min，48%A — 52%A ;流速 1.0mL.mirT1 ;檢測波長分別為 238nm、34611!11、34611111;柱溫301:;進(jìn)樣量20 μ L ;標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密稱取經(jīng)減壓干燥至恒重的桅子苷對照品0.89mg與姜黃素對照品0.98mg至5ml量瓶中，精密稱取鹽酸小檗堿0.8Img于IOml容量瓶中，吸取2ml至混有上述兩個(gè)對照品的5ml容量瓶中，分別配制成濃度為0.178，0.0392，0.0324mg.mL—1的混合對照品儲備液，用50乙醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液；分別取混合對照品溶液分別進(jìn)樣2.0, 4.0,6.0,8.0,10.0, 20.0，25.0 μ I在上述色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，溶液的質(zhì)量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到桅子苷、姜黃素、小檗堿的回歸方程；含量測定:精密稱取3批協(xié)日嘎四味有效部位樣品各3份，每份25mg，于 25ml容量瓶中，70%乙醇定容，搖勻后用0.45 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液；精密吸取上述供試品溶液20 μ L，注入液相色譜儀，測定各色譜峰峰面積，計(jì)算含量，即得本發(fā)明協(xié)日嘎四味有效部位中含姜黃素、桅子苷、鹽酸小檗堿分別為 1.30-2.50%,9.25-19.50%, 0.80-2.10%。
10.如權(quán)利要求1或2所述的協(xié)日嘎四味有效部位在制備具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌作用的藥物或功能性食品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種協(xié)日嘎四味有效部位及其制備方法，制備方法包括溶劑萃取法、大孔吸附樹脂法、超臨界C02流體萃取法、液-液逆流萃取法中的一種或幾種，制得的協(xié)日嘎四味有效部位中總萜類、總酚類、總生物堿類成分百分含量的總和為5～99％(w/w)，使其有效成分的含量大大提高，克服了湯劑、膠囊劑服用劑量大的缺陷。同時(shí)本發(fā)明還提供了協(xié)日嘎四味有效部位中總酚、總萜、總生物堿、梔子苷、姜黃素、鹽酸小檗堿的含量測定方法，有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量的可控性，對蒙藥協(xié)日嘎四味的開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號A61P29/00GK103110890SQ20131004556
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者董玉, 馬強(qiáng) 申請人:董玉, 馬強(qiáng)