專利名稱：一種基于點(diǎn)擊化學(xué)的肺炎多糖結(jié)合疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一種疫苗藥物，具體地說(shuō)涉及一種肺炎多糖結(jié)合疫苗；本發(fā)明還涉及其制備方法和免疫學(xué)評(píng)價(jià)。
背景技術(shù)：
肺炎鏈球菌是革蘭氏陽(yáng)性囊狀雙球桿菌，可導(dǎo)致鼻竇炎、中耳炎、氣管炎和肺炎等非侵襲性感染，也可導(dǎo)致膿毒癥和腦膜炎等侵襲性感染。肺炎鏈球菌可通過(guò)病人和攜帶者的呼吸道分泌物傳播，是導(dǎo)致嬰幼兒、兒童和老人發(fā)病及死亡的主要原因之一。盡管可利用有效的抗生素治療，但由該菌引起的呼吸系統(tǒng)疾病和侵襲性感染仍然構(gòu)成重大的公共健康問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，每年約有數(shù)百萬(wàn)人死于肺炎鏈球菌感染。為保障人類健康，WHO主張接種疫苗來(lái)預(yù)防肺炎鏈球菌的感染。此外，隨著日益廣泛地使用抗生素，致使肺炎鏈球菌耐藥菌株達(dá)96%以上，且呈現(xiàn)多重耐藥性狀況，尤其是對(duì)青霉素、頭孢霉素、萬(wàn)古霉素、大環(huán)內(nèi)酯類和氟奎諾酮類抗生素的耐藥性，已成為全世界關(guān)注的嚴(yán)重問(wèn)題之一，給治療帶來(lái)了困難。因此，通過(guò)免疫接種來(lái)預(yù)防肺炎鏈球菌的感染變得十分緊迫和重要。莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要致病因子。根據(jù)莢膜的組分差異，肺炎鏈球菌可分成約90種血清型，但全球80%以上的感染性疾病是由約20種血清型的肺炎鏈球菌引起的。肺炎鏈球菌的保護(hù)性免疫 機(jī)制主要是產(chǎn)生針對(duì)肺炎莢膜多糖的特異性抗體。目前上市的肺炎莢膜多糖疫苗有4價(jià)、13價(jià)及23價(jià)多糖疫苗。大多數(shù)健康成人接種肺炎莢膜多糖疫苗2 3周后，體內(nèi)針對(duì)莢膜多糖的特異性抗體能升高2倍以上。但肺炎莢膜多糖是T細(xì)胞非依賴性抗原，2歲以下的兒童由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，對(duì)大多數(shù)肺炎莢膜多糖的抗體應(yīng)答反應(yīng)較弱，接種劑不能達(dá)到抗體保護(hù)水平，且產(chǎn)生的抗體很快消失。為解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者轉(zhuǎn)向?qū)Ψ窝祖溓蚓Y(jié)合疫苗的研究,并已有7價(jià)結(jié)合疫苗上市。通過(guò)將肺炎莢膜多糖與某種載體蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，使肺炎莢膜多糖轉(zhuǎn)化成T細(xì)胞依賴性抗原，從而刺激嬰幼兒的T細(xì)胞依賴性抗體的合成，并可產(chǎn)生加強(qiáng)應(yīng)答，同時(shí)還能提高免疫球蛋白(IgG)的抗體比例。這種多糖結(jié)合疫苗不僅能夠保護(hù)嬰幼兒(2歲以下兒童)，還能夠大大地增強(qiáng)抵抗力差的病人(如老人)對(duì)肺炎鏈球菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應(yīng)用前景。細(xì)菌莢膜多糖-蛋白結(jié)合疫苗最早出現(xiàn)在20世紀(jì)30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連接到馬血清球蛋白上，產(chǎn)生的偶聯(lián)物能在動(dòng)物身上產(chǎn)生多糖專一的抗體，同時(shí)提供相應(yīng)的免疫保護(hù)。1987年，世界上第一個(gè)多糖蛋白結(jié)合疫苗，B型流感嗜血桿菌(HiB)多糖-破傷風(fēng)類毒素(TT)結(jié)合疫苗被美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng)。默克公司、輝瑞公司、賽諾菲-安萬(wàn)斯公司和諾華公司相繼開(kāi)發(fā)了 HiB多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗和流行性乙型腦膜炎多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗，并成功上市。目前唯一已上市的肺炎鏈球菌多糖結(jié)合疫苗為美國(guó)輝瑞公司研制的7價(jià)結(jié)合疫苗(PCV7，包含4、68、抑、14、18(:、19 和23 型；商品名=Prevenar),已經(jīng)在70多個(gè)國(guó)家獲得了批準(zhǔn)。PCV7結(jié)合疫苗可以幫助抵御系統(tǒng)和黏膜感染；阻止細(xì)菌在鼻咽部增殖，從而降低肺炎鏈球菌的流行。國(guó)內(nèi)的細(xì)菌莢膜多糖結(jié)合疫苗也在起步當(dāng)中，如蘭州生物制品研究所、成都生物制品研究所和武漢生物制品研究所等單位在研發(fā)細(xì)菌莢膜多糖結(jié)合疫苗，包括流行性腦膜炎多糖結(jié)合疫苗和肺炎多糖結(jié)合疫苗。由于技術(shù)的限制，這些開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品還比較單一，結(jié)合工藝也是仿制歐美上世紀(jì)80年代的產(chǎn)品，產(chǎn)品缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。由于結(jié)合技術(shù)等原因，目前多糖結(jié)合疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性還需進(jìn)一步提高，結(jié)合技術(shù)尚需進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化。PCV7結(jié)合疫苗是用高碘酸鈉氧化肺炎鏈球菌莢膜多糖的鄰位羥基，氧化生成的醛基在還原劑硼氫氰化鈉(NaCNBH3)的作用下與載體蛋白(白喉毒素，CRM197)的氨基發(fā)生胺還原反應(yīng)，生成多糖-蛋白結(jié)合物。然而，該結(jié)合技術(shù)存在著以下不足之處:(1)氧化多糖產(chǎn)生的醛基與載體蛋白的氨基反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，需要5天以上，而且結(jié)合反應(yīng)的效率較低；(2)某些多糖與載體蛋白的反應(yīng) 需要在較高的溫度(如37° C)下進(jìn)行，會(huì)影響到多糖與蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(3)多糖-蛋白結(jié)合疫苗的免疫原性有待進(jìn)一步提高；多糖與載體蛋白的連接橋?yàn)榧装被?-CH2-NH-),由于甲氨基的長(zhǎng)度過(guò)短，載體蛋白的空間屏蔽作用會(huì)遮蔽多糖分子的抗原表位，從而影響其免疫原性。肺炎鏈球菌莢膜多糖與載體蛋白的連接也可用己二酸二酰肼(ADH)為連接劑，這也是一種常用的多糖-蛋白結(jié)合技術(shù)。首先，需要將多糖的鄰位順式羥基與溴化氰在堿性條件下反應(yīng)，生成氰酸酯，然后與ADH反應(yīng)；氰酸酯與ADH —端的氨基發(fā)生加成反應(yīng)，從而將酰肼基團(tuán)引入多糖分子中；多糖衍生物在碳二亞胺(EDC)的介導(dǎo)下與載體蛋白形成穩(wěn)定的結(jié)合物。該結(jié)合技術(shù)存在著以下不足之處:(1)溴化氰的反應(yīng)活性太強(qiáng)，活化反應(yīng)不易控制，導(dǎo)致制備工藝的批次穩(wěn)定性差；(2) EDC在介導(dǎo)ADH衍化多糖與載體蛋白結(jié)合的同時(shí)，易引起多糖與載體蛋白的自身交聯(lián)。這些不足之處會(huì)影響多糖結(jié)合疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性。點(diǎn)擊化學(xué)(click chemistry)是由諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者Sharpless教授于2001年首次提出，其中最主要的一類點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是由Cu(I)化合物催化疊氮化合物與炔基化合物反應(yīng)生成1，2，3-三唑五元環(huán)化合物。點(diǎn)擊化學(xué)能夠?qū)煞N不同物質(zhì)通過(guò)五元環(huán)共價(jià)結(jié)合起來(lái)。該方法具備產(chǎn)量高、效率高、副反應(yīng)少、反應(yīng)條件溫和、分離提純簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因而得到了廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明擬提出基于點(diǎn)擊化學(xué)的多糖-蛋白結(jié)合工藝，并通過(guò)延長(zhǎng)多糖與蛋白之間的連接橋長(zhǎng)度來(lái)進(jìn)一步提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用“點(diǎn)擊化學(xué)”的原理，在溫和的反應(yīng)條件下，對(duì)活化的肺炎莢膜多糖和載體蛋白(如破傷風(fēng)類毒素)進(jìn)行連接，制備肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，提高多糖與載體蛋白的結(jié)合效率，增強(qiáng)多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。本發(fā)明以長(zhǎng)鏈分子作為連接橋，增大了疫苗分子中肺炎莢膜多糖與載體蛋白的空間距離，減少了載體蛋白對(duì)肺炎莢膜多糖抗原表位的空間屏蔽作用，從而提高了結(jié)合疫苗的免疫原性。以下是肺炎多糖結(jié)合疫苗的制備與純化步驟:I)肺炎莢膜多糖在50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.7)中水解20_60分鐘，水解溫度為60-900C ;優(yōu)化的條件為水解30分鐘，水解溫度為75°C。
2)將水解產(chǎn)物的pH值調(diào)至5.5-6.0，在高碘酸鈉存在的情況下避光反應(yīng)5_120分鐘；優(yōu)化的氧化條件為PH值為5.8，避光反應(yīng)10分鐘；透析除去高碘酸鈉。高碘酸鈉可將肺炎莢膜多糖中的鄰位羥基氧化成醛基。3)在還原劑氰基硼氫化鈉存在的情況下，向氧化的多糖溶液中加入氨基乙炔，多糖與氨基乙炔的質(zhì)量比為1:(0.5 5);在20-401:反應(yīng)4-15小時(shí)，pH值為7_8;優(yōu)化的條件為于37°C反應(yīng)6小時(shí)，pH為7.4 ;優(yōu)化的質(zhì)量比為1: 2，于37°C下反應(yīng)6小時(shí)，pH值為
7.4。隨后，用超濾膜離心去除反應(yīng)混合液中的氰基硼氫化鈉及未參與反應(yīng)的氨基乙炔。4)制備短鏈疊氮化的破傷風(fēng)類毒素:用疊氮-甲酰琥珀酰亞胺活化破傷風(fēng)類毒素，其中疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與破傷風(fēng)類毒素的摩爾比為(5-60):1，活化反應(yīng)的pH值為
6.0-8.0，反應(yīng)溫度為2-15小時(shí)；優(yōu)化的活化反應(yīng)條件為摩爾比為20:1，活化反應(yīng)的pH值為7.4，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)。5)制備長(zhǎng)鏈疊氮化的破傷風(fēng)類毒素:(a)用2-亞氨基硫烷在破傷風(fēng)類毒素上引入巰基，其中破傷風(fēng)類毒素與2-亞氨基硫烷反應(yīng)的摩爾比為1: (10-60)，反應(yīng)pH值為
6.0-8.0,反應(yīng)1-24小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1:20，反應(yīng)pH為7.4，反應(yīng)4小時(shí)；(b)疊氮-甲酰琥珀酰亞胺的琥珀酰亞胺基團(tuán)與N-(2-氨乙基)馬來(lái)酰亞胺的氨基基團(tuán)反應(yīng)，在疊氮-甲酰琥珀酰亞胺上引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，其中疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與N-(2-氨乙基)馬來(lái)酰亞胺以摩爾比1: (0.5-4)的比例混合反應(yīng)，反應(yīng)pH值為
6.0-8.0,反應(yīng)0.5-4小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1: 1，反應(yīng)pH為7.4，反應(yīng)I小時(shí)；(c)馬來(lái)酰亞胺化的疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與巰基化的破傷風(fēng)類毒素反應(yīng)，在破傷風(fēng)類毒素上引入疊氮基團(tuán)；其中馬來(lái)酰亞胺化的疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與巰基化的破傷風(fēng)類毒素以摩爾比1: ( 10-60)混合反應(yīng)，反應(yīng)pH值為6.0-8.0,反應(yīng)1_24小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1:20,反應(yīng)pH為7.4,反應(yīng)4小時(shí)。6)在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行混合，多糖與破傷風(fēng)類毒素的質(zhì)量比為(0.5 5):1 ;將溶液pH值調(diào)整為
5.5-7.0,于室溫下反應(yīng)過(guò)夜；優(yōu)化的質(zhì)量比為2:1，溶液pH為6.0。7)以Superdex200凝膠過(guò)濾柱對(duì)步驟6得到的結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行純化，洗脫液為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，收集產(chǎn)物的洗脫液。本發(fā)明提供的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗制備工藝，可以帶來(lái)以下效果:I)本發(fā)明提供的制備工藝，可有效地縮短多糖-蛋白結(jié)合反應(yīng)的時(shí)間，將制備周期由傳統(tǒng)方法的5-6天縮短為1-2天。2)本發(fā)明提供了引入長(zhǎng)鏈連接橋的結(jié)合方法，有可效增大結(jié)合疫苗中多糖與載體蛋白之間的空間距離，顯著增強(qiáng)了肺炎莢膜多糖的免疫原性。


圖1短鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(S-PCV)的制備反應(yīng)示意2長(zhǎng)鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(L-PCV)的制備反應(yīng)示意3凝膠過(guò)濾分析S-PCV和L-PCV。用分析型凝膠過(guò)濾柱Superdex200 (IcmX 30cm)檢測(cè)S-PCV和L-PCV。分析條件:流動(dòng)相為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，流速0.5毫升/分鐘，檢測(cè)波長(zhǎng)為280納米。
圖fH-NMR分析S-PCV和L-PCV。1H-NMR分析由fcuker400MHz核磁共振儀完成。圖5L-PCV組和S-PCV組產(chǎn)生的多糖特異性抗體。圖a為多糖特異性的IgM抗體滴度；圖b為多糖特異性的IgG抗體滴度；圖c為多糖特異性的IgGl抗體滴度；圖d為多糖特異性的IgG2a抗體滴度。圖6肺炎莢膜多糖特異性抗體的特異性。
具體實(shí)施方案本發(fā)明包括兩種肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備、分離純化及其免疫學(xué)性質(zhì)的評(píng)價(jià)方法。實(shí)施例1:短鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(S-PCV)的制備短鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(S-PCV)的制備反應(yīng)如圖1所示。將5mg肺炎莢膜多糖溶于50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.7)中，于75°C下水解30分鐘。將水解產(chǎn)物的pH值調(diào)至
5.8，在高碘酸鈉存在的情況下室溫避光反應(yīng)10分鐘。透析除去未反應(yīng)的高碘酸鈉。將預(yù)處理后的肺炎莢膜多糖溶液的PH調(diào)節(jié)到7.4，在氰基硼氫化鈉存在的情況下，以多糖與氨基乙炔質(zhì)量比以2:1的比例混合反應(yīng)，37°C反應(yīng)6小時(shí)。使用截留分子量為50kDa的濾膜于5000g下離心3次，除去未反應(yīng)的氰基硼氫化鈉和氨基乙炔。載體蛋白與疊氮-甲酰琥珀酰亞胺以摩爾比為1:20的比例混合反應(yīng)，緩沖液為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)。此步驟中，疊氮-甲酰琥珀酰亞胺上的琥珀酰亞胺會(huì)與載體蛋白上的伯胺發(fā)生反應(yīng)。使用截留分子量為50kDa的濾膜于5000g下離心3次，除去未反應(yīng)的疊氮-甲酰琥珀酰亞胺。在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將活化肺炎莢膜多糖與活化載體蛋白以質(zhì)量比2:1混合反應(yīng)，pH為5.8，室溫反應(yīng)過(guò)夜。實(shí)施例2:長(zhǎng)鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(L-PCV)的制備長(zhǎng)鏈肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗(L-PCV)的制備反應(yīng)如圖2所示。將5mg肺炎莢膜多糖溶于50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.7)中，于75°C下水解30分鐘。將水解產(chǎn)物的pH值調(diào)至
5.8，在高碘酸鈉存在的情況下于室溫避光反應(yīng)10分鐘。透析除去未反應(yīng)的高碘酸鈉。將預(yù)處理后的肺炎莢膜多糖溶液PH調(diào)節(jié)到7.4，在氰基硼氫化鈉存在的情況下，以多糖與氨基乙炔質(zhì)量比以2:1的比例混合反應(yīng)，37°C反應(yīng)6小時(shí)。使用截留分子量為50kDa的濾膜于5000g下離心3次，除去未反應(yīng)的氰基硼氫化鈉和氨基乙炔。載體蛋白與2-亞氨基硫烷以摩爾比1:20混合反應(yīng)，緩沖液為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)，使用截留分子量為50kDa的濾膜于5000g下離心3次，除去未反應(yīng)的2-亞氨基硫烷。疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與N-(2-氨乙基)馬來(lái)酰亞胺以摩爾比1:1的比例混合反應(yīng)生成長(zhǎng)鏈分子 ，溶液的pH值為7.4，室溫反應(yīng)I小時(shí)。載體蛋白與生成的長(zhǎng)鏈分子以摩爾比1:20混合反應(yīng)，溶液的pH值為7.4，于室溫下反應(yīng)4小時(shí)。使用截留分子量為50kDa的濾膜于5000g下離心3次，除去未反應(yīng)的化學(xué)試劑。在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將活化肺炎莢膜多糖與活化載體蛋白以質(zhì)量比2:1混合反應(yīng)，pH為5.8，室溫反應(yīng)過(guò)夜。實(shí)施例3 =L-PCV和S-PCV的純化與表征將實(shí)施例1和2中所涉及的結(jié)合產(chǎn)物,用Superdex200凝膠過(guò)濾柱(2.6cmX 60cm)進(jìn)行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸緩沖液(pH7.4)，流速為3毫升/分鐘。分別收集對(duì)應(yīng)于L-PCV和S-PCV的洗脫峰。以Superdex200凝膠過(guò)濾柱(1.0cmX 30cm)對(duì)純化產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，洗脫液為20mM的磷酸緩沖液(PH7.4)，流速為0.5毫升/分鐘。如圖3所示，與載體蛋白相比，L-PCV和S-PCV的出峰時(shí)間明顯提前。這表明載體蛋白與肺炎莢膜多糖結(jié)合后，分子量顯著增加。用1H-NMR進(jìn)行檢測(cè)L-PCV和S-PCV。如圖4所示，與肺炎多糖分子相比，S-PCV在0-1.0ppm處出現(xiàn)了蛋白的特征峰,在5.0-5.5ppm處出現(xiàn)了含有C=C鍵的五元雜環(huán)特征峰。這表明肺炎多糖分子通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)成功地偶聯(lián)了載體蛋白。與S-PCV相比，L-PCV在7.1ppm處出現(xiàn)了琥珀酰亞胺的特征峰，這表明L-PCV的連接橋中含有琥珀酰亞胺。這進(jìn)一步說(shuō)明L-PCV的連接橋分子要大于S-PCV的連接橋。實(shí)施例4 =L-PCV和S-PCV的免疫原性測(cè)定選取15只5周齡的雌性Blab/C小鼠，體重為15_22克。隨機(jī)分為3組，即肺炎莢膜多糖組、L-PCV組和S-PCV組。腹腔注射，每只每次注射含有5微克多糖，每周注射I次，共注射3次。21天后眼眶取血。用ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中抗肺炎莢膜多糖的IgM、IgG、IgGl和IgG2a。如圖5所示，與肺炎莢膜多糖組進(jìn)行比較，S-PCV組的抗體滴度提高明顯，其中IgM、IgG、IgGl和IgG2a的抗體滴度分別是多糖組的9倍、577倍、457倍和100倍。L-PCV組的抗體滴度要顯著高于S-PCV組，其中IgM、IgG、IgGl和IgG2a的抗體滴度分別分別是S-PCV組的1.4倍、1.3倍、1.4倍和1.4倍。實(shí)施例5:肺炎莢膜多糖特異性抗體的特異性和親合性向200倍稀釋的L-PCV組和S-PCV組小鼠血漿中加入不同量的肺炎莢膜多糖，用ELISA方法檢測(cè)小鼠血漿中抗肺炎莢膜多糖的抗體水平。如圖6所示，隨著多糖加入量的增力口，多糖特異性抗體結(jié)合 96孔板中多糖的能力逐漸降低。當(dāng)加入的多糖達(dá)到150 μ g時(shí),抗體結(jié)合多糖的能力喪失。這表明小鼠產(chǎn)生的抗體能夠特異性地結(jié)合肺炎莢膜多糖。用硫氰酸銨法測(cè)定抗肺炎莢膜多糖的抗體親合性。肺炎莢膜多糖組的多糖特異性抗體親和指數(shù)為1.43mol/L,而L-PCV組和S-PCV組的抗體親和指數(shù)分別為3.90mol/L和
3.67mol/Lo這表明結(jié)合載體蛋白能顯著提高多糖特異性抗體的親合性,而長(zhǎng)鏈連接橋能進(jìn)一步提高多糖特異性抗體的親合性。
權(quán)利要求
1.一種肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，以共價(jià)鍵的方式將肺炎莢膜多糖連接到載體蛋白上，可用于預(yù)防肺炎鏈球菌的感染。
2.如權(quán)利要 求1所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗，所述的載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素。
3.權(quán)利要求1所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，制備的步驟包括:(1)肺炎莢膜多糖在酸性條件下水解；(2)由高碘酸鈉氧化肺炎莢膜多糖，多糖中的鄰位羥基氧化成醛基；(3)向氧化的肺炎莢膜多糖引入乙炔基團(tuán)；(4)向破傷風(fēng)類毒素引入疊氮基團(tuán)；(5)將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的破傷風(fēng)類毒素進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，肺炎莢膜多糖在50mM的醋酸鈉緩沖液(pH4.7)中水解20-60分鐘，水解溫度為60_90°C;優(yōu)化的條件為水解30分鐘，水解溫度為75°C。
5.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，高碘酸鈉氧化肺炎莢膜多糖的PH值為5.5-6.0，避光反應(yīng)5-120分鐘；優(yōu)化的氧化條件為pH值為5.8，避光反應(yīng)10分鐘。
6.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，由結(jié)構(gòu)式為H2N-R-C = CH的試劑來(lái)衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖，同時(shí)引入乙炔基團(tuán)。其中，R是碳數(shù)在0-20之間的烷基；優(yōu)化的試劑為氨基乙炔。
7.如權(quán)利要求6所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，氨基乙炔衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖的反應(yīng)條件為:在氰基硼氫化鈉存在的情況下，氧化的多糖與氨基乙炔在20-40°C反應(yīng)4-15小時(shí)，pH為7-8 ;優(yōu)化的條件為于37°C反應(yīng)6小時(shí)，pH為 7.4。
8.如權(quán)利要求6所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，氨基乙炔衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖過(guò)程氧化的多糖與氨基乙炔的質(zhì)量比為1: (0.5 5);優(yōu)化的質(zhì)量比為1:2。
9.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，用疊氮-甲酰琥珀酰亞胺活化破傷風(fēng)類毒素，同時(shí)引入疊氮基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求9所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與破傷風(fēng)類毒素的摩爾比為(5-60):1，活化反應(yīng)的pH值為6.0-8.0,反應(yīng)溫度為2-15小時(shí)；優(yōu)化的活化反應(yīng)條件為摩爾比為20:1,活化反應(yīng)的pH值為7.4,于室溫下反應(yīng)4小時(shí)。
11.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，(I)用2-亞氨基硫烷在破傷風(fēng)類毒素上引入巰基，(2)疊氮-甲酰琥珀酰亞胺的琥珀酰亞胺基團(tuán)與N-(2-氨乙基)馬來(lái)酰亞胺的氨基基團(tuán)反應(yīng)，在疊氮-甲酰琥珀酰亞胺上引入馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)，(3)馬來(lái)酰亞胺化的疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與巰基化的破傷風(fēng)類毒素反應(yīng)，在破傷風(fēng)類毒素上引入疊氮基團(tuán)。
12.如權(quán)利要求11所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，破傷風(fēng)類毒素與2-亞氨基硫燒反應(yīng)的摩爾比為1: (10-60),反應(yīng)pH值為6.0-8.0,反應(yīng)1_24小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1:20,反應(yīng)pH為7.4,反應(yīng)4小時(shí)。
13.如權(quán)利要求11所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與N-(2-氨乙基)馬來(lái)酰亞胺以摩爾比1: (0.5-4)的比例混合反應(yīng)，反應(yīng)pH值為6.0-8.0，反應(yīng)0.5-4小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1: 1，反應(yīng)pH為7.4，反應(yīng)I小時(shí)。
14.如權(quán)利要求11所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，馬來(lái)酰亞胺化的疊氮-甲酰琥珀酰亞胺與巰基化的破傷風(fēng)類毒素以摩爾比1: (10-60)混合反應(yīng)，反應(yīng)PH值為6.0-8.0,反應(yīng)1-24小時(shí)，于室溫下反應(yīng)；優(yōu)化的反應(yīng)條件為摩爾比為1:20，反應(yīng)pH為7.4，反應(yīng)4小時(shí)。
15.如權(quán)利要求3所述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗的制備方法，其特征在于，在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的載體蛋白以質(zhì)量比(0.5 5):1混合反應(yīng)；優(yōu)化的質(zhì)量比為2:1。
16.如權(quán)利要 求1所 述的肺炎莢膜多糖結(jié)合疫苗制劑是注射劑型。
全文摘要
本發(fā)明利用“點(diǎn)擊化學(xué)”的方法，將肺炎莢膜多糖以共價(jià)鍵的方式連接到破傷風(fēng)類毒素上，制備出可用于預(yù)防肺炎鏈球菌感染的多糖結(jié)合疫苗。通過(guò)延長(zhǎng)肺炎莢膜多糖與破傷風(fēng)類毒素之間連接橋的長(zhǎng)度，提高多糖結(jié)合疫苗的免疫原性。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103110940SQ20131004750
公開(kāi)日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月6日
發(fā)明者胡濤, 安文琪, 蘇志國(guó), 范蓓, 吳鼎龍, 馬小偉, 潘若文 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所, 華蘭生物工程股份有限公司, 華蘭生物疫苗有限公司