專(zhuān)利名稱：用于病毒生產(chǎn)的培養(yǎng)基補(bǔ)充物的制作方法
用于病毒生產(chǎn)的培養(yǎng)基補(bǔ)充物本申請(qǐng)是中國(guó)申請(qǐng)200780046058.8的分案申請(qǐng)，該母案于2007年10月11日以國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2007/060804提交，于2009年6月12日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。本發(fā)明提供大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物作為用于病毒繁殖的培養(yǎng)物補(bǔ)充物的用途。此外，還描述了包含病毒和大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物的藥物組合物，以及該組合物在癌癥治療和流行性感冒治療中的用途。目前，多種病毒疫苗(但不是流感疫苗)都利用經(jīng)胰蛋白酶消化的原代細(xì)胞如來(lái)自猴腎和兔腎和倉(cāng)鼠腎的細(xì)胞進(jìn)行生產(chǎn)(參見(jiàn)例如W09738094)。原代二倍體細(xì)胞培養(yǎng)有一些優(yōu)點(diǎn)，例如使用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基和牛血清就可以輕易制備，以及對(duì)廣泛范圍內(nèi)的多種病毒敏感。然而，原代二倍體細(xì)胞也有不利之處，例如被各種外來(lái)物質(zhì)污染、品質(zhì)和敏感性不統(tǒng)一;以及難以獲得適于培養(yǎng)的組織(例如猴腎)。相反，使用連續(xù)細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)在于，它們保持了感染病毒的天然抗原特征、它們是標(biāo)準(zhǔn)化的、它們對(duì)同一病毒的各種變體高度易感、而且它們能用微載體或懸浮發(fā)酵罐系統(tǒng)中的大量細(xì)胞來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。然而，這些優(yōu)點(diǎn)本身使得這類(lèi)細(xì)胞系適于用于疫苗生產(chǎn)。Mizrahi, ed.，ViralVaccines, Wiley-Liss, New York(1990)，pp.39-67。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，只在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中分離和傳代的A型流感病毒有時(shí)候保持它們大部分或所有的原始抗原特征，在疫苗生產(chǎn)中這被證明是非常有利的(Romanova J.et al., Virology,2003, 307(1):90-7;Romanova J.et al., Virus Res.2004,103:187-93)。然而，哺乳動(dòng)物原代二倍體細(xì)胞培養(yǎng)物作為疫苗生產(chǎn)的宿主系統(tǒng)存在問(wèn)題。這是由于例如外來(lái)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的污染、 細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞品質(zhì)不統(tǒng)一、細(xì)胞對(duì)同一病毒的多種變體有不同敏感性、病毒滴度低、以及在獲得和制備這種細(xì)胞培養(yǎng)物期間的高花費(fèi)和困難等問(wèn)題造成的。此外，在已測(cè)試過(guò)的連續(xù)細(xì)胞系中，只有MDCK細(xì)胞被報(bào)道能支持病毒充分生長(zhǎng)和分離(Frank et al., J Clin.Microb.10:3236(1979) ；Schepetink & Kok, J Virol.Methods42:241-250(1993))。另兩個(gè)連續(xù)細(xì)胞系非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞和幼倉(cāng)鼠腎(BK-21)已被鑒定出，并被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)用于生產(chǎn)人用疫苗。然而，被證明合格的Veix)細(xì)胞先前卻被發(fā)現(xiàn)不適合用于大規(guī)模生產(chǎn)人流感病毒疫苗。例如，與MDCK細(xì)胞相比，B型流感病毒在Vero細(xì)胞中的生長(zhǎng)極大受限(Nakamura el al., J Gen.Virol.56:199-202 (1981))。另外，有人嘗試用Vero細(xì)胞評(píng)價(jià)人A型流感病毒HlNl和H3N2對(duì)金剛烷胺(rimantadine)的敏感性，由于同MDCK細(xì)胞相比在這些細(xì)胞中的病毒滴度太低，未得出明確結(jié)果(Gorvakova EA etal.，J.Virol.，1996，70:5519-24)。因此，這些及其他研究顯示，流感病毒先前在Vero細(xì)胞中復(fù)制得不好，使得它們不適于大規(guī)模疫苗生產(chǎn)(Demidova et al., Vopr.Virosol (Russian) 346-352 (1979) ；Lau &Scholtissek, Virology212:225-231 (1995))。
Kaverin NV 和 Webster RG (J.Virol., 1995, 69 (4): 2700-3)描述了需要向流感病毒感染的Vero細(xì)胞的培養(yǎng)基中重復(fù)添加胰蛋白酶，以恢復(fù)A型流感病毒株的多重循環(huán)生長(zhǎng)模式。然而重復(fù)添加胰蛋白酶相當(dāng)費(fèi)力和耗時(shí)，因?yàn)楸仨氃谂囵B(yǎng)的各個(gè)階段添加胰蛋白酶(也參見(jiàn) Gorvakova EA et al., J.1nfect.Dis., 1995, 172:250-3)。DNA病毒科成員包含雙鏈基因組。細(xì)小病毒科是唯一的例外。大多數(shù)DNA基因組不是單純的線性分子。例如，乳多空病毒基因組是共價(jià)閉合的雙鏈環(huán)，而嗜肝DNA病毒基因組是雙螺旋環(huán)，其中一條鏈包含切口，另一條鏈包含裂隙。雙鏈痘病毒基因組的末端是共價(jià)連接的，而皰疹病毒基因組卻包含末端重復(fù)和內(nèi)部重復(fù)。DNA病毒分為下列科:細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、嗜肝 DNA 病毒科(Hepadnaviridae)、抱疫病毒科(Herpesviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、桿狀病毒科(Bacuoloviridae)和痕病毒科(Poxviridae)。雙鏈RNA病毒分為兩組:呼腸孤病毒科(Reoviridae)和雙RNA病毒科 (Birnaviridae)。負(fù)鏈單鏈RNA包膜病毒分為基因組不分節(jié)段的病毒(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、線狀病毒科(Filoviridae)和波爾納病病毒(Borna Disease Virus)、披膜病毒科(Togaviridae))或基因組分節(jié)段的(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亞病毒科(Bunyaviridae)和嵌沙樣病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括A、B和C型流感病毒、以及托高土(Thogoto)和多里(Dhori)病毒和傳染性娃魚(yú)貧血病毒(infectious salmon anemia virus)。流感病毒粒子組成如下:內(nèi)核是含有單鏈RNA基因組的核糖核蛋白(螺旋狀核殼體)，外層是脂蛋白包膜，包膜內(nèi)側(cè)還有基質(zhì)蛋白(Ml)。A型流感病毒的分節(jié)段基因組由8個(gè)線狀負(fù)極性單鏈RNA分子組成(C型流感病毒是7個(gè)分子)，其編碼十種多肽，包括:RNA依賴的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼體的核蛋白(NP);基質(zhì)膜蛋白(M1，M2)；從含脂質(zhì)的包膜上伸出的兩種表面糖蛋白:血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA);非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)和核輸出蛋白(NEP)?；蚪M的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制在核中發(fā)生，通過(guò)從質(zhì)膜出芽進(jìn)行裝配。這些病毒可在混合感染期間重新分配它們的基因。流感病毒通過(guò)HA吸附至細(xì)胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖上。病毒粒子被胞吞后，在細(xì)胞內(nèi)體中HA分子發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)膜融合，因而引發(fā)脫殼。核殼體遷移至核中，在那里進(jìn)行病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄。病毒mRNA通過(guò)獨(dú)特的機(jī)制被轉(zhuǎn)錄，在該機(jī)制中，病毒核酸內(nèi)切酶從細(xì)胞性異源mRNA切割下帶帽的5端，該末端然后充當(dāng)引物，用于通過(guò)病毒轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄病毒RNA模板。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在距模板末端15到22個(gè)堿基處終止，在這里寡聚(U)序列充當(dāng)添加多聚(A)段的信號(hào)。在這樣產(chǎn)生出的8種病毒RNA分子中，6種是單順?lè)醋有畔Ⅲw，它們被直接翻譯成HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PBl和PA。另外兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行剪接，各產(chǎn)生兩種mRNA，它們按不同的閱讀框翻譯，產(chǎn)生M1、M2、NS1和NEP0換句話說(shuō)，8種病毒RNA節(jié)段編碼11種蛋白:9種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，以及新近鑒定出的PB1-F2蛋白。考慮到大量生產(chǎn)病毒粒子尤其是用于預(yù)防和治療用途的病毒粒子的困難，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供新的培養(yǎng)方法和添加物，其可提高在連續(xù)細(xì)胞系中繁殖的病毒的產(chǎn)量和品質(zhì)。該問(wèn)題通過(guò)利用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物作為病毒繁殖的培養(yǎng)物補(bǔ)充物而加以解決。優(yōu)選，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素是兩性霉素B或其衍生物或類(lèi)似物。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素已知顯示出抗真菌性質(zhì)，被廣泛用于治療和預(yù)防動(dòng)物和人患者中的真菌感染。除了大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素的已知性質(zhì)之外，本發(fā)明的發(fā)明人還意外發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物也可以用于培養(yǎng)和繁殖那些通常難以培養(yǎng)、但在諸如預(yù)防、治療和工業(yè)等應(yīng)用中又大量需要的病毒粒子。有報(bào)道稱，兩性霉素B甲酯(其為兩性霉素B的衍生物)能提高腦心肌炎病毒(Enzephalomyocarditis virus) RNA和SV40病毒DNA的感染性(Borden E.et al., J.gen.Virol., 1979, 42, 297-303; Borden E.et al., Archivesof Virology, 1981,69, 161165)，然而沒(méi)有現(xiàn)有技術(shù)顯示或指示其用于病毒培養(yǎng)用途。利用本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物或類(lèi)似物，可增加病毒生長(zhǎng)，也可提高病毒粒子甚至在低感染復(fù)數(shù)時(shí)的感染性。

根據(jù)本發(fā)明，可以被成功培養(yǎng)的病毒是DNA或RNA病毒，優(yōu)選它們是RNA病毒，更優(yōu)選屬于正粘病毒科、小RNA病毒科和副粘病毒科。甚至更優(yōu)選，病毒是A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、鼻病毒和副流感病毒和其衍生物或類(lèi)似物或片段?；蛘?，麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒和狂犬病病毒可以是根據(jù)本發(fā)明加以培養(yǎng)的有用系統(tǒng)。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所培養(yǎng)的病毒可以在若干結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)基因中含有修飾，優(yōu)選在NSl和/或PBl基因中。所述修飾是缺失、置換或插入至少一個(gè)核酸?；蛘?，用含有大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的病毒也可以是腫瘤消解病毒(oncolytic virus)。病毒衍生物、類(lèi)似物或片段例如可以是任何仍可用于疫苗接種目的或顯示腫瘤消解能力的病毒粒子。這些病毒常常利用已被病毒感染的、且已被證明適于繁殖病毒粒子的細(xì)胞來(lái)加以培養(yǎng)。本發(fā)明還提供一種感染細(xì)胞用于病毒培養(yǎng)的方法，其使用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物，其包含下列步驟:a)用至少一個(gè)感染性病毒粒子感染細(xì)胞b)大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物或類(lèi)似物與胰蛋白酶一起被加入到接種物和
/或培養(yǎng)基中c)在適當(dāng)條件下保溫，繼之以d)收獲所產(chǎn)生的病毒，并且任選e)純化和/或鑒定該病毒。結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)，使用根據(jù)本發(fā)明的添加物或添加物混合物，病毒生長(zhǎng)提高至少0.11glO、優(yōu)選至少0.51ogl0、優(yōu)選I1glO、更優(yōu)選至少21ogl0、甚至更優(yōu)選至少
2.51ogl0、甚至更優(yōu)選至少51ogl0。本發(fā)明還提供一種藥物制劑，其包含病毒和大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物。優(yōu)選該病毒是減毒活病毒，或者根據(jù)本發(fā)明也可以是經(jīng)滅活的完整病毒粒子、含部分抗原的疫苗(split vaccine)或亞單位疫苗。
根據(jù)另一個(gè)具體實(shí)施方式
，該藥物制劑可以含有流感病毒和/或腫瘤消解病毒，并含有大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物。根據(jù)所使用的病毒種類(lèi)，該藥物制劑可用于治療或預(yù)防癌癥或流感感染。此外，本發(fā)明還可以用于分離或滴定病毒粒子。這具有特別重大的意義，因?yàn)樵谕ㄟ^(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染來(lái)培養(yǎng)病毒時(shí)，由于感染率(infection rate)不足且復(fù)制機(jī)制效率低，常常需要大量的病毒。通過(guò)在感染之前不久、或感染同時(shí)、或感染之后不久添加至少一種大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物，可以使病毒量大大降低。


圖1顯示兩性霉素B對(duì)流感病毒生長(zhǎng)的影響亞匯合(subconfluent)的Vero細(xì)胞處于不同的感染復(fù)數(shù)moi (0.001、0.0001和
0.00001)。病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有5 μ g/ml胰蛋白酶、以及O或250ng/ml兩性霉素B。在每個(gè)感染復(fù)數(shù)(含有和不含有兩性霉素B)，當(dāng)較快生長(zhǎng)的病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)達(dá)到50-95%時(shí)，收獲病毒。所有在兩性霉素B存在下保溫的病毒與在無(wú)兩性霉素B時(shí)生長(zhǎng)的病毒相比，細(xì)胞病變效應(yīng)出現(xiàn)得快，病毒滴度也升得快。比較的是TCID50滴度。圖1a顯示對(duì)HlNl株的影響。圖1b顯示對(duì)H3N2株的影響。圖1c顯示對(duì)B型流感株的影響。圖2顯不兩性霉素B存在和不存在時(shí)的滴定結(jié)果。a)用蝕斑測(cè)定法滴定兩性霉素B存在(左列)和不存在(右列)下的B型流感/Vienna/32/2006 (B/·Malaysia/2506/2004樣)病毒。在兩性霉素B存在下生長(zhǎng)的病毒，病毒產(chǎn)量提高大約2.51og。b)A/New Caledonia/20/99 (HlNl)樣 ANSI 病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)⑶以?250ng/ml 兩性霉素B存在和不存在條件下用TCID50測(cè)定法平行滴定。37° C保溫3天后，評(píng)價(jià)各孔的細(xì)胞病變效應(yīng)，并且計(jì)算滴度。圖3顯示利用兩性霉素B進(jìn)行的劑量漸升研究。亞匯合的單層Vero 細(xì)胞用 A/Vienna/28/2006 (A/Wisconsin/67/2005 樣)(H3N2)病毒以感染復(fù)數(shù)0.001感染。感染后，生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加不同濃度的兩性霉素B (分別為
0,31.25,62.5、125、250、500和1000ng/ml)。48小時(shí)后收獲病毒，在兩性霉素B存在下用TCID50測(cè)定法滴定。兩性霉素B濃度在250-500ng/ml時(shí)產(chǎn)生最高病毒滴度。通常，根據(jù)它們所具有的共軛雙鍵的數(shù)目和是否具有糖苷連接的碳水化合物，根據(jù)本發(fā)明的大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物和類(lèi)似物被分成三烯、丁烷、戊烷、己烷和庚燒。綜述參見(jiàn) Hamilton-Miller J.Μ.T.，Bacteriol.Reviews, 1973、37，166-196。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，該大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素為庚烷，像例如兩性霉素B、制念菌素(candidin)、七烯枝菌素(mycoheptin)、X-63、假絲霉素(candimycin)、DJ400B1、表霉素(perimycin)、抗真菌素 4915、敗菌素(eurotin)A、庚燒 757、摩尼卡霉素(monicamycin)、新七烯(neoheptane)、制霉菌素(Nystatin)、菲律賓菌素(Filipin)、Primaricin、游霉素(Natamycin)和PA150，以及它們衍生物和類(lèi)似物。根據(jù)最優(yōu)選的實(shí)施方式，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素是兩性霉素B或其衍生物或類(lèi)似物。兩性霉素B可以通過(guò)培養(yǎng)結(jié)節(jié)鏈霉菌(Streptomyces nodosus)等生物,并且從培養(yǎng)物中提取而產(chǎn)生。兩性霉素B實(shí)質(zhì)上是高分子量大環(huán)內(nèi)酯，其發(fā)色團(tuán)有7個(gè)共軛雙鍵。除了大的內(nèi)酯核之外，兩性霉素B具有其它的特征性基團(tuán)，包括氨基糖。其衍生物或類(lèi)似物可以是任何種類(lèi)，只要其仍然提供病毒培養(yǎng)添加物所需的那些特征。舉例來(lái)說(shuō)，其可以被N-乙?；-琥珀?；Ⅴセ蚺cCaCl2絡(luò)合。例如，它可以是兩性霉素B甲酯或含有兩性霉素B的脂質(zhì)體制劑。根據(jù)另一種實(shí)施方式，兩性霉素B與其衍生物的混合物，或多種兩性霉素B衍生物的不同混合物也能被用作病毒培養(yǎng)添加物和用于本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明，以足夠促進(jìn)病毒培養(yǎng)的濃度使用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物和類(lèi)似物。優(yōu)選濃度在 0.5ng/ml-5 μ g/ml,優(yōu)選 0.5ng/ml_2.5 μ g/ml,優(yōu)選 10ng/ml_900ng/ml,更優(yōu)選 100ng/ml-500ng/ml,更優(yōu)選 200ng/ml-400ng/ml。

根據(jù)本發(fā)明，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物和類(lèi)似物能被用于培養(yǎng)任何DNA或RNA病毒。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,病毒是RNA病毒。含有帶負(fù)鏈單鏈RNA包膜病毒分為具有非節(jié)段型基因組的病毒(副粘病毒科、彈狀病毒科、線狀病毒科和波爾納病病毒)或具有節(jié)段型基因組的病毒(正粘病毒科、布尼亞病毒科和嵌沙樣病毒科)。正粘病毒科包括A、B和C型流感病毒、以及托高土和多里病毒和傳染性鮭魚(yú)貧血病毒。正粘病毒科的基因組由6至8個(gè)負(fù)極性(與mRNA互補(bǔ)的)單鏈RNA分子組成。流感病毒粒子由含有單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心(螺旋狀核殼體)和內(nèi)層襯有基質(zhì)蛋白(Ml)的外層脂蛋白包膜組成。A型流感病毒的區(qū)段基因組由8個(gè)線狀負(fù)極性單鏈RNA分子組成(C型流感病毒是7個(gè)分子)，其編碼十個(gè)多肽:包括:RNA依賴的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核殼體的核蛋白(NP);基質(zhì)膜蛋白(M1，M2);從含脂質(zhì)的包膜伸出的兩個(gè)表面糖蛋白:血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA);非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)和核輸出蛋白(NEP)。示例性的，使用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素和其衍生物和類(lèi)似物作為培養(yǎng)物添加物進(jìn)行繁殖或進(jìn)行這里所述任何方法的病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、鼻病毒和副流感病毒(PIV)、麻疹和腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒和狂犬病病毒。用于本發(fā)明的病毒可以選自天然發(fā)生的病毒株、變體或突變體；誘變的病毒(例如通過(guò)暴露于誘變劑、重復(fù)傳代和/或在非許可性寄主中傳代而生成的)；再分配體(在分節(jié)段的病毒基因組的情況中)；和/或遺傳工程改造的病毒(例如使用"反向遺傳學(xué)"技術(shù)進(jìn)行改造)。優(yōu)選，通過(guò)添加大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素而進(jìn)行培養(yǎng)的病毒選自A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒。根據(jù)本發(fā)明，病毒在基因組內(nèi)可以含有導(dǎo)致表達(dá)和產(chǎn)生病毒的衍生物或類(lèi)似物的修飾。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該修飾可以位于NSl基因和/或PBl基因中。這可以導(dǎo)致產(chǎn)生含有完全缺失或者修飾的NSl蛋白質(zhì)、和/或完全缺失或修飾的PB1-F2蛋白、或從PB I基因組片段表達(dá)的修飾的PB2蛋白的病毒。NS I基因內(nèi)的修飾可以是缺失、插入或置換。這種修飾的RNA病毒的例子在W099/64068和W099/64571中公開(kāi)，其通過(guò)參考并入本文，其中NSl基因內(nèi)的修飾導(dǎo)致具有干擾素拮抗劑表型的RNA病毒，該表型導(dǎo)致減毒作用。
PB1-F2 的功能已經(jīng)由 Chen ff.et al., Nat Med.2001，12:1306-12 詳細(xì)描述。Zamarin D.et al.，J.Virol.，2006，80，7976-7983描述了 PB1-F2 蛋白內(nèi)經(jīng)證實(shí)負(fù)責(zé)能在小
鼠中引起病毒性致病機(jī)理的修飾?；蛘?，該病毒還可以是腫瘤消解病毒。腫瘤消解病毒典型的主要特征是它們的條件復(fù)制表型，其允許它們?cè)趷盒阅[瘤細(xì)胞而不是正常組織中生長(zhǎng)。在本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方案中，它可以是腫瘤消解型A型流感病毒，其在NSl基因中有修飾，不能在有IFN活性(IFN competent)的系統(tǒng)中生長(zhǎng)，但在不表達(dá)功能性IFN的系統(tǒng)中能有效復(fù)制。用于在補(bǔ)充有大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)病毒的細(xì)胞可以是任何能在合成培養(yǎng)基中體外生長(zhǎng)、并能用于繁殖病毒的細(xì)胞。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"指單個(gè)細(xì)胞、組織、器官、昆蟲(chóng)細(xì)胞、鳥(niǎo)類(lèi)細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、原代細(xì)胞、連續(xù)細(xì)胞系、和/或遺傳工程化的細(xì)胞、例如表達(dá)病毒的重組細(xì)胞的培養(yǎng)物。這些可以例如是BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、鼠類(lèi)細(xì)胞、人細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、TCMK細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、W1-38細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、T-FLY細(xì)胞、BHK細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NSO, PerC6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)、雞胚細(xì)胞或衍生物、含胚卵細(xì)胞、雞的含胚卵或其衍生物。優(yōu)選，細(xì)胞系是VERO細(xì)胞系。用來(lái)產(chǎn)生病毒的培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域已知的任何適于病毒培養(yǎng)的培養(yǎng)基。優(yōu)選，培養(yǎng)基是合成培養(yǎng)基。這可例如是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如改良的Eagle氏培養(yǎng)基MEM、極限必需培養(yǎng)基MEM、Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基D-MEM、D-MEM-F12培養(yǎng)基、William氏E培養(yǎng)基、RPMI培養(yǎng)基和其類(lèi)似物和衍生物。這些還可以是專(zhuān)業(yè)細(xì)胞培養(yǎng)和病毒生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如VP-SFM、0ptiPro SFM.AIM \ K 培養(yǎng)基、HyQ SFM4MegaVir ,EX-CELL Vero SFM、EPISERF、ProVero、任何293或CHO培養(yǎng)基和其類(lèi)似物和衍生物。這些培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有本領(lǐng)域已知的任何適于細(xì)胞和病毒培養(yǎng)的添加劑，例如動(dòng)物血清和其經(jīng)過(guò)分級(jí)分離之后的級(jí)分或類(lèi)似物、氨基酸、生長(zhǎng)因子、激素、緩沖液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸鈉、維生素、L-谷氨酰胺和生物緩沖液。優(yōu)選培養(yǎng)基是補(bǔ)充有L-谷胺酰胺和胰蛋白酶的OptiPRO SFM。特別地，大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或衍生物或類(lèi)似物還可以用于提高感染率(infenction rate)的效力。為增加對(duì)細(xì)胞的感染,將細(xì)胞同時(shí)與病毒粒子和大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物接觸。或者，可在添加病毒粒子至細(xì)胞前不久、添加的同時(shí)、或添加之后不久，用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物預(yù)處理細(xì)胞。優(yōu)選的時(shí)間是感染前I小時(shí)或感染后I小時(shí)，更優(yōu)選感染前0.5小時(shí)或感染后0.5小時(shí)?，F(xiàn)有技術(shù)已知高感染復(fù)數(shù)(MOI)導(dǎo)致產(chǎn)生大量感染性降低或沒(méi)有感染性的缺陷病毒粒子。因此，出于經(jīng)濟(jì)上的和科學(xué)上的原因，提供能以低(M010.001)或甚至優(yōu)選非常低MOI (Μ0Ι0.0001直至0.00001)或甚至更低MOI感染細(xì)胞的手段(means)應(yīng)該是有利的。使用根據(jù)本發(fā)明的添加物或添加物混合物，能使病毒生長(zhǎng)提高至少0.1loglO、至少0.51ogl0、優(yōu)選至少lloglO、更優(yōu)選至少21ogl0、甚至更優(yōu)選至少2.51ogl0、甚至更優(yōu)選至少 51ogl0。本發(fā)明的更進(jìn)一步的具體實(shí) 施方式是大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物用于用編碼病毒RNA區(qū)段的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VeiO細(xì)胞的用途。同樣，在細(xì)胞用含有病毒完整基因組的全部或一部分的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染之前不久、轉(zhuǎn)染的同時(shí)、或在轉(zhuǎn)染之后不久，向培養(yǎng)基中加入大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素。本發(fā)明更進(jìn)一步的具體實(shí)施方式
提供一種藥物制劑，其包含減毒活病毒或滅活病毒，并包含大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物，任選還含有藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選，病毒是流感病毒和/或腫瘤消解病毒。如果該藥物制劑包含腫瘤消解病毒，其能被用于癌癥的病毒治療。如果該藥物制劑包含流感病毒，它能被用于治療流感病毒感染。優(yōu)選，該藥物制劑包含減毒活病毒，但也能使用滅活病毒或其它病毒。所述制劑可以以適當(dāng)?shù)牧渴┯?。適當(dāng)?shù)牧靠梢允?至IOlog病毒粒子、更優(yōu)選5至91og病毒粒子、更優(yōu)選6.5至81og病毒粒子。根據(jù)本發(fā)明使用的制劑優(yōu)選以合適的制劑形式提供。優(yōu)選這種制劑帶有藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包含例如助劑、緩沖液、鹽和防腐劑。優(yōu)選提供現(xiàn)成的輸注溶液。由于病毒制劑相對(duì)穩(wěn)定，基于病毒或它們的衍生物的藥物具有相當(dāng)大的優(yōu)點(diǎn)，即它們可作為耐儲(chǔ)存的溶液、或作為現(xiàn)成即可使用形式的制劑出售。前者優(yōu)選是在冰箱溫度直至室溫的制劑中耐儲(chǔ)存。然而，根據(jù)本發(fā)明使用的制劑也可以以冷凍或凍干形式提供，其可以在需要時(shí)解凍或復(fù)原。通常，該制劑經(jīng)鼻內(nèi)或肌肉內(nèi)施用。然而同樣地，也可選擇其它腸胃外或粘膜施用方式，這些方式經(jīng)由全身或局部應(yīng)用將活性物質(zhì)帶到感染或腫瘤部位。本發(fā)明還提供一種加快標(biāo)準(zhǔn)TCID50測(cè)定、基于TCID50的測(cè)定或蝕斑測(cè)定、和提高這些測(cè)定的質(zhì)量和敏感性的手段(means)。通過(guò)利用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素來(lái)培養(yǎng)病毒，病毒生長(zhǎng)被加速，因此能夠更早地分析該測(cè)定，并且可在較早時(shí)間點(diǎn)獲得更精確的滴定結(jié)果。此外，本發(fā)明提供用于從`臨床樣品分離病毒的方法，其中在有大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物的情況下，用來(lái)自患者呼吸道的病毒粒子感染細(xì)胞，例如Veix)細(xì)胞，受感染細(xì)胞在有大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物存在的情況下在適當(dāng)條件下保溫以促進(jìn)病毒的生長(zhǎng)，并且分離并鑒定該病毒。流感病毒監(jiān)視程序需要從臨床樣品分離流感病毒的高效系統(tǒng)。通常這個(gè)程序包括用取自鼻咽洗漱物的材料感染雞的含胚卵或MDCK細(xì)胞。該程序的效力在年與年之間有差異，取決于病毒類(lèi)型和細(xì)胞底物。已知在卵中分離以及有時(shí)候在MDCK中分離可生成突變的病毒變體，該變體不同于在人群中傳播的真的病毒。曾經(jīng)顯示Vero細(xì)胞可作為流感病毒分離和鑒定的較好底物，因?yàn)樵醋訴ero的病毒的性質(zhì)更好地反映了人病毒的天性(RomanovaJ.，et al.2003)。可是同時(shí)不幸的是，Vero細(xì)胞系對(duì)病毒分離的敏感性低于MDCK細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，兩性霉素B改進(jìn)了流感病毒在VeiO細(xì)胞中從臨床樣品的分離。利用根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠提高陽(yáng)性分離病例的百分比，而通常該病毒很難從臨床樣品中在Vero細(xì)胞中被再分離。參考以下實(shí)施例將更充分地理解上述描述。然而，這樣的例子僅僅是實(shí)踐本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)具體實(shí)施方式
的代表性方法，不應(yīng)該被視為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1
本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是確定兩性霉素B對(duì)感染復(fù)數(shù)漸減的各種流感病毒的作用。所選擇的三種病毒反映了當(dāng)前流行的H1N1、H3N2和B亞型，這也是WHO為北半球 2006/07 季節(jié)性疫苗推薦的亞型。(http: //www.who, int/csr/disease/influenza/vaccinerecommendationsl/en/)。亞匯合的無(wú)血清單層Vero細(xì)胞用漸減的感染復(fù)數(shù)感染，即感染復(fù)數(shù)0.001、
0.0001或0.00001。使用兩種代表性的A型流感病毒:A/New Caledonia/20/99 (HlNl)和A/Vienna/28/2006 (H3N2) (A/Wisconsin/67/2005 樣病毒)，以及一種 B 型流感候選株:B/Vienna/32/2006 (B/Malaysia/2506/2004樣病毒)。感染后添加的生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充有5 μ g/ml胰蛋白酶，以及分別補(bǔ)充有O或250ng/ml兩性霉素B。當(dāng)在較快生長(zhǎng)的病毒上觀察到50%或更高的細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)，收獲所有用相同感染復(fù)數(shù)感染的細(xì)胞(O和250ng/ml兩性霉素B)的上清液。病毒滴度用TCID50測(cè)定法來(lái)決定。如圖la、lb和Ic所示，對(duì)于所測(cè)試的所有三種病毒，都可以得出兩性霉素B對(duì)病毒復(fù)制具有正面影響的結(jié)論。對(duì)于A/New Caledonia/20/99 (HlNl)而言，可觀察到兩性霉素B對(duì)病毒生長(zhǎng)的影響。在兩性霉素B存在下，隨著moi (感染復(fù)數(shù))漸減，滴度范圍為從8E+05到2E+07TCID50/ml。在最低moi時(shí)，不添加兩性霉素B導(dǎo)致病毒少llog。就A/NewCaledonia/20/99來(lái)說(shuō)，最低m oi0.00001就病毒生長(zhǎng)和兩性霉素B的影響而言似乎是最佳的。 A/Vienna/28/2006 (H3N2)病毒證實(shí)了 HlNl病毒的結(jié)果，顯示對(duì)該物質(zhì)影響的敏感性甚至更高。在所有三個(gè)試驗(yàn)過(guò)的moi上，當(dāng)在兩性霉素B存在下生長(zhǎng)并且在相同時(shí)間點(diǎn)收獲時(shí)，病毒滴度最少高llog。 在B/Vienna/32/2006 (B/Malaysia/2506/2004樣病毒)病毒上甚至觀察到該物質(zhì)更驚人的效果。在兩性霉素存在下生長(zhǎng)的病毒所測(cè)量的滴度范圍為l.E+07(moi0.001)到lE+06(moi0.00001) TCID50/ml。相反，當(dāng)不添加兩性霉素時(shí)，病毒幾乎不復(fù)制，導(dǎo)致滴度低于3E+05TCID50/ml，最低moi時(shí)則根本沒(méi)獲得病毒。與A型病毒相比，B型病毒顯示對(duì)該物質(zhì)的最大敏感性。部分原因是，該病毒適應(yīng)了在有兩性霉素B的情況下在無(wú)血清VeiO細(xì)胞上生長(zhǎng)?？傊?，能得出結(jié)論說(shuō)，兩性霉素B對(duì)上面討論的所有三種病毒亞型的病毒都有明確的效果。材料和方法:細(xì)胞和病毒:Vero細(xì)胞在無(wú)血清條件下培養(yǎng)，所使用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺的OptiPro SFM。每2到3天以1:3至1:4的比例傳代來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。所用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺的SFM。A/New Caledonia/20/99 源自 NIBSC，產(chǎn)品號(hào)碼 03/208，在 MDCK 細(xì)胞上傳代 3 次。通過(guò)將源自MDCK的病毒在兩性霉素B不存在下在Vero細(xì)胞中傳代4次，使其適應(yīng)在無(wú)血清Vero細(xì)胞上的生長(zhǎng)。A/Vienna/28/2006 (H3N2)( 一種 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)樣病毒)分離自臨床樣品，在MDCK細(xì)胞上傳代I次，隨后先在兩性霉素B存在下、又在兩性霉素B不存在下，在無(wú)血清Vero細(xì)胞上傳代5次。
B/Vienna/32/2006 ( —種 B/Malaysia/2506/2004 樣病毒)分離自臨床樣品，在MDCK細(xì)胞中傳代2次，然后在兩性霉素B存在下傳代6次以適應(yīng)在無(wú)血清Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)。效價(jià)測(cè)丨定(potent assay)用TCID50 (組織培養(yǎng)感染劑量)測(cè)定法滴定病毒，該測(cè)定法是一種基于細(xì)胞的測(cè)定法，允許在96孔板中統(tǒng)計(jì)學(xué)確 定病毒效價(jià)。病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)腥緛唴R合的單層Vero細(xì)胞(96孔板)，在5118/1111胰蛋白酶和2501^/1111兩性霉素8存在下，在33° C(B型病毒)和37° C(A型病毒)下使病毒生長(zhǎng)。保溫3至6天后，檢查孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)，根據(jù)ReedL.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27 =493-497 的公式計(jì)算滴度。實(shí)施例2一種 B 型病毒(B/Malaysia/2506/2004 樣)和一種 A/H1N1 病毒(A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)樣ANSI)在兩性霉素B存在和不存在下用兩種不同方法滴定。在兩種情況下都觀察到該物質(zhì)對(duì)最終病毒滴度的明確效果，如圖2a和b所示。在圖2a 中，B/Vienna/32/2006 病毒(B/Malaysia/2506/2004 樣病毒)被連續(xù)稀釋?zhuān)梦g斑測(cè)定法在250ng/ml兩性霉素存在和不存在條件下平行滴定。33° C保溫5天后，計(jì)算蝕斑，直接比較蝕斑數(shù)目。在圖2b 中，A/New Caledonia/20/99 (HlNl)樣 ANSI 病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)?TCID50測(cè)定法在250ng/ml兩性霉素B存在和不存在條件下平行滴定。37° C保溫3天后，評(píng)價(jià)孔的細(xì)胞病變效應(yīng)，并計(jì)算滴度。如圖2a中所示，同樣的病毒在兩性霉素B存在下生長(zhǎng)可使滴度高出21og以上。兩性霉素B存在時(shí)，B型病毒滴度達(dá)到lE+08pfu/ml以上。這一結(jié)果清楚顯示，通過(guò)添加該物質(zhì)使蝕斑測(cè)定的敏感性顯著提高。在圖2b中，在兩性霉素B存在和不存在下用TCID50滴定A/H1N1病毒。這時(shí)同樣觀察到滴度顯著提高，敏感性幾乎提高llog。材料和方法:細(xì)胞和病毒:Vero細(xì)胞在無(wú)血清條件下培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺的OptiPro SFM。每2到3天以1:3至1:4的比例在37。C、5%C02下傳代來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。B/Vienna/32/2006 源自于一種 B/Malaysia/2506/2004 樣臨床分離物，在 MDCK 細(xì)胞中分離(傳代2次)，然后在兩性霉素B存在下在33° C傳代6次以適應(yīng)在無(wú)血清Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)。A/New Caledonia/20/99 (HlNl)樣 ANSI 病毒含有來(lái)自 A/NewCaledonia/20/99 (HlNl)病毒的表面蛋白質(zhì)HA和NA以及來(lái)自A/Puerto Rico/8/34的內(nèi)部區(qū)段，而一部分NS(非結(jié)構(gòu)性)區(qū)段被缺失。該病毒通過(guò)反向遺傳學(xué)生成，在兩性霉素B存在下在37。C在Vero細(xì)胞上傳代。效價(jià)測(cè)定蝕斑測(cè)定用蝕斑測(cè)定法滴定病毒。病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)腥緟R合的單層Vero細(xì)胞，覆蓋層由Vero生長(zhǎng)培養(yǎng)基組成，該培養(yǎng)基還補(bǔ)充有0.01%DEAE葡聚糖、lOxDMEM、飽和碳酸氫鈉、5 μ g/ml胰蛋白酶以及O或250ng兩性霉素B。TCID50 測(cè)定TCID50 (組織培養(yǎng)感染劑量)測(cè)定法是一種基于細(xì)胞的測(cè)定法，允許在96孔板中用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定病毒效價(jià)。病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)腥緛唴R合的單層Vero細(xì)胞(96孔板)，病毒在5 μ g/ml膜蛋白酶存在下，在250ng/ml兩性霉素B存在或不存在下在37° C生長(zhǎng)。保溫3天后，檢查孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)，根據(jù)Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27:493-497的公式計(jì)算滴度。實(shí)施例3在本實(shí)驗(yàn)中，Vero細(xì)胞用A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)樣病毒感染后，添加不同劑量的兩性霉素B。通過(guò)提高兩性霉素B的濃度，病毒復(fù)制被提高，濃度在62.5-1000ng/ml時(shí)顯示清楚效果。亞匯合的無(wú)血清單層Vero細(xì)胞用A/Vienna/28/2006 (H3N2) (A/Wisconsin/67/2005樣)病毒以感染復(fù)數(shù)0.001感染。病毒在不同濃度的兩性霉素B存在下生長(zhǎng)，即兩性霉素BO,31.25,62.5,125,250,500和1000ng/ml。48小時(shí)后收獲病毒，在250ng/ml兩性霉素B存在下用TCID50測(cè)定滴定。獲得的滴度范圍為8E+05至4E+07TCID50/ml。在兩個(gè)最低濃度(O和31.25ng/ml)時(shí)，病毒滴度低于lE+06TCID50/ml，而在250和500ng/ml兩性霉素B時(shí)，病毒滴度增加到超過(guò)3E+07TCID50/ml。對(duì)結(jié)果的示例性說(shuō)明參見(jiàn)圖3。材料 和方法:細(xì)胞和病毒:Vero細(xì)胞在無(wú)血清條件下培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺的OptiPro SFM。通過(guò)每2至3天以1:3至1:4比例傳代，在37° C、5%C02環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞。分離自臨床樣品的A/Vienna/28/2006 (H3N2)( 一種 A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)樣病毒)在MDCK細(xì)胞上傳代I次，隨后先在兩性霉素B存在下、然后在兩性霉素B不存在下，在無(wú)血清VeiO細(xì)胞上傳代5次。效價(jià)測(cè)定通過(guò)TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)測(cè)定法滴定病毒，該測(cè)定法是一種基于細(xì)胞的測(cè)定法，允許用統(tǒng)計(jì)的方法在96孔板中確定病毒效價(jià)。病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)腥緛唴R合的單層VeiO細(xì)胞(96孔板)，在33° C(B性病毒)和37° C(A型病毒)，在5 μ g/ml胰蛋白酶和250ng/ml兩性霉素B存在下，使病毒生長(zhǎng)。保溫3至6天后，檢查孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)，根據(jù) Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27 =493-497 的公式計(jì)算滴度。實(shí)施例4用兩性霉素B在轉(zhuǎn)染后有效拯救病毒在本實(shí)施例中，如Hoffman et al.所述但進(jìn)行了若干改良(Hoffmann E.etal., Proc Natl Acad Sci, 2002，99:11411-6),無(wú)血清 Vero 細(xì)胞用 8 個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,該 8 個(gè)質(zhì)粒編碼A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)樣病毒的8個(gè)區(qū)段。6小時(shí)后添加含有250ng/ml兩性霉素B和5 μ g/ml胰蛋白酶的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后6天，當(dāng)在兩性霉素B存在的情況下生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染病毒中可以觀察到清楚的細(xì)胞病變效應(yīng)、并且在兩性霉素B不存在的細(xì)胞中也可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)跡象時(shí)，收獲部分病毒。沒(méi)有兩性霉素B的病毒又進(jìn)一步監(jiān)視3天，沒(méi)有顯示任何細(xì)胞病變效應(yīng)進(jìn)展的征兆。在250ng/ml兩性霉素B存在下用TCID50測(cè)定法確定滴度。如表I所說(shuō)明的，在有兩性霉素B存在的情況下獲得2E+04 TCID50/ml的滴度，而兩性霉素B不存在時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到病毒。這一實(shí)施例清楚地顯示，在沒(méi)有兩性霉素B的情況下無(wú)法生長(zhǎng)的病毒僅在有兩性霉素B的情況下就能被有效拯救。材料和方法:細(xì)胞和病毒:Vero細(xì)胞在無(wú)血清條件下培養(yǎng)，所使用的培養(yǎng)基是補(bǔ)充有4mM L-谷氨酰胺的OptiPro SFM。在37。C、5%C02下每2至3天以1:3至1:4比例傳代，來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。A/Vienna/28/2006 (H3N2)是一種來(lái)源于臨床樣品的 A/Wi scons in/67/2005 (H3N2)樣病毒，在MDCK細(xì)胞上傳代I次，隨后先在兩性霉素B存在下、又在兩性霉素B不存在下在無(wú)血清VeiO細(xì)胞上傳代5次。病毒節(jié)段被克隆入質(zhì)粒，這些質(zhì)粒既能以病毒RNA作為模板轉(zhuǎn)錄成基因組，又能以病毒RNA作為模板轉(zhuǎn)錄成mRNA以進(jìn)一步加工成病毒蛋白質(zhì)(Hoffmannet al;Eight-plasmid system for the rapid generation of influenza virusvaccines, Vaccine (20).2002),其中這些質(zhì)粒被相應(yīng)改進(jìn)。所有8個(gè)質(zhì)粒通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)染AVero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6小時(shí)之后，添加含有5 μ g/ml胰蛋白酶以及分別含有O和250ng/ml兩性霉素B的無(wú)血清培養(yǎng)基。6天后收獲部分轉(zhuǎn)染子病毒，并進(jìn)一步觀察3天。效價(jià)測(cè)定通過(guò)TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量)測(cè)定法滴定病毒，該測(cè)定法是一種基于細(xì)胞的測(cè)定法，允許用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在96孔板中確定病毒效價(jià)。病毒被連續(xù)稀釋?zhuān)腥緛唴R合的單層Vero細(xì)胞(96孔板)，病毒在33° C(B型病毒)和37° C(A型病毒)下,在5 μ g/ml胰蛋白酶和250ng/ml兩性霉素B存在下生長(zhǎng)。保溫最多6天后，檢查孔中的細(xì)胞病變效應(yīng)，根據(jù) Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27:493-497 的公式計(jì)算滴度。表I顯示轉(zhuǎn)染后兩性霉素B存在和不存在下的病毒拯救。Vero細(xì)胞用8個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，該8個(gè)質(zhì)粒編碼A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)樣病毒的8個(gè)區(qū)段。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，添加含有5 μ g/ml胰蛋白酶和O或250ng/ml兩性霉素B的培養(yǎng)基。病毒用TCID50測(cè)定法滴定。
權(quán)利要求
1.大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物作為用于病毒繁殖的培養(yǎng)物補(bǔ)充物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素是兩性霉素B或其衍生物或類(lèi)似物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任何一項(xiàng)的用途，其中所述大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素濃度為0.5ng/ml-5 μ g/ml,優(yōu)選 0.5ng/ml_2.5 μ g/ml,優(yōu)選 10ng/ml_900ng/ml,更優(yōu)選 IOOng/ml-500ng/ml,更優(yōu)選 200ng/ml-400ng/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任何一項(xiàng)的用途，其中所述病毒是DNA或RNA病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任何一項(xiàng)的用途，其中所述病毒是正粘病毒科、小RNA病毒科、披膜病毒科或副粘病毒科的成員。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任何一項(xiàng)的用途，其中所述RNA病毒選自由A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、鼻病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、風(fēng)疹病毒、狂犬病病毒、或副流感病毒，以及它們的衍生物或類(lèi)似物或片段組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的用途，其中所述RNA病毒在NSl和/或PBl基因內(nèi)含有修飾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任何一項(xiàng)的用途，其中所述修飾是缺失、置換或插入至少一個(gè)核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任何一項(xiàng)的用途，其中所述病毒是腫瘤消解病毒?！?br> 10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任何一項(xiàng)的用途，其中所述細(xì)胞選自由BSC-1細(xì)胞、LLC-MK細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、鼠類(lèi)細(xì)胞、人細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、RAF細(xì)胞、TCMK細(xì)胞、LLC-PK細(xì)胞、PK15細(xì)胞、W1-38細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、T-FLY細(xì)胞、BHK細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、NSO、PerC6 (人視網(wǎng)膜細(xì)胞)、雞胚細(xì)胞或衍生物、含胚卵細(xì)胞、雞的含胚卵或其衍生物組成的組。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任何一項(xiàng)的用途，其包含病毒生長(zhǎng)提高至少0.1loglO、優(yōu)選至少0.51ogl0、更優(yōu)選至少lloglO、更優(yōu)選至少21ogl0、甚至更優(yōu)選至少2.51ogl0。
12.大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物用于用含有病毒RNA節(jié)段的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞的用途。
13.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染以培養(yǎng)病毒的方法，其使用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物，其包含下列步驟: a)用至少一個(gè)感染性病毒粒子感染細(xì)胞， b)將大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素及其衍生物或類(lèi)似物與胰蛋白酶一起加入到接種物和/或培養(yǎng)基中， c)在適當(dāng)條件下保溫，繼之以 d)收獲所產(chǎn)生的病毒，并且任選 e)純化和/或鑒定該病毒。
14.藥物制劑，包含減毒活病毒和至少一種大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的藥物制劑，其中所述病毒粒子選自由流感病毒和腫瘤消解病毒組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15的藥物制劑用于癌癥的病毒治療或流感感染的治療的用途。
17.從臨床樣品分離病毒的方法，其中 a)在大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物存在的情況下，細(xì)胞用來(lái)自患者呼吸道的病毒粒子感染， b)在大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物存在的情況下，在適當(dāng)?shù)臈l件下保溫細(xì)胞，以促進(jìn)病毒生長(zhǎng)， 并 c)分離和鑒定該病毒。
全文摘要
本發(fā)明描述了大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物作為培養(yǎng)物補(bǔ)充物用于病毒繁殖的用途。此外還公開(kāi)了包含病毒和大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素或其衍生物或類(lèi)似物的藥物組合物，以及利用大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素轉(zhuǎn)染和感染細(xì)胞的方法，以及大環(huán)內(nèi)酯多烯抗生素用于分離來(lái)自臨床樣品的病毒的用途。
文檔編號(hào)A61P31/12GK103232976SQ20131005139
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2007年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月12日
發(fā)明者伊麗莎白.羅思爾, 安德雷杰.埃戈羅夫 申請(qǐng)人:巴克斯特保健股份有限公司