一種治療腫瘤的藥物組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種治療腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥物和一種單抗類藥物組成；本發(fā)明藥物組合物中的自噬調(diào)節(jié)類藥物和單抗類藥物通過聯(lián)合或序貫的方式使用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬能增強(qiáng)單抗類藥物在治療各種腫瘤的療效；并且通過使用細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)類藥物激活/抑制自噬能加強(qiáng)多種單抗類藥物對淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和腦瘤，尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌的療效。
【專利說明】一種治療腫瘤的藥物組合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥、生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及抗腫瘤藥物，具體涉及一種治療腫瘤的藥物組合物，尤其涉及由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥物和一種單抗類藥物組成的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]目前主要用于腫瘤治療的方法仍是化療，然而化療的副作用大，使得單克隆藥物有了巨大的市場和需求。近年來單克隆抗體(McAb，簡稱單抗)治療藥物迅速發(fā)展，一些已經(jīng)被應(yīng)用于臨床或制成診斷試劑盒、和檢測試劑等。其中較為突出的是利妥昔單抗(Rituximab)、chLym-1 單抗和曲妥珠單抗(Trastuzumab)等[Bozhkov B.Monoclonal antibodies—their clinical and diagnostic importance.Vutr Boles.1987; 26 (6):1-9.];如利妥昔單抗用于臨床治療非何杰金淋巴瘤(NHL)，聯(lián)合CHOP方案8個(gè)療程治療侵襲性(彌漫大B細(xì)胞)淋巴瘤，聯(lián)合CVP方案8個(gè)療程一線治療惰性(濾泡性)淋巴瘤，治療復(fù)發(fā)或化療耐藥的惰性B細(xì)胞性非何杰金淋巴瘤[Clark J, LongoD.Monoclonal antibody_therapy of leukemias and lymphomas.J Exp Pathol.1987;3(4):319-27.] ;chlym_l單抗用于治療多種B細(xì)胞惡性淋巴瘤，且有數(shù)據(jù)表明其藥效強(qiáng)于利妥昔單抗，該單抗對特定的HLA-DR陽性的細(xì)胞株如B-35M、Raji, Su-DHL-6等具有較明顯的生長抑制作用，研究表明其主要作用機(jī)理是通過直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)從而殺傷腫瘤細(xì)胞[LiuC， DeNardo Gj Tobin Ej et al.Antilymphoma Effects of Ant1-HLA-DR and CD20Monoclonal Antibodies (Lym-1 and Rituximab) on Human Lymphoma Cells.CancerBiother Radiopharm .2004;19 (5):545-561; Zhang N，Khawli LA, Hu P，et al.Lym-1-1nduced apoptosis of non-Hodgkin’ s lymphomas produces regression oftransplanted tumors.Cancer Biother Radiopharm.2007; 22 (3): 342-356.];曲妥珠單抗(Trastuzumab)用于治療乳腺癌和胃癌[Tahover Ej Sonnenblick A, Peretz Tjet al.Update: adjuvant一trastuzumab一in HER2 positive breast cancer.Harefuah.2012:151 (1):37-42, 61.]等；單克隆抗體類藥物具有特異性好，副作用小，作用機(jī)制較明確等優(yōu)點(diǎn)，并能有效殺傷腫瘤細(xì)胞，然而大部分的單克隆抗體的療效均不如化療藥物明顯。
[0003]細(xì)胞自嗷(autophagy)又稱II 型程序性死亡(type II programmed celldeath)，是真核生物體內(nèi)常見的“自我消化”(cellular degradation)的現(xiàn)象，通常根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔內(nèi)方式的不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬可分為三種方式:大自嗷(macroautophagy)、小自嗷(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自嗷(chaperone-mediated autophagy，CM)。近年來隨著分子生物學(xué)及基因技術(shù)的發(fā)展和對細(xì)胞自噬的深入認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。
[0004]一般來說，由于細(xì)胞自噬有利于細(xì)胞的存活，因此無論在正常細(xì)胞或是腫瘤細(xì)胞中，自噬都普遍被保留下來，并且在一般情況下都維持著基礎(chǔ)自噬。但是自噬究竟是抑制還是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展目前尚沒有定論。研究顯示，自噬初期可以作為腫瘤發(fā)生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且對自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導(dǎo)致原癌細(xì)胞持續(xù)增殖。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。由于自噬在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中所起的作用尚不明確，故其在抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞過程中所起的作用也不盡相同，大致可以概括為兩種:一種是對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)，另一種則是對腫瘤細(xì)胞的殺傷。研究表明化療藥物5-FU能顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且抑制由這3種藥物產(chǎn)生的細(xì)胞自噬能顯著增加腫瘤細(xì)胞對治療的敏感性[Li J, Hou N, FariedA, Tsutsumi S， et al.1nhibition of Autophagy by 3-MA Enhances the Effect of5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771.]。目前細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)類藥物按其對自噬的作用可以分為兩類，一類是自噬誘導(dǎo)劑如；雷帕霉素(Rapamycin),鋰鹽(lithium)和海藻糖(trehalose)等,還有一類則是自曬抑制劑如:3_MA (3-Methyladenine),渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002 等，和 NH4C1、氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine)等。
[0005]迄今為止，尚未見有關(guān)細(xì)胞自噬類調(diào)節(jié)藥物與單克隆抗體藥物制成藥物組合物或復(fù)方藥物聯(lián)合或是序貫給藥治療腫瘤的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種治療腫瘤的藥物組合物，尤其涉及由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥物和一種單抗類藥物組成的藥物組合物。該藥物組合物可以通過調(diào)控單克隆抗體類藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞自噬增強(qiáng)藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而顯著增強(qiáng)單克隆抗體類藥物的療效。
[0007]具體的，本發(fā)明提供了一種治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥 物和一種單抗類藥物組成；該藥物組合物通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬能增強(qiáng)單抗類藥物在治療各種腫瘤的療效；并且通過使用細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)類藥物激活/抑制自噬能加強(qiáng)多種單抗類藥物對淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和腦瘤，尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌的療效。
[0008]本發(fā)明中，所述的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)類藥物，包括細(xì)胞自噬抑制劑和細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑，其特點(diǎn)在于，自身無明顯細(xì)胞毒性或?qū)δ[瘤有輔助殺傷作用并且能進(jìn)一步通過增強(qiáng)/抑制細(xì)胞自噬增強(qiáng)所述單克隆抗體類藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷，增強(qiáng)其療效。
[0009]本發(fā)明中，細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑包括(但不限于):雷帕霉素(Rapamycin)、鋰鹽(lithium)和海藻糖(trehalose)等；本發(fā)明中優(yōu)選雷帕霉素(Rapamycin)。
[0010]本發(fā)明中，細(xì)胞自卩遼抑制劑包括(但不限于):3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine),本發(fā)明中優(yōu)選 3-MA(3-Methyladenine)。
[0011]本發(fā)明中，所述的單克隆抗體藥物包括(但不限于):chLym-1單抗,利妥昔單抗(Rituximab)和曲妥珠單抗(Trastuzumab)等。
[0012]本發(fā)明中，自噬誘導(dǎo)劑或自噬抑制劑中的一種或幾種，如:鋰鹽、海藻糖和/或雷帕霉素，和/或3-MA、渥曼青霉素和/或氯喹與一種單克隆抗體組成治療腫瘤的藥物組合物。
[0013]本發(fā)明的由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥物和一種單抗類藥物組成的藥物組合物，通過聯(lián)合或序貫使用其中的自噬調(diào)節(jié)類藥物和單抗類藥物治療淋巴瘤、胃癌、乳腺癌，肺癌，卵巢癌和腦瘤等腫瘤；尤其是淋巴瘤、胃癌和乳腺癌；所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
[0014]本發(fā)明通過使用一種或者幾種自噬調(diào)節(jié)類藥物，包括自噬抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑，與一種單克隆抗體制成復(fù)方藥物或是組合物，聯(lián)合給藥或是序貫給藥，從而加強(qiáng)了該單抗對腫瘤的療效。
[0015]本發(fā)明進(jìn)行了抑制腫瘤細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)，所述的藥物組合物能通過增強(qiáng)/抑制細(xì)胞自噬增強(qiáng)單克隆抗體類藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷，增強(qiáng)其療效。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:chLym-l單抗能顯著誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的LC3_ II表達(dá)量上調(diào)，
其中,A:經(jīng)過10 μ g/ml的chLym_l單抗處理24小時(shí)后的Raji細(xì)胞的LC3_ II蛋白的表達(dá)；B:LC3-1I蛋白在經(jīng)過/未經(jīng)過O μ g/ml的chLym_l單抗處理的Raji細(xì)胞中表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0017]圖2:激光共聚焦顯微鏡視野下的經(jīng)過chlym-1處理48小時(shí)的Raji細(xì)胞與對照組Raji細(xì)胞。 [0018]圖3:chLym-1單抗能顯著誘導(dǎo)Raji細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的自曬體聚集。
[0019]圖4:經(jīng)過chLym-Ι干預(yù)不同時(shí)間后Raji細(xì)胞中細(xì)胞自曬各通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
[0020]圖5:經(jīng)過不同濃度chLym-Ι干預(yù)后Raji細(xì)胞中細(xì)胞自噬各通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。
[0021]圖6:抑制MEK/Erk通路不能抑制chLym_l單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。
[0022]圖7:通過3-MA抑制自噬能抑制chLym-Ι單抗對Raji細(xì)胞的殺傷作用。
[0023]圖8:通過NH4Cl抑制自噬能抑制chLym-Ι單抗對Raji細(xì)胞的殺傷作用。
[0024]圖9:通過雷帕霉素誘導(dǎo)細(xì)胞自噬能進(jìn)一步增強(qiáng)chLym-Ι對Raji細(xì)胞的殺傷作用。
[0025]圖10:3-MA能顯著抑制chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的增加。
[0026]圖1l = NH4Cl能顯著增加Raji細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的表達(dá)。
[0027]圖12:雷帕霉素能顯著增強(qiáng)Raji細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的表達(dá)。
[0028]圖13:抑制細(xì)胞自噬能抑制chLym-Ι單抗介導(dǎo)的對Raji細(xì)胞的⑶C效應(yīng)。
[0029]圖14:3-MA抑制細(xì)胞自噬能抑制chLym_l單抗介導(dǎo)的對Raji細(xì)胞的ADCC作用。
[0030]圖15:抑制細(xì)胞自噬能顯著減弱chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。
[0031]圖16:利妥昔單抗能顯著地誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。
[0032]圖17:自噬抑制劑3-MA和NH4Cl能增強(qiáng)利妥昔單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。
[0033]圖18:曲妥珠單抗能誘導(dǎo)SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。
[0034]圖19:抑制細(xì)胞自噬能顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗誘導(dǎo)的SKBR3細(xì)胞的生長抑制。[0035]圖20:抑制細(xì)胞自噬能顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗誘導(dǎo)的N87細(xì)胞的生長抑制。
[0036]【具體實(shí)施方式】
[0037]單抗母液的制備:稱取IOmg chLym-Ι單抗的凍干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分?jǐn)嚢璨⒂?.1ym無菌濾器過濾。分裝成10管保存。體外試驗(yàn)時(shí)稀釋至10 μ g/mlο
[0038]利妥昔單抗母液的制備:稱取IOmg利妥昔單抗的凍干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分?jǐn)嚢璨⒂?.1ym無菌濾器過濾。分裝成10管保存。體外試驗(yàn)時(shí)稀釋至 10 μ g/mlO
[0039]曲妥珠單抗母液的制備:稱取IOmg曲妥珠單抗的凍干粉，溶于Iml 0.02M pH=7.4的PBS溶液中。充分?jǐn)嚢璨⒂?.1ym無菌濾器過濾。分裝成10管保存。體外試驗(yàn)時(shí)稀釋至 10 μ g/mlO
[0040]自噬抑制劑藥物配置
(1)氯喹溶液的配制:取適量氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)室稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬
(2)氯化銨溶液的配制:取適量氯化銨溶于水配成0.4mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于4°C。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-80倍用于抑制細(xì)胞自噬。
[0041](3)3-MA溶 液的配制:取適量3-MA溶于無菌水配制成200mM的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過濾除菌后保存于-20°C。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至2mM用于抑制細(xì)胞自噬。
[0042]自噬誘導(dǎo)劑藥物配置
(I)雷帕霉素溶液的配制:將適量雷帕霉素溶解于DMSO中，配成I μ mol/L的儲(chǔ)存液，保存于_20°C，使用時(shí)稀釋至5nM-20nM用于激活細(xì)胞自噬。
[0043](2)鋰鹽的配制:稱取適量LiCl溶于無菌水配制成400mM的儲(chǔ)存液，使用0.1 μ m的無菌濾器過濾除菌后并保存于4°C。使用時(shí)稀釋至5mM用于激活細(xì)胞自噬。
[0044](3)海藻糖溶液的配制:稱取海藻糖溶于去離子水配制成400mM的儲(chǔ)存液，使用0.1ym的無菌濾器過濾除菌后并保存于4°C。使用時(shí)稀釋至20mM-40mM用于激活細(xì)胞自噬。
[0045]細(xì)胞培養(yǎng):細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后，以5*105cellS/ml的濃度轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，各組細(xì)胞分別給予0-10 μ g/ml的chLym-ι單抗、利妥昔單抗或曲妥珠單抗,并在給藥前Ih加入20 μ mol/L的氯喹，5mmol/L的NH4C1或IOnM的雷帕霉素用于抑制或激活Raji細(xì)胞的細(xì)胞自噬。連續(xù)培養(yǎng)48h，以1000r/min離心收集細(xì)胞。
[0046]
實(shí)施例1 chLym-Ι單抗誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的LC3-1I表達(dá)量上調(diào)
收集經(jīng)過10 μ g/ml的chLym-ι單抗處理了 24h的Raji細(xì)胞與對照組Raji用WesternBlot和IP裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果如圖1所示:經(jīng)過10 μ g/ml chLym-1單抗處理了 24h的Raji細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達(dá)量高于對照組，并經(jīng)過灰度處理軟件IQuentTL分析發(fā)現(xiàn)兩者具備極顯著的差異(/7〈0.01)，由于LC3 II的表達(dá)量與自噬體的數(shù)量現(xiàn)正相關(guān)性，LC3 II的表達(dá)量越高，細(xì)胞自噬也就越活躍；結(jié)果表明，chLym-1單抗能顯著地誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自曬；
通過將10 μ g/ml chLym-1單抗處理48h的Raji細(xì)胞與對照組Raji細(xì)胞用Cyto-1D自噬體相關(guān)蛋白LC3-1I蛋白染色試劑染色后通過在激發(fā)波長在560nm的激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示:經(jīng)過10 μ g/ml chLym-Ι單抗處理了 48h的Raji細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在更多的綠色熒光斑點(diǎn)(如圖2所示);綠色熒光斑點(diǎn)的多少取決于自噬體相關(guān)蛋白LC3-1I的表達(dá)水平，與對照組相比，chLym-Ι單抗顯著地誘導(dǎo)了 Raji細(xì)胞的LC3-1I表達(dá)量上調(diào)。
[0047]
實(shí)施例2 chLym-Ι單抗誘導(dǎo)Raji細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的自噬體聚集收集經(jīng)過chLym-Ι單抗干預(yù)24h的Raji細(xì)胞進(jìn)行固定、包埋、切片、染色后在電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示:對照組的Raji細(xì)胞核完整，呈正常的圓形，而經(jīng)過10 μ g/ml chLym-1單抗干預(yù)了 24h的Raji細(xì)胞細(xì)胞核嚴(yán)重變形,在8000 X的放大倍數(shù)下,在核外區(qū)域發(fā)現(xiàn)很多空泡樣結(jié)構(gòu)，在50000X的倍數(shù)下，可以清晰地見到大量明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)(如圖3所示)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自噬體的直徑一般在300多納米到數(shù)微米之間，與本實(shí)施例圖中所示的雙層膜結(jié)構(gòu)空泡的大小吻合，經(jīng)分析確證箭頭所指的雙層膜樣的空泡為自噬體，相比對照組細(xì)胞，在10 μ g/ml chLym-1誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞自噬。
[0048]
實(shí)施例3 chLym-Ι調(diào)控Akt/mTOR，MEK/Erk通路并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬用10 μ g/ml的chLym-Ι單抗處理的Raji細(xì)胞與對照組Raji用Western Blot和IP裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，按每孔60 yg蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果顯示(如圖4，5所示):經(jīng)過不同時(shí)間的和不同濃 度的chLym-Ι單抗處理后Raji細(xì)胞中的p-mT0R,p-Akt的表達(dá)量減弱，此外P-TSC2和P-4E-BP1的表達(dá)量增強(qiáng)，提示chLym-Ι單抗的作用能下調(diào)mTOR信號通路的活性，此外P-Erk的表達(dá)量也有所增強(qiáng)，表明chLym-Ι單抗能上調(diào)MEK/Erk通路的活性；經(jīng)不同時(shí)間和不同濃度的chLym-Ι單抗處理后Raji細(xì)胞中LC3-1I的表達(dá)量均有所增強(qiáng)，表明chLym-Ι單抗誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬；用U0126對MEK/Erk信號通路抑制后檢測抑制MEK/Erk通路后Raji細(xì)胞中LC3-1I的表達(dá)量，結(jié)果顯示:抑制MEK/Erk信號通路的激活并不能減弱chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞中的LC3-1I表達(dá)量的增加(如圖6所示)。證明MEK/Erk信號通路不參與chLym-Ι誘導(dǎo)的細(xì)胞自曬的調(diào)控。
[0049]
實(shí)施例4
抑制細(xì)胞自曬能抑制chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡,激活細(xì)胞自曬能增強(qiáng)chLym_l單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，
將各組Raji細(xì)胞于96孔細(xì)胞板內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)48h后直接加入10 μ IMTT反應(yīng)液，37°C避光孵育4h待MTT與細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶充分反應(yīng)生成甲瓚后加入三聯(lián)液(50%DMF、20%SDS的水溶液)裂解細(xì)胞，37°C孵育6h溶解甲瓚，于570nm處測定各組的0.D值，以對照組的0.D.為100%進(jìn)行細(xì)胞活力百分比換算，并用SPSS statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；采用10 μ g/ml的chLym-ι單抗干預(yù)Raji細(xì)胞,并在給藥前Ih加入3-MA或NH4Cl抑制Raji細(xì)胞的細(xì)胞自噬或雷帕霉素激活細(xì)胞自噬，連續(xù)培養(yǎng)48h后采用MTT法測定細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與對照組相比，經(jīng)過10 μ g/ml chLym-1單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降ip<Q.01)，加入自噬抑制劑3-MA和NH4Cl的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力與單純chLym-Ι單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力相比，有顯著性提高0X0.05，/7〈0.01)(如圖7，8和圖9所示)，證明自曬抑制劑和chLym-Ι單抗的聯(lián)合給藥會(huì)削弱chLym_l單抗的藥效,并且只加抑制劑3-MA和NH4Cl的組的細(xì)胞活力與對照組相比，無顯著差異，說明抑制劑本身對細(xì)胞生長無明顯促進(jìn)作用，結(jié)果表明，自噬抑制劑和chLym-Ι單抗的聯(lián)合給藥所增加的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活性并非是抑制劑和藥物的協(xié)同作用所致，而是抑制自噬后減弱了 chLym-Ι單抗對Raji細(xì)胞的殺傷；加入自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力與單純chLym-Ι單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力相比，有顯著下降0X0.05)，表明增強(qiáng)自噬能增加chLym-Ι對Raji細(xì)胞的殺傷作用。
[0050]
實(shí)施例5抑制和誘導(dǎo)自噬后自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達(dá)水平檢測各組Raji細(xì)胞經(jīng)過離心收集后用RIPA裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，定量后按每孔50 yg蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果3-MA能顯著抑制chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的增加，NH4Cl能顯著增加Raji細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的表達(dá)，雷帕霉素能顯著增強(qiáng)Raji細(xì)胞中的自噬相關(guān)蛋白LC3-1I的表達(dá)(如圖10，圖11和圖12所示)；經(jīng)過IOyg/ml chLym-1單抗處理的Raji細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量均高于對照組,經(jīng)過2mmol/L 3-MA或lmmol/L 3-MA和10μg/ml chLym-Ι單抗處理后的Raji細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量低于10 μ g/ml chLym-Ι單抗處理后的Raji細(xì)胞,而經(jīng)過10 μ g/ml chLym_l單抗和5mmol/L NH4Cl或2.5mmol/L NH4Cl處理后的Raji細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量高于10 μ g/ml chLym-1單抗處理后的Raji細(xì)胞,且經(jīng)過5nmol/L或10nmol/L雷帕霉素和10 μ g/ml chLym-Ι單抗處理后的Raji細(xì)胞的表達(dá)量要高于10 μ g/ml chLym-1單抗處理后的Raji細(xì)胞，結(jié)果表明3-MA和NH4C1能有效抑制chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞自噬，而雷帕霉素能進(jìn)一步增強(qiáng)chLym-1單抗誘導(dǎo)的Ra ji細(xì)胞的細(xì)胞自卩遼。
[0051]
實(shí)施例6抑制細(xì)胞自噬能抑制chLym-Ι單抗介導(dǎo)的對Raji細(xì)胞的CDC效應(yīng)各實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞加入人血清及chLym-Ι單抗后連續(xù)培養(yǎng)2h后用MTT法測定細(xì)胞存活，與對照組相比，經(jīng)過10 μ g/ml chLym-1單抗和5 μ I血清干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降，并且加入2mmol/L 3-MA或5mmol/L NH4Cl抑制細(xì)胞自噬的Raji細(xì)胞的細(xì)胞的活力與單純10 μ g/ml chLym-1單抗和5μ I血清干預(yù)的Raji相比，有顯著性提高(/7〈0.05)(如圖13所示),結(jié)果證明了在chLym-Ι單抗介導(dǎo)⑶C殺傷Raji細(xì)胞的過程中，抑制細(xì)胞自噬能促進(jìn)Raji細(xì)胞的存活，抑制細(xì)胞自噬能削弱在chLym-Ι單抗介導(dǎo)的CDC效應(yīng)，誘導(dǎo)自噬能提高chLym-Ι在淋巴瘤細(xì)胞中介導(dǎo)的CDC效應(yīng)。
[0052]
實(shí)施例7抑制細(xì)胞自噬能抑制chLym-Ι介導(dǎo)的對Raji細(xì)胞的ADCC效應(yīng)各實(shí)驗(yàn)組Raji細(xì)胞(靶細(xì)胞)加入人單個(gè)核細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)及chLym-Ι單抗后連續(xù)培養(yǎng)5h后用CytoTox 96試劑盒測定細(xì)胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放，結(jié)果如圖14所示:各效靶比組的chLym-Ι單抗組的乳酸脫氫酶(LDH)釋放量顯著高于對照組，并呈現(xiàn)出良好的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量比的依賴性，證明chLym-Ι單抗在Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)了顯著的ADCC效應(yīng)(/7〈0.05)，并且在加入PI3K抑制劑2mmol/L 3-MA抑制細(xì)胞自噬后，與chLym-Ι比較，乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量明顯減少(/7〈0.05,/7<0.01)，證明自噬抑制劑3-MA抑制了 chLym-Ι單抗在Raji細(xì)胞中介導(dǎo)的ADCC作用，提示增強(qiáng)自卩遼能增強(qiáng)chLym-Ι單抗在淋巴瘤細(xì)胞中介導(dǎo)的ADCC作用。
[0053]實(shí)施例8抑制細(xì)胞自噬能減弱chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 各組Raji細(xì)胞分別給予O μ g/ml和10 μ g/ml chLym-1單抗，并在給藥前Ih加入
2mmol/L的3-MA和 5mmol/L的NH4Cl抑制Raji細(xì)胞的細(xì)胞自嗤，連續(xù)培養(yǎng)48h后使用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行Annexin V和PI染色后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測處理后的Raji細(xì)胞，結(jié)果顯示，抑制細(xì)胞自曬能顯著減弱chLym-Ι單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞凋亡(如圖15所示),經(jīng)10 μ g/ml chLym-1單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的Anexin V +的細(xì)胞比例顯著高于對照組，10 μ g/ml chLym-1 單抗 +2mmo1 /T, 3-MA 組和 10 μ g/ml chLym-1 單抗 +5mmol/L 的 NH4Cl組的Raji細(xì)胞的Anexin V陽性細(xì)胞比例顯著低于單純10 μ g/ml chLym-1單抗干預(yù)的Raji 細(xì)胞，10 μ g/ml chLym-1 單抗 +2mmo1 /T, 3-MA 組和 10 μ g/ml chLym-1 單抗 +5mmol/L的NH4Cl組的Raji細(xì)胞PI+細(xì)胞比例與10 μ g/ml chLym-1干預(yù)的Raji細(xì)胞相比，無明顯差異，表明抑制Raji細(xì)胞自噬能削弱chLym-Ι單抗所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
[0054]
實(shí)施例9利妥昔單抗能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬
收集經(jīng)10 μ g/ml的利妥昔單抗處理24h的Raji細(xì)胞與對照組Raji細(xì)胞用WesternBlot和IP裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果顯示利妥昔單抗能顯著地誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬(如圖16所示):經(jīng)過10μ g/ml利妥昔單抗處理24h的Raji細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達(dá)量高于對照組，由于LC3 II的表達(dá)量與自噬體的數(shù)量現(xiàn)正相關(guān)性，LC3 II的表達(dá)量越高，細(xì)胞自噬就越活躍，表明利妥昔單抗能顯著地誘導(dǎo)Raji細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。
[0055]
實(shí)施例10抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)利妥昔單抗誘導(dǎo)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞死亡將各組Raji細(xì)胞于96孔細(xì)胞板內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)48h后直接加入10 μ IMTT反應(yīng)液，37°C避光孵育4h待MTT與細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶充分反應(yīng)生成甲瓚后加入三聯(lián)液(50%DMF、20%SDS的水溶液)裂解細(xì)胞，37°C孵育6h溶解甲瓚，于570nm處測定各組的0.D值，結(jié)果顯示自噬抑制劑3-MA和NH4Cl能增強(qiáng)利妥昔單抗誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(如圖17所示):與對照組相比，經(jīng)10 μ g/ml利妥昔單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降01),加入自曬抑制劑3-MA和NH4Cl的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力與單純利妥昔單抗干預(yù)的Raji細(xì)胞的細(xì)胞活力相比，有顯著性降低(/7〈0.05，p<0.01)，證明自噬抑制劑和利妥昔單抗的聯(lián)合給藥會(huì)增強(qiáng)利妥昔單抗的藥效，并且只加抑制劑3-MA和NH4Cl的組的細(xì)胞活力與對照組相比，無顯著差異，說明抑制劑本身對細(xì)胞生長無明顯抑制作用，自噬抑制劑和利妥昔單抗的聯(lián)合給藥所增加的對Raji細(xì)胞的殺傷作用并非是抑制劑和藥物的協(xié)同作用所致，而是抑制自噬后增強(qiáng)了利妥昔單抗對Raji細(xì)胞的殺傷。
[0056]
實(shí)施例11曲妥珠單抗能誘導(dǎo)SKBR3和N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬收集經(jīng)10 μ g/ml的曲妥珠單抗處理48h的SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞與對照組細(xì)胞用Western Blot和IP裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量，按每孔50 μ g蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot,并用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果顯示，曲妥珠單抗能誘導(dǎo)SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬(如圖18所示):經(jīng)過10 μ g/ml曲妥珠單抗處理了 24h的SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞的細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3 II的表達(dá)量均高于對照組，由于LC3 II的表達(dá)量與自噬體的數(shù)量現(xiàn)正相關(guān)性，LC3 II的表達(dá)量越高，細(xì)胞自噬也就越活躍，曲妥珠單抗能顯著地誘導(dǎo)SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬。
[0057]
實(shí)施例12抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)曲妥珠單抗對SKBR3細(xì)胞和N87細(xì)胞的殺傷經(jīng)96h曲妥珠單抗和細(xì)胞自噬抑制劑3-MA或NH4Cl的處理后，SKBR3細(xì)胞和N87的細(xì)胞活力經(jīng)過MTT法檢測，結(jié)果顯示，抑制細(xì)胞自噬能顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗誘導(dǎo)的SKBR3細(xì)胞或N87細(xì)胞的生長抑制(如圖19，20所示):與對照組相比，曲妥珠單抗在作用于N87細(xì)胞和SKBR3細(xì)胞96h后，均能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞生長抑制，3-MA或NH4Cl與曲妥珠單抗的聯(lián)合給藥能進(jìn)一步增強(qiáng)曲妥珠單抗對N87細(xì)胞和SKBR3細(xì)胞的殺傷效果(/7〈0.05，/7〈0.01 )，證明抑制自噬能顯著增強(qiáng)曲妥珠單 抗對乳腺癌SKBR3細(xì)胞和胃癌N87細(xì)胞的殺傷作用。
【權(quán)利要求】
1.一種治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物由一種或多種自噬調(diào)節(jié)類藥物和一種單抗類藥物組成；所述的細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)類藥物包括細(xì)胞自噬抑制劑和細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑。
2.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑選自雷帕霉素(Rapamycin)、鋰鹽(lithium)或海藻糖(trehalose)。
3.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑是雷帕霉素(Rapamycin)。
4.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin Al)、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)或羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
5.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑是 3-MA (3-Methyladenine)。
6.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的單抗類藥物選自chLym-1單抗,利妥昔單抗(Rituximab)或曲妥珠單抗(Trastuzumab)。
7.按權(quán)利要求1所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物中的自噬調(diào)節(jié)類藥物和單抗類藥物通過聯(lián)合或序貫的方式使用。
8.按權(quán)利要求1-7任一的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的腫瘤選自淋巴瘤、胃癌、乳腺癌， 肺癌，卵巢癌或腦瘤。
9.按權(quán)利要求1-7任一的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的腫瘤選自淋巴瘤，胃癌或乳腺癌。
10.按權(quán)利要求8或9所述的治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述的淋巴瘤是何杰金淋巴瘤(HL)或非何杰金淋巴瘤(NHL)。
11.權(quán)利要求1的藥物組合物在制備治療腫瘤的單克隆抗體增效藥物中的用途。
【文檔編號】A61K39/395GK103990127SQ201310052018
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月17日
【發(fā)明者】鞠佃文, 范佳君, 曾賢, 王紹飛, 李玉彬, 王子玉 申請人:復(fù)旦大學(xué)