一種抗腫瘤的增效藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，具體涉及一種抗腫瘤的增效藥物，該增效藥物由一種或多種細(xì)胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復(fù)合物；該增效藥物的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過(guò)使用聯(lián)合給藥或是序貫給藥的方式，通過(guò)抑制精氨酸酶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞自噬而抵消腫瘤由于細(xì)胞自噬而引起的對(duì)精氨酸酶治療的拮抗作用，從而增強(qiáng)重組人精氨酸酶對(duì)腫瘤的殺傷作用，顯著增強(qiáng)精氨酸酶對(duì)腫瘤的治療效果。該增效藥物可用于治療淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌和骨髓瘤。
【專利說(shuō)明】一種抗腫瘤的增效藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，具體涉及一種抗腫瘤的增效藥物，尤其涉及一種由自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成的藥物復(fù)合物。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了目前用于腫瘤治療的化療藥物大多會(huì)產(chǎn)生耐藥性及對(duì)患者有較強(qiáng)的副作用。研究報(bào)道，近幾十年發(fā)展起來(lái)的生物大分子藥物具有高靶向性、高效、低毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，其中的重組人精氨酸酶的抗腫瘤作用得到了廣泛的論證，但其體內(nèi)親和力較低，起效劑量較大，尚存在一些潛在的毒副作用。
[0003]精氨酸酶是哺乳動(dòng)物肝臟中參與尿素循環(huán)的一種關(guān)鍵酶，在尿素循環(huán)中將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥(niǎo)氨酸和尿素，研究顯示，精氨酸是維持部分腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的必需氨基酸，腫瘤細(xì)胞內(nèi)精氨酸水平低于一定值后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究在體外試驗(yàn)中顯示，精氨酸酶能顯著殺傷肝癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞以及白血病細(xì)胞等[①Lam TL，Wong GK, ChongHC, Cheng PN, Choi SC, Chow TL, et al.Recombinant human arginase inhibitsproliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest.Cancer letters.2009;277:91-100.② Hernandez CP, Morrow K, Lopez-Barcons LA,Zabaleta J, Sierra R, Velasco C, et al.Pegylated arginase 1: a potentialtherapeutic approach in T-ALL.Blood.2010; 115:5214-21.?Hsueh EC, Knebel SM,Lo WH, Leung YC, Cheng PN, Hsueh CT.Deprivation of arginine by recombinanthuman arginase in prostate cancer cells.Journal of hematology & oncology.2012:5:17.]精氨酸酶治療肝癌的一期臨床結(jié)果顯示了其良好的 成藥性能[Yau T, ChengPN, Chan P, Chan ff, Chen L, Yuen J, et al.A phase I dose-escalating study ofpegylated recombinant human arginase I (Peg-rhArgl) in patients with advancedhepatocellular carcinoma.1nvestigational new drugs.2012.]盡管在體外顯不出良好的效果，精氨酸酶在體內(nèi)低親和力和較短的半衰期等因素影響了藥物的抗腫瘤療效。因此，進(jìn)一步提高精氨酸酶的抗腫瘤活性將有助于其抗腫瘤應(yīng)用。
[0004]惡性淋巴瘤主要可以分為何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)，其中非何杰金淋巴瘤占絕大多數(shù)。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究組織(International Agency forResearch on Cancer)的數(shù)據(jù)顯示，全世界NHL的發(fā)病率均有所上升，而且發(fā)達(dá)國(guó)家的發(fā)病率明顯高于非洲和亞洲地區(qū)。惡性淋巴瘤的病因復(fù)雜，目前尚未完全研究清楚，遠(yuǎn)期存活率較低。目前最常用的治療方法是R-CHOP方案聯(lián)合美羅華單克隆抗體，然而化療藥物會(huì)給病人帶來(lái)諸多嚴(yán)重的毒副作用以及后遺癥，且大量臨床研究表明病人產(chǎn)生美羅華耐藥性嚴(yán)重以及較高的疾病復(fù)發(fā)率。因此，開(kāi)發(fā)新型高效低毒的治療策略十分緊迫。精氨酸在人體的正常生理功能中具有重要作用，是一種半必須氨基酸，正常體細(xì)胞能夠通過(guò)尿素循環(huán)將其他氨基酸轉(zhuǎn)化為精氨酸，從而抵消外源性精氨酸缺乏；然而，對(duì)于部分精氨酸依賴的腫瘤細(xì)胞，由于缺乏尿素循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在外源性精氨酸剝奪時(shí)，無(wú)法自身合成精氨酸，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。精氨酸酶能夠在體內(nèi)外降解精氨酸，導(dǎo)致精氨酸依賴的腫瘤細(xì)胞死亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響。因此，精氨酸酶的應(yīng)用前景引起有關(guān)研究者的關(guān)注。
[0005]細(xì)胞自卩遼(autophagy)又稱II 型程序性死亡(type II programmed celldeath),是真核生物體內(nèi)常見(jiàn)的“自我消化”(cellular degradation)的現(xiàn)象，通常根據(jù)細(xì)胞內(nèi)底物運(yùn)送到溶酶體腔內(nèi)方式的不同，哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬可分為三種方式:大自卩遼(macroautophagy)、小自卩遼(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自曬(chaperone-mediated autophagy, CMA)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及基因技術(shù)的發(fā)展和對(duì)細(xì)胞自噬的深入認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病，尤其是腫瘤的發(fā)展關(guān)系密切。
[0006]通常，由于細(xì)胞自噬有利于細(xì)胞的存活，無(wú)論在正常細(xì)胞或是腫瘤細(xì)胞中，自噬普遍被保留下來(lái)，并且在一般情況下都維持著基礎(chǔ)自噬。研究顯示，自噬初期可以作為腫瘤發(fā)生的一種抑制因素，一些已知的腫瘤抑制因子，例如PTEN、TSCl和TSC2能激活自噬，并且對(duì)自噬的抑制可使蛋白降解減少，合成代謝增加，最終導(dǎo)致原癌細(xì)胞持續(xù)增殖。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)盡管癌變前自噬能力各有不同，但是在癌變之后其自噬能力均減弱。由于自噬在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中所起的作用尚不明確，故其在抗腫瘤藥物殺傷腫瘤細(xì)胞過(guò)程中所起的作用也不盡相同，大致可以概括為兩種:一種是對(duì)腫瘤細(xì)胞的保護(hù)，另一種則是對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷。研究表明化療藥物5-FU能顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，且抑制由這3種藥物產(chǎn)生的細(xì)胞自噬能顯著增加腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性[Li J，Hou N, FariedA, Tsutsumi S， et al.1nhibition of Autophagy by 3-MA Enhances the Effect of5-FU-1nduced Apoptosis in Colon Cancer Cells.Ann Surg Oncol.2009; 16(3):761 - 771.]。目前細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)類藥物按其對(duì)自噬的作用可以分為兩類，一類是自噬誘導(dǎo)劑如；雷帕霉素(Rapamycin),鋰鹽(lithium)和海藻糖(trehalose)等,還有一類則是自曬抑制劑如:3_MA (3-Methyladenine),渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002 等，和 NH4C1、氯喹(Chloroquine) 和羥基氯喹(hydroxychloroquine)等。
[0007]迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)重組人精氨酸酶誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬以及細(xì)胞自噬抑制劑與重組人精氨酸酶制成抗腫瘤的增效藥物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種抗腫瘤的增效藥物，尤其涉及一種由細(xì)胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成的藥物復(fù)合物。該藥物復(fù)合物，其中的一種或多種細(xì)胞自噬抑制劑，其自身無(wú)明顯細(xì)胞毒性但能通過(guò)抑制細(xì)胞自噬增強(qiáng)重組人精氨酸酶的療效，從而降低重組人精氨酸酶在治療腫瘤時(shí)的用量，減少其潛在的副作用和降低治療成本。
[0009]具體的，本發(fā)明提供了一種抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，該增效藥物由一種或多種細(xì)胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復(fù)合物；該增效藥物的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過(guò)使用聯(lián)合給藥或是序貫給藥的方式，可以通過(guò)抑制精氨酸酶誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞自噬而抵消腫瘤由于細(xì)胞自噬而引起的對(duì)精氨酸酶治療的拮抗作用，從而增強(qiáng)重組人精氨酸酶對(duì)腫瘤的殺傷作用，顯著增強(qiáng)精氨酸酶對(duì)腫瘤的治療效果。
[0010]本發(fā)明的實(shí)施例中，使用細(xì)胞自噬抑制劑能加強(qiáng)重組人精氨酸酶對(duì)肺癌、腦瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤，尤其是淋巴瘤和白血病的療效。
[0011]本發(fā)明中，所述的精氨酸酶選自鼠源精氨酸酶、重組人精氨酸酶以及各種長(zhǎng)效化修飾的精氨酸酶，包括求不限于聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶、唾液酸修飾的重組人精
氨酸酶。
[0012]本發(fā)明中，所述的細(xì)胞自卩遼抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al (Bafilomycin A1)、NH4C1、氯喹(Chloroquine)或羥基氯喹(hydroxychloroquine),優(yōu)選 3-MA (3-Methyladenine)> 氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
[0013]本發(fā)明中，所述的細(xì)胞自噬抑制劑中的一種或幾種與重組人精氨酸酶組成藥物復(fù)合物，通過(guò)序貫使用方式治療腫瘤。本發(fā)明的實(shí)施例中，精氨酸酶通過(guò)誘導(dǎo)淋巴瘤和白血病細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯殺傷腫瘤細(xì)胞，所述的一種或者幾種自噬抑制劑與重組人精氨酸酶，通過(guò)使用聯(lián)合給藥或是序貫給藥的方式，能增強(qiáng)重組人精氨酸酶對(duì)腫瘤的殺傷作用，增強(qiáng)重組人精氨酸酶的療效。
[0014]本發(fā)明所述的腫瘤包括肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、淋巴瘤、白血病、和骨髓瘤。尤其是淋巴瘤、白血病和肝癌。
[0015]所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
[0016]本發(fā)明的增效藥物進(jìn)一步選自以下一組中的形式進(jìn)行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體、納米微球等。
[0017]本發(fā)明進(jìn)行了體外細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果表明:在精氨酸脫亞胺酶殺傷腫瘤細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞自噬能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免于細(xì)胞死亡，從而降低了藥物的療效；重組人精氨酸酶能顯著誘導(dǎo)淋巴瘤和白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬則會(huì)部分抵消精氨酸酶的抗腫瘤效果，當(dāng)使用細(xì)胞自噬抑制劑抑制細(xì)胞自噬則能增加淋巴瘤和白血病細(xì)胞對(duì)重組人精氨酸酶的敏感性，從而增強(qiáng)重組人精氨酸酶的療效。
[0018]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1顯示:重組人精氨酸酶能抑制Raj1、Daudi淋巴瘤細(xì)胞的增殖。
[0020]圖2顯示:重組人精氨酸酶能誘導(dǎo)Raj1、Daudi淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，其中A顯示，給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的典型的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，而對(duì)照組則未發(fā)現(xiàn)顯示，給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的熒光斑點(diǎn)，而對(duì)照組較少。
[0021]圖3顯示，重組人精氨酸酶能顯著降低Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞活力。
[0022]圖4是抑制細(xì)胞自曬后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果。
[0023]圖5顯示抑制自噬能增強(qiáng)重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的Raji和Daudi細(xì)胞凋亡。
[0024]圖6顯示重組人精氨酸酶能誘導(dǎo)Jurkat、HL-60白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬，
其中，A:給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的典型的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，而對(duì)照組則未發(fā)現(xiàn)；B、C:
與對(duì)照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Jurkat和HL-60細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)水平增強(qiáng)。
[0025]圖7顯示，重組人精氨酸酶能顯著降低Jurkat和HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例1:制備重組人精氨酸酶
采用PCR的方法獲得編碼人精氨酸酶的編碼序列，該基因編碼序列全長(zhǎng)969bp，帶有酶切位點(diǎn)XhoI和EcoRI。用XhoI和EcoRI內(nèi)切酶分別雙酶切PCR產(chǎn)物和空質(zhì)粒載體，將目的基因與載體連接后轉(zhuǎn)化氨芐抗性平板，挑取若干個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，取其中一個(gè)擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，進(jìn)行XhoI和EcoRI內(nèi)切酶雙酶切鑒定，提取重組質(zhì)粒，將重組載體用Bgl II酶切使線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)RDB、麗和MD平板篩選，得到表型為his+muts的克隆子，進(jìn)一步在搖床水平上進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)搖床水平上精氨酸酶的
表達(dá)情況，從而篩選分泌表達(dá)精氨酸酶的重組子，從若干株帶有精氨酸酶基因的重組酵母中篩選到分泌表達(dá)精氨酸酶的重組子，樣品純化中，將酵母離心后取上清，樣品經(jīng)過(guò)超濾濃縮，采用凝膠排阻層析進(jìn)行精制，選用Sephacryl S-200作為樣品的精制層析柱；采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，制得的重組精氨酸酶純度約為95%。獲得的重組人精氨酸酶保存于4攝氏度冰箱；試驗(yàn)臨用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至使用濃度。
[0027]實(shí)施例2配制自噬抑制劑藥物
(1)氯喹的配制:取適量氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C， 體外實(shí)驗(yàn)用PRM1-1640培養(yǎng)基稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(2)氯化銨的配制:取適量氯化銨溶于水配成0.4mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-80倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(3)羥基氯喹的配制:取適量羥基氯喹溶于純水配成lOmmol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于4°C，體外實(shí)驗(yàn)室稀釋500-1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(4)3-MA的配制:取適量3-MA干粉配制成0.2mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于_20°C。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-200倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(5)LY294002的配制:取適量LY294002干粉配制成0.2mol/L的儲(chǔ)存液，用0.1 μ m的濾器過(guò)濾除菌后保存于-20°C。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋50-100倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(6)巴伐洛霉素Al的配制:取適量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的儲(chǔ)存液，用
0.1um的濾器過(guò)濾除菌后保存于_20°C，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋1000倍用于抑制細(xì)胞自噬；
(7)自噬抑制劑與精氨酸酶聯(lián)合應(yīng)用于體內(nèi)或體外抗腫瘤時(shí)，自噬抑制劑3-MA的使用濃度范圍為0-1 mol/L,自噬抑制劑CQ的使用濃度范圍為0-50 mol/L，羥基氯喹的使用濃度范圍為0-50 mol/L, LY294002的使用濃度范圍為Ο-lmol/L，巴伐洛霉素Al的使用濃度范圍為O-lOmol/L，精氨酸酶的使用濃度范圍為0-100IU/ml。
[0028]實(shí)施例3:細(xì)胞培養(yǎng)
Raji和Daudi淋巴瘤細(xì)胞使用含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的PRM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞1000轉(zhuǎn)每分鐘離心，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞輕輕吹勻，以2*105cellS/ml的濃度轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，各組細(xì)胞分別給予相應(yīng)濃度的重組人精氨酸酶處理；使用時(shí)，給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和5mmol/L的CQ抑制Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞自噬，連續(xù)培養(yǎng)24h、48h或72h后進(jìn)行下一步處理。
[0029]實(shí)施例4:重組人精氨酸酶能抑制Raj1、Daudi淋巴瘤細(xì)胞的增殖
將適當(dāng)濃度的Raji和Daudi細(xì)胞種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入精氨酸酶使體系終體積為100 μ L，精氨酸酶的終濃度為0.016-4IU/ml的精氨酸酶，培養(yǎng)24h、48h或72h，向每孔加入
10μ MTT液，在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4h，之后用含20% SDS的DMF水溶液溶解，570nm下測(cè)量光密度值(0.D.)，結(jié)果顯示，0.032-4IU/ml的精氨酸酶處理24h、48h或72h顯著地抑制了細(xì)胞的增殖(如圖1A、1B所示)。
[0030]實(shí)施例5:重組人精氨酸酶能誘導(dǎo)Raj1、Daudi淋巴瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬
Raji和Daudi細(xì)胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的典型的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，而對(duì)照組則未發(fā)現(xiàn)(如圖2A所示)；
Raji和Daudi細(xì)胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，用Cyto-1D? AutophagyDetection Kit自噬體染色試劑盒按說(shuō)明書(shū)處理，在激光共聚焦顯微鏡下觀綠色熒光斑點(diǎn)，結(jié)果顯示，給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的突光斑點(diǎn)，而對(duì)照組較少(如圖2B所示)；
將收集到的Raj1、Daudi淋巴瘤細(xì)胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細(xì)胞，并定量后按照每個(gè)泳道20yg進(jìn)行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β -actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色，Raji和Daudi細(xì)胞經(jīng)過(guò)重組人精氨酸酶處理不同時(shí)間或不同濃度處理后，通過(guò)Western Blot的檢測(cè)，結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Raji和Daudi細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)水平增強(qiáng)(如圖2C所示)。
[0031]實(shí)施例6:抑制自噬能增強(qiáng)重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的Raji和Daudi細(xì)胞死亡
Raji和Daudi細(xì)胞分別給予lIU/ml的重組人精氨酸酶，并在給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和5 μ mol/L的CQ抑制細(xì)胞自噬，連續(xù)培養(yǎng)48h后經(jīng)過(guò)MTT法測(cè)定各組的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，重組人 精氨酸酶能顯著降低Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞活力(如圖3所示)，與重組人精氨酸酶單獨(dú)使用組相比，重組人精氨酸酶與自噬抑制劑3-MA或CQ聯(lián)合應(yīng)用組的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降，證明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯(lián)合給藥能更有效地抑制Raji和Daudi細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且只加抑制劑3-MA和CQ組的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異，說(shuō)明抑制劑本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，表明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯(lián)合給藥所降低的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞活性并非是抑制劑和藥物的協(xié)同作用所致，而是因?yàn)橐种谱允珊笤黾恿?Raji和Daudi細(xì)胞對(duì)重組人精氨酸酶的藥物敏感性；結(jié)果證實(shí)，抑制自噬能增加重組人精氨酸酶對(duì)Raji和Daudi細(xì)胞的殺傷作用。
[0032]實(shí)施例7:抑制細(xì)胞自噬后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)
用RIPA裂解液裂解抽取細(xì)胞總蛋白，定量后按每孔50 μ g蛋白量上樣進(jìn)行蛋白電泳并轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western blot，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，結(jié)果顯示:經(jīng)過(guò)lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量高于對(duì)照組，經(jīng)過(guò)2mmol/L 3-MA和lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量低于lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細(xì)胞，而經(jīng)過(guò)lIU/ml重組人精氨酸酶和5 μ mol/L的CQ處理后的Raji和Daudi細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)量高于lIU/ml重組人精氨酸酶處理后的Raji和Daudi細(xì)胞；經(jīng)過(guò)lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細(xì)胞的Cleaved-PARP的表達(dá)量高于對(duì)照組，經(jīng)過(guò)2mmol/L 3-MA或5 μ mol/L的CQ與lIU/ml重組人精氨酸酶聯(lián)合處理后的Raji和Daudi細(xì)胞的Cleaved-PARP的表達(dá)量高于lIU/ml重組人精氨酸酶單獨(dú)處理后的Raji和Daudi細(xì)胞(如圖4所示);基于3-MA是一種PI3K III抑制劑，PI3K III在細(xì)胞自噬的調(diào)控中起重要的作用，其能與Beciln I等分子結(jié)合，參與調(diào)控自噬體膜的運(yùn)輸，因此抑制PI3K III將阻遏自噬體的形成，從而起到抑制細(xì)胞自噬的作用；Western Blot的結(jié)果證明2mmol/L的3-MA能抑制由lIU/ml重組人精氨酸酶所誘導(dǎo)的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞自噬；而CQ是自噬溶酶體的抑制劑，CQ能造成溶酶體的堿化，使溶酶體酶失去活性，從而造成自噬體的堆積，這造成了自噬體無(wú)法在溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解，導(dǎo)致了處于自噬體膜表面的LC3 II分子的量增加，所以Western Blot的結(jié)果能證明5 μ mol/L的CQ能抑制由lIU/ml重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞自噬。PARP是caspase家族蛋白的剪切底物，經(jīng)剪切后變?yōu)槠浼羟行问紺leaved-PARP，Cleaved-PARP的量的多少能直接地反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度，Cleaved-PARP表達(dá)量越多則細(xì)胞凋亡越顯著；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持“抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)人重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的淋巴瘤細(xì)胞凋亡”的結(jié)論。
[0033]實(shí)施例8:抑制自噬能增強(qiáng)重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的Raji和Daudi細(xì)胞凋亡 收集的Raji和Daudi細(xì)胞用PBS洗I次，之后加入500 μ I結(jié)合液和
5 μ IAnexin V -FITC，避光室溫孵育15min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果使用SPSSstatistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Raji和Daudi細(xì)胞經(jīng)過(guò)重組人精氨酸酶和抑制劑處理48小時(shí)經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)lIU/ml重組人精氨酸酶處理的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組，而lIU/ml重組人精氨酸酶與2mmol/L 3-MA或5 μ mol/L的CQ聯(lián)合干預(yù)的Raji和Daudi細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著高于lIU/ml重組人精氨酸酶單獨(dú)處理的Raji 和 Daudi 細(xì)胞 ρ〈0.05，ρ〈0.01，(如圖 5 所示)。
[0034]實(shí)施例9:重組人精氨酸酶能誘導(dǎo)Jurkat、HL-60白血病細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬 Jurkat和HL-60細(xì)胞用lIU/ml的精氨酸酶處理24h后，進(jìn)行石蠟包埋、切片、染色，在
透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，給藥組細(xì)胞內(nèi)有大量的典型的雙層膜結(jié)構(gòu)自噬體，而對(duì)照組則未發(fā)現(xiàn)(如圖6A所示)；
Jurkat和HL-60細(xì)胞用lIU/ml的精氨酸酶處理不同時(shí)間后，將離心收集到的Jurkat和HL-60淋巴瘤細(xì)胞用PBS洗I次，用RIPA試劑盒裂解細(xì)胞，并定量后按照每個(gè)泳道20 μ g進(jìn)行蛋白電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉lh，分別加入LC3b和β-actin抗體，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1.5h，用ECL顯色液顯色。Jurkat和HL-60細(xì)胞經(jīng)過(guò)重組人精氨酸酶處理不同時(shí)間或不同濃度處理后,通過(guò)Western Blot的檢測(cè)，結(jié)果，與對(duì)照組相比，給予重組人精氨酸酶組的Jurkat和HL-60細(xì)胞的LC3 II的表達(dá)水平增強(qiáng)(如圖6B、6C所示)。
[0035]實(shí)施例10:抑制細(xì)胞自噬能增強(qiáng)重組人精氨酸酶誘導(dǎo)的Jurkat和HL-60白血病細(xì)胞死亡
Jurkat和HL-60細(xì)胞分別給予lIU/m I的重組人精氨酸酶，并在給藥前Ih加入2mmol/L的3-MA和10 μ mol/L的CQ抑制細(xì)胞自噬，連續(xù)培養(yǎng)48h后經(jīng)過(guò)MTT法測(cè)定各組的細(xì)胞活力(如圖7所示)，重組人精氨酸酶能顯著降低Jurkat和HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力，與重組人精氨酸酶單獨(dú)使用組相比，重組人精氨酸酶與自噬抑制劑3-MA或CQ聯(lián)合應(yīng)用組的Jurkat和HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活力有顯著性下降，證明自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯(lián)合給藥能更有效地抑制Jurkat和HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且只加抑制劑3-MA和CQ組的細(xì)胞活力與對(duì)照組相比，無(wú)顯著 差異，說(shuō)明抑制劑本身對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯細(xì)胞毒性，自噬抑制劑和重組人精氨酸酶的聯(lián)合給藥所降低的Jurkat和HL-60細(xì)胞的細(xì)胞活性并非是抑制劑和藥物的協(xié)同作用所致，而是因?yàn)橐种谱允珊笤黾恿?Jurkat和HL-60細(xì)胞對(duì)重組人精氨酸酶的藥物敏感性，結(jié)果證實(shí)，抑制自噬能增加重組人精氨酸酶對(duì)Jurkat和HL-60細(xì)胞的殺傷作用。
【權(quán)利要求】
1.一種抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，該增效藥物由一種或多種細(xì)胞自噬抑制劑和重組人精氨酸酶組成藥物復(fù)合物。
2.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自，3-MA (3-Methyladenine)、渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、放線菌酮、巴法洛霉素 Al(Bafilomycin Al )、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)或羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
3.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的細(xì)胞自噬抑制劑選自3-MA (3-Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和羥基氯喹(hydroxychloroquine)。
4.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的精氨酸酶選自鼠源精氨酸酶、重組人精氨酸酶或長(zhǎng)效化修飾的精氨酸酶。
5.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的重組人精氨酸酶以及長(zhǎng)效化修飾的精氨酸酶選自聚乙二醇修飾的重組人精氨酸酶或唾液酸修飾的重組人精氨酸酶。
6.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于，所述的藥物復(fù)合中選自以下一組中的形式進(jìn)行配方:固體、溶液、分散劑、膠束、乳劑、脂質(zhì)體、或納米微球。
7.按權(quán)利要求1所述的抗腫瘤的增效藥物,其特征在于,所述的腫瘤為淋巴瘤、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、乳腺癌或骨髓瘤。
8.按權(quán)利要 求7所述的抗腫瘤的增效藥物，其特征在于所述的淋巴瘤包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
【文檔編號(hào)】A61K45/00GK103990128SQ201310052032
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月17日
【發(fā)明者】鞠佃文, 曾賢, 李玉彬, 范佳君, 王子玉, 王紹飛 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)