肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。所述復(fù)合材料包括二氧化硅-金納米核殼粒子、靶向粘附肽以及阿霉素；所述阿霉素經(jīng)化學(xué)修飾形成SH-PEG-Dox前藥后以Au-S鍵連接在二氧化硅-金納米核殼粒子，所述靶向粘附肽以Au-S鍵連接在二氧化硅-金納米復(fù)合粒子。本發(fā)明材料生物相容性好，具有特定光學(xué)性質(zhì)和良好靶向，能將所載藥物運(yùn)輸?shù)礁伟┘?xì)胞內(nèi)并快速釋放藥物，具有化療和熱療的協(xié)同治療效果。
【專利說明】肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物醫(yī)藥材料科學(xué)的納米生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是一個(gè)全球死亡主要原因之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)道，自2000年以來，每年癌癥發(fā)病率多達(dá)1000萬，死亡人數(shù)高達(dá)740萬，約占所有死亡人數(shù)的13%，其中肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌和乳癌是每年大多數(shù)癌癥死亡的罪魁禍?zhǔn)?。傳統(tǒng)的化學(xué)療法在腫瘤的臨床治療已經(jīng)取得了顯著的成效，但是這些抗癌藥物部具有一定的毒副作用，例如:肝臟和腎臟毒性、脫發(fā)、心臟毒性、惡心、食欲減退等。阿霉素就是這些常用化療藥物的一種，其作用機(jī)理主要是嵌入DNA而抑制核酸的合成，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用，毒副作用主要源于全身性用藥以及藥物缺乏靶向到腫瘤組織的特異性，并造成藥物使用效率低下。如果能夠降低藥物的使用量，卻同時(shí)提高對腫瘤細(xì)胞毒性，則可以減輕藥物的毒副作用。為了提高療效，人們開發(fā)了各種各樣的藥物載體系統(tǒng)，如靶向性納米脂質(zhì)體，聚合物納米材料，樹枝狀聚合物載體都已經(jīng)報(bào)道過。由于肝癌的發(fā)生和形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，所以肝癌組織的結(jié)構(gòu)也是很復(fù)雜的，受限于肝癌的微環(huán)境，造成上述納米材料在肝癌組織內(nèi)分布不均勻，從而影響最終治療效果。例如:盡管肝癌血管有多孔和易滲透的特性，使得納米材料易于滲透到血管外的一些肝癌組織區(qū)域，但是由于血管的滲透壓有限，并且肝癌內(nèi)部組織致密性高，使得大多數(shù)納米材料富集于肝癌血管附近，較少進(jìn)入到肝癌其它或更深的核心區(qū)域，阻止了納米材料藥物載體的治療效果的完 全發(fā)揮。
[0003]熱療也是一種治療肝癌的有效輔助手段，常用的熱源包括熱水浴、灌注、外加磁場、超聲波以及侵入式的微波?，F(xiàn)有技術(shù)中這些方法的缺點(diǎn)就是，肝臟器官位于體內(nèi)較深入部位，上述加入方式只能加熱體表較淺部位，不能夠?qū)χ委焻^(qū)域集中加熱，并且很容易對肝癌周圍的正常組織造成傷害。因此急需一種即可以對肝癌組織內(nèi)部加熱，并可以在肝癌內(nèi)部有效分散并快速釋放化療藥物的新型材料，以解決現(xiàn)有納米藥物載體和熱療手段毒副作用大，治療效果不佳的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提出一種肝癌靶向的載有抗癌藥物阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料。該材料生物相容性好，具有特定光學(xué)性質(zhì)，能夠良好地靶向到肝癌細(xì)胞，將其載有的阿霉素藥物運(yùn)輸?shù)礁伟┘?xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞內(nèi)溶酶體的酸性條件下能夠快速釋放阿霉素，同時(shí)在807nm激光器照射條件下，納米復(fù)合材料產(chǎn)生的熱量可以有效增加Dox的化療效果，顯示出良好的協(xié)同治療效果。
[0005]本發(fā)明提出一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其包括二氧化硅-金納米核殼粒子、靶向粘附肽、以及阿霉素；其中，所述阿霉素經(jīng)化學(xué)修飾形成SH-PEG-Dox前藥后以Au-S鍵連接在所述二氧化硅-金納米核殼粒子，所述靶向粘附肽以Au-S鍵連接在所述二氧化娃-金納米復(fù)合粒子。
[0006]其中，本發(fā)明肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料在近紅外區(qū)700~1200nm具有最大等離子激原共振峰。
[0007]具體地，本發(fā)明肝癌靶向載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料包括三個(gè)功能部分組成:(1)以二氧化硅納米粒子為核、表面包裹金殼的二氧化硅-金納米復(fù)合粒子，納米復(fù)合粒子的粒徑為60-300nm ； (2)化療藥物(如阿霉素)通過SH-PEG-Dox前藥與Au殼形成Au-S鍵連接在納米復(fù)合粒子上；(3)繼而在金殼表面通過巰基連接祀向基團(tuán),例如:肝癌特異性粘附肽A54(序列:AGKGTPSLETTP)。
[0008]其中，所述二氧化硅-金納米復(fù)合粒子包括核以及殼。其中，所述核為二氧化硅納米粒子，所述核的粒徑為50~300nm。所述殼為金。所述殼的厚度為5~30nm ;所述殼通過化學(xué)鍍沉積于所述核的表面。
[0009]其中，所述靶向粘附肽為特異性粘附肽。優(yōu)選地，所述靶向粘附肽為肝癌靶向肽A54。
[0010]其中，所述SH-PEG-Dox前藥包括聚乙二醇、以及通過共價(jià)鍵分別連接在所述聚乙二醇兩端的胱胺和阿霉素。其中，所述聚乙二醇的分子量為1000~lOOOODa。
[0011]本發(fā)明中，SH-PEG-Dox前藥中所含的聚乙二醇(PEG)官能基團(tuán)具有高度生物兼容性、親水性，且能延長了該納米復(fù)合粒子在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。SH-PEG-Dox前藥中，SH為半胱胺基團(tuán)的巰基；PEG為分子量為1000~1000ODa的聚乙二醇；Dox為阿霉素；聚乙二醇兩端通過酯鍵分別連接上阿霉素和半胱胺。
[0012]本發(fā)明復(fù)合材料中，SH-PEG-Dox前藥具有良好的pH敏感性，在正常的生理?xiàng)l件下(pH值7.4)阿霉素很少釋放出來，而當(dāng)pH降低到4.5-6.5時(shí)，由于氨基甲酸酯鍵的斷裂，阿霉素快速釋放。
[0013]本發(fā)明復(fù)合材料中，SH-PEG-Dox前藥的藥物釋放，在模擬溶酶體pH值相近的酸性環(huán)境條件下(醋酸緩沖溶液，PH5.3)，可以快速釋放出阿霉素藥物。
[0014]本發(fā)明復(fù)合材料中，肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，受到波長600~2000nm激光器照射時(shí)，會將含有此納米復(fù)合材料的液體或肝癌組織加熱至40-60攝氏度。具體地，600~2000nm激光器的功率為0.1ff-1Off0
[0015]本發(fā)明復(fù)合材料中，受激光照射后，引起肝癌部位升溫，可以導(dǎo)致納米復(fù)合材料和阿霉素藥物更易于通過血管外滲擴(kuò)散到肝癌組織內(nèi)部。
[0016]本發(fā)明提供了一種新的藥物載體設(shè)計(jì)方法、以及癌癥熱療與化療相結(jié)合的一種協(xié)同治療方案。具體地，例如，是以二氧化硅-金納米核殼材料為載體，在金殼表面修飾上肝癌靶向基團(tuán)以及含有聚乙二醇官能基團(tuán)的阿霉素前藥的復(fù)合納米材料。
[0017] 具體地，例如，本發(fā)明肝癌靶向性的載有阿霉素的納米復(fù)合物-二氧化硅-金納米復(fù)合材料中，SH-PEG-Dox前藥在模擬血流生理環(huán)境條件的pH7.4下較緩慢的Dox釋放，而在模擬細(xì)胞內(nèi)溶酶體的PH5.3下快速的Dox釋放提供了有效和足夠量的藥物釋放在肝癌細(xì)胞和肝癌組織內(nèi)。
[0018]本發(fā)明中，肝癌靶向性載有阿霉素的納米復(fù)合物-二氧化硅-金納米復(fù)合材料的二氧化硅-金納米核殼粒子的最大等離子體激元共振峰在600~2000nm波長范圍內(nèi)，但其受到波長600~2000nm的二極管或三極管激光器照射時(shí)，會將含有此納米復(fù)合材料的液體或肝癌組織加熱至40-60攝氏度。
[0019]本發(fā)明中，肝癌靶向性載有阿霉素的納米復(fù)合物-二氧化硅-金納米復(fù)合材料的靶向基團(tuán)是利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選的肝癌特異性粘附肽A54 (序列:AGKGTPSLETTP)，可以特異性的粘附到肝癌細(xì)胞BEL-7404，BEL-7402，SMCC-7721，相比單克隆抗體，其具有免疫原性小和的生物相容性高等特點(diǎn)。
[0020]本發(fā)明肝癌靶向載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料，既可以通過阿霉素對肝癌細(xì)胞起到化療效果，還可以通過受激光照射的二氧化硅-金納米核殼粒子起到熱療效果，兩者效果的結(jié)合可以有效提高殺死肝癌的效果，減少阿霉素的使用量，通過特異性靶向肝癌組織的作用，減少對正常細(xì)胞的毒副作用。
[0021]本發(fā)明還提出了一種肝癌靶向載阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料的制備方法，先合成二氧化硅-金納米核殼粒子；然后，將已經(jīng)引入了半胱胺基團(tuán)的靶向粘附肽通過與金殼形成Au-S鍵從而鍵合在所述二氧化硅-金納米核殼粒子表面；然后，將SH-PEG-Dox前藥通過與金殼形成Au-S鍵從而鍵合到納米金核殼粒子表面；合成得到目的產(chǎn)物肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料。包括以下合成步驟:
[0022]I)合成二氧化硅-金納米核殼粒子
[0023]按公開技術(shù)合成二氧化硅-金納米核殼粒子，合成方法參考中國專利文件200710040691.8 “一種納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子及其制備”。
[0024]2)合成胱胺 -聚乙二醇-阿霉素化合物(Cys-PEG-Dox)
[0025]采用化學(xué)方法，以聚乙二醇(PEG)作為連接臂，對其兩端進(jìn)行化學(xué)修飾，通過形成共價(jià)鍵在PEG兩端分別引入抗癌藥物阿霉素和含硫基團(tuán)的胱胺基團(tuán)。合成PEG修飾的Dox前藥的過程如圖1所示，首先使用對硝基苯基氯甲酸酯活化PEG兩段的羥基，然后胱胺和抗癌藥物Dox通過PEG鏈上的氯甲酸酯基團(tuán)和Dox上的氨基反應(yīng)化學(xué)結(jié)合到一起,形成Cys-PEG-Dox前藥。合成Cys-PEG-Dox前藥的具體步驟包括:
[0026](I)功能化聚乙二醇(PEG):由于聚乙二醇(PEG)兩端為羥基，反應(yīng)活性不高，所以首先將聚乙二醇(PEG)通過使用對硝基苯基氯甲酸酯(p-NPC)活化，提高其與氨基的反應(yīng)活性。
[0027](2)在連接臂中引入阿霉素:在催化劑作用下，在非質(zhì)子溶劑中阿霉素苯環(huán)上的氨基可以和對硝基苯基氯甲酸酯反應(yīng)，生成氨基甲酸酯鍵，使阿霉素成功鍵合到PEG上。本步驟中，催化劑為吡啶或者三乙胺；非質(zhì)子溶劑包括N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、二氯甲烷、三氯甲烷等。
[0028](3)在連接臂中引入含硫基團(tuán):含硫基團(tuán)以含巰基或二硫鍵的小分子化合物為佳。例如，如果含硫基團(tuán)是巰基，本發(fā)明首先使用胱胺修飾的PEG上，通過二硫鍵S-S保護(hù)巰基的，以利于前藥的保存，在使用前將S-S用還原劑打開，生成-SH。常用的還原劑有巰基乙醇、巰基乙酸、二硫蘇糖醇(DTT)等，優(yōu)選地，還原劑以DTT為在。
[0029]3)合成肝癌靶向載有阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料
[0030](I)制備得以表面鍵合靶向肽的二氧化硅-金納米核殼粒子:即，靶向粘附肽在多肽的固相合成時(shí)就在端基引入半胱胺基團(tuán)，然后通過半胱胺基團(tuán)上硫基與金殼生成穩(wěn)定的Au-S鍵，從而鍵合到納米金核殼粒子表面合成具有靶向性的納米金復(fù)合核殼粒子。離心除去術(shù)反應(yīng)的靶向性粘附肽，沉淀物超聲再分散在二次去離子水中，得到表面鍵合靶向肽的納米金復(fù)合材料。
[0031](2)制備肝癌靶向載有阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料:SP，Cys-PEG-Dox (ImM)水溶液加入DTT還原胱胺的雙硫鍵，生成SH-PEG-Dox，使用透析袋透析除去過量DTT。然后，將其加入到上述步驟(1)制備得到的表面鍵合靶向肽的納米金復(fù)合材料水溶液中，混合，在常溫下攪拌反應(yīng)，離心分離除去過量的SH-PEG-Dox，得到修飾好的肝癌靶向載有阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，最后將修飾好的肝癌靶向性載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料分散于去離子水中。
[0032]本發(fā)明還提出了肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的應(yīng)用。本發(fā)明應(yīng)用中，所述納米復(fù)合材料可以通過表面修飾的靶向性粘附肽主動靶向到肝癌組織，而較少被免疫系統(tǒng)所清除，使得更多的阿霉素有效地到達(dá)需要治療的組織。
[0033]本發(fā)明應(yīng)用中，所述納米復(fù)合材料不僅可以通過表面修飾的靶向性粘附肽主動靶向到肝癌組織，而且可以通過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)由于細(xì)胞溶酶體的酸性環(huán)境，使得阿霉素從PH敏感的聚合物鏈段上釋放下來，快速達(dá)到治療的有效濃度，殺死肝癌細(xì)胞。
[0034]本發(fā)明應(yīng)用中，富集所述納米復(fù)合材料的肝癌組織在受到波長600~2000nm激光器照射后，可以通過等離子激原共振將光能轉(zhuǎn)換成熱能，產(chǎn)生的熱能溫度可達(dá)40-60攝氏度，可以將肝癌細(xì)胞快速殺死。該熱能可以提高阿霉素的藥物療效，可以將化學(xué)療法和光熱療法結(jié)合起來，達(dá)到協(xié)同治療肝癌的目的，有效減少藥物使用量，提高治療效果。而且，該熱能可以使得肝癌組織的血管擴(kuò)張，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，納米復(fù)合材料更易于在肝癌組織中擴(kuò)散。 [0035]具體地，將肝癌細(xì)胞BEL-7402接種于覆有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞與肝癌靶向性載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料共培養(yǎng)，為了研究熱療和化療協(xié)調(diào)治療效果，與肝癌靶向性載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料共培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組:第一組37°C下培養(yǎng)6小時(shí)；第二組先43°C高溫條件下培養(yǎng)0.5小時(shí)后再于37°C下培養(yǎng)
5.5小時(shí)。結(jié)果顯示經(jīng)過43°C熱處理后，與肝癌靶向性載有阿霉素的納米二氧化硅-金納米復(fù)合材料共培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞凋亡和死亡的比例明顯升高，顯示出良好的熱療和化療相結(jié)合的協(xié)同作用。
[0036]本發(fā)明創(chuàng)新地公開了一種對肝癌具有特殊靶向性、且載有pH響應(yīng)阿霉素前藥的納米復(fù)合材料。本發(fā)明復(fù)合材料顯示出良好的PH響應(yīng)釋放藥物的行為，并且可以較穩(wěn)定地存在生理?xiàng)l件下(pH7.4)。
[0037]其次，在溶酶體的低pH值條件下，本發(fā)明復(fù)合材料載有的阿霉素在細(xì)胞內(nèi)能較好地快速釋放出來，達(dá)到有效治療濃度，因此以較少的阿霉素用量就可實(shí)現(xiàn)良好的毒性效果從而殺死癌細(xì)胞。
[0038]此外，熱療毒性實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明納米復(fù)合材料和肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，與37°C孵育條件相比，經(jīng)過43°C熱處理后，與納米復(fù)合材料共培養(yǎng)的癌細(xì)胞凋亡和死亡的比例明顯升高，顯示出本發(fā)明具有良好的熱療和化療相結(jié)合的協(xié)同作用。
[0039]尋找合適的新熱源是近期研究的熱點(diǎn)，本發(fā)明首次創(chuàng)新地提出將二氧化硅-金納米核殼材料的熱療和阿霉素的化療效果結(jié)合起來實(shí)現(xiàn)協(xié)同治療效果，并專門地特別設(shè)計(jì)了合成了 pH敏感的藥物釋放模型和靶向治療模型。
[0040]具體地，本發(fā)明靶向性熱療試劑納米核殼材料結(jié)合化療藥物阿霉素(Dox)的復(fù)合納米材料，以達(dá)到降低藥物毒性，有效增強(qiáng)對治療目標(biāo)的化療效果。
[0041 ] 本發(fā)明中，首先通過氨基甲酸酯鍵分別將胱胺和Dox連接到了親水性聚合物聚乙二醇(PEG)上，二硫蘇糖醇(DTT)還原后合成SH-PEG-Dox前藥，然后通過巰基將連接有Dox的PEG修飾到納米核殼材料上,PEG不僅起到將Dox連接到納米核殼材料上的作用，還可以起到增強(qiáng)納米材料的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，避免納米核殼材料被RES系統(tǒng)吞噬。當(dāng)本發(fā)明納米復(fù)合材料受激光照射后，引起肝癌部位升溫可以導(dǎo)致納米復(fù)合材料和藥物更易于擴(kuò)散到肝癌組織內(nèi)部，從而更有效殺死癌細(xì)胞和腫瘤的核心組織，避免癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。
[0042]研究表明，細(xì)胞質(zhì)和體液pH值為7.4，而內(nèi)涵體、溶酶體等細(xì)胞器的pH值顯酸性。由于SH-PEG-Dox前藥具有良好的pH敏感性，在正常生理?xiàng)l件下(pH值7.4)阿霉素很少釋放出來，而當(dāng)載有Dox的納米復(fù)合材料被細(xì)胞吞噬后在溶酶體內(nèi)立即快速的釋放，這是因?yàn)槿苊阁w內(nèi)的PH值在4.5-6.5之間，而SH-PEG-Dox在此pH值下，連接PEG和Dox的氨基甲酸酯鍵易斷鏈，從而Dox從納米復(fù)合材料上釋放下來，可以在短時(shí)間內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)到達(dá)足夠高的藥物治療濃度，提高肝癌的治療效率。
[0043]此外，納米復(fù)合材料表面修飾具生物活性的靶向性粘附肽，以促使納米復(fù)合材料與肝癌組織特異性結(jié)合，減少其在正常組織中 的含量，減少毒副作用。
[0044]例如，與其它治療系統(tǒng)相比，本發(fā)明肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料顯示出了較多優(yōu)良特性，包括:良好的納米藥物載體功能、PH敏感性的藥物釋放系統(tǒng)、熱療/化療相結(jié)合的協(xié)同治療效果，可以載入阿霉素，可以在低PH值條件下釋放阿霉素。既可以在激光照射下生熱殺死癌細(xì)胞，也可以通過阿霉素的化學(xué)作用殺死癌細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1:SH-PEG-Dox合成路線示意圖。
[0046]圖2:Cys-PEG-Dox 的 1HNMR 譜圖。
[0047]圖3:本發(fā)明肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，I表示納米二氧化硅核，2表示金殼，3表示阿霉素，4表示PEG鏈段，5表示靶向性粘附肽。
[0048]圖4:靶向性粘附肽、二氧化硅-金納米復(fù)合材料、靶向性粘附肽修飾的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的傅立葉變換紅外光譜圖。其中，I表示靶向性粘附肽A54，2表示二氧化硅-金納米復(fù)合材料，3表示靶向性粘附肽修飾的二氧化硅-金納米復(fù)合材料
[0049]圖5:受到激光照射后含納米復(fù)合材料溶液的溫度變化曲線。其中，GNs表示納米二氧化硅-金核殼粒子。
[0050]圖6:pH響應(yīng)的阿霉素的體外釋放圖。
[0051]圖7(A)、7(B)、7(C):修飾有靶向肽的納米復(fù)合材料的TEM照片和粒徑分布柱狀圖。
[0052]圖8:本發(fā)明BEL7402納米復(fù)合材料熱療和化療協(xié)調(diào)治療的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。其中，6表示陰性對照組，7表示不含靶向肽的納米復(fù)合材料組對照組，8表示含靶向肽的納米復(fù)合材料組，“ + ”表示熱治療組，表示無熱療組。[0053]圖9:本發(fā)明BEL7402納米復(fù)合材料熱療和化療協(xié)調(diào)治療的光學(xué)和熒光顯微鏡照片。其中，9表示陰性對照組，10表示含靶向肽的納米復(fù)合材料組，“ + ”表示熱治療組，
表示無熱療組。
【具體實(shí)施方式】
[0054]結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0055]阿霉素體外釋放測定:本發(fā)明采用透析法進(jìn)行體外藥物釋放，稱取Cys-PEG-Dox樣品，溶解后裝入截留分子量1000的透析袋中，置于盛有醋酸鹽緩沖溶液(PH5.3)和磷酸鹽緩沖溶液(PH7.4)離心管中。然后將其置于恒溫振動箱中，37°C，IOOrpm轉(zhuǎn)速條件下，定時(shí)取釋放液，并立即補(bǔ)加等量的緩沖溶液。釋放出的阿霉素的量使用分光光度計(jì)分析其在488nm處吸光強(qiáng)度。
[0056]激光照射納米核殼材料的溫度測定:將含有二氧化硅-金納米復(fù)合粒子的水溶液置于96孔板的一個(gè)孔中，使用功率為1.07W的807nm的近紅外激光器(HPD1010-9MM)距離液面Icm處以垂直角度照射，溶液的溫度變化使用MET-100紅外測溫儀監(jiān)控，同時(shí)以去離子水溶液作為空白對照。
[0057]熒光顯微鏡研究納米復(fù)合材料靶向性和熱療效果:將細(xì)胞接種于覆蓋有蓋玻片的12孔板中，將修飾有靶向肽的納米復(fù)合材料與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，未加納米復(fù)合材料的肝癌細(xì)胞作為陰性對照組，在此基礎(chǔ)上分成正常組和熱療組，接著共培養(yǎng)一段時(shí)間后，取出蓋玻片，使用PBS洗滌，使用PI染色，并使用多聚甲醛固定細(xì)胞，再用PBS洗去殘留的多聚甲醛，甘油封片劑封片后置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。
[0058]納米復(fù)合材料協(xié)同治療效果的評價(jià):為了研究熱療和化療協(xié)同治療效果，使用流式細(xì)胞術(shù)來評價(jià)納米復(fù)合材料的熱療毒性。首先將修飾有靶向肽的納米復(fù)合材料、未修飾靶向肽的納米復(fù)合材料與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，未加納米復(fù)合材料的肝癌細(xì)胞作為陰性對照組，在此基礎(chǔ)上分成正常組和熱療組，在經(jīng)過一段時(shí)間的共培養(yǎng)后將各組癌細(xì)胞用PBS洗滌后，使用Annexin V-FITC和PI染色，并使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur, BDBioscience)分析各組癌細(xì)胞凋亡和死亡情況。
[0059]數(shù)據(jù)處理:本發(fā)明所涉及的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用0rigin8.0和Excel 2003軟件處理,所有的結(jié)果均由平均值土標(biāo)準(zhǔn)差形式顯示。
[0060]本發(fā)明中，SH-PEG-Dox合成路線示意圖如圖1所示。Cys-PEG-Dox的1HNMR譜圖如圖2所示。
[0061]實(shí)施例1:納米二氧化硅-金核殼粒子的制備
[0062] 首先使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷氨化二氧化硅納米粒子表面，接著使用四羥甲基氯化磷還原合成的金納米顆粒來功能化二氧化娃納米材料表面合成種核納米粒子，最后氯金酸溶液在甲醛還原下，溶液中生成大量金納米晶體，然后這些晶體以種核上的金納米顆粒為成核位點(diǎn)生長，最終形成完整的核殼結(jié)構(gòu)的納米二氧化硅-金核殼粒子。本實(shí)施例合成二氧化硅-金納米核殼粒子的具體過程，參考中國專利文件200710040691.8 “一種納米復(fù)合物二氧化硅-金屬核殼粒子及其制備”。
[0063]實(shí)施例2:聚乙二醇二胺(NH2-PEG-NH2)的合成
[0064]PEG — NPC-PEG-NPC
[0065]將PEG2000 (10.0g, IOmmol)和新蒸吡啶(3.955g, 50mmol)加入 70mL 干燥的二氯甲烷(DCM)溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴條件下將溶解在IOmL DCM中的p-NPC (8.07g，40mmol)逐滴加入到反應(yīng)體系中，滴加完畢后，將反應(yīng)液升到常溫條件繼續(xù)反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，p-NPC活化的PEG2000使用預(yù)冷的冰乙醚重沉淀，真空干燥后備用。
[0066]實(shí)施例3:Cys-PEG-Dox 的合成
[0067]將胱胺鹽酸鹽(Cys,0.612g，2.72mmol)和 TEA (0.568g，5.61mmol)溶解于 5mL 的DMF中，在常溫氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下將PEG-NPC(2.787g，0.540mmol)的DMF溶液(IOmL)逐滴加入到燒瓶中，反應(yīng)過夜，反應(yīng)液使用預(yù)冷的冰乙醚重沉淀兩次后真空干燥得Cys-PEG-NPC粗產(chǎn)品。然后將Cys-PEG-NPC (0.2g，0.08mmol)溶解在IOmL DMSO中，再加入50mg的鹽酸阿霉素(0.08mmol)和57 μ LTEA，氮?dú)獗Ｗo(hù)常溫條件下反應(yīng)48小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液中加入30mL水溶液，然后使用截留分子量1000的透析袋透析3天，以除去未反應(yīng)的胱胺和Dox。透析結(jié)束后冷凍干燥得紫紅色的Cys-PEG-Dox干粉。UV-vis檢測Cys-PEG-Dox在488nm處吸收峰強(qiáng)度，測定Cys-PEG-Dox前藥中阿霉素的含量為18.8%。標(biāo)準(zhǔn)曲線由一系列不同濃度溶解在DMSO中的阿霉素來建立。
[0068]實(shí)施例4:合成肝癌靶向肽A54修飾的納米復(fù)合材料 [0069]向?qū)嵤├?制備得到的二氧化硅-金核殼粒子水溶液ImL中(168 X IO11個(gè)/mL)加入100 μ L的多肽Α54水溶液(100 μ Μ)?；旌弦涸诔叵螺p微攪拌3小時(shí)，然后使用截留分子量(MWCO) 3000的超濾離心管離心除去未反應(yīng)的多肽Α54，得到經(jīng)肝癌靶向肽Α54修飾的納米復(fù)合材料。最后將肝癌靶向肽Α54修飾的二氧化硅-金復(fù)合粒子分散于ImL去離子水中，儲藏在4°C冰箱中備用。如圖4所示的傅立葉變換紅外光譜圖，其中，I表示靶向性粘附肽A54，2表示二氧化硅-金納米復(fù)合材料，3表示本實(shí)施例產(chǎn)物靶向性粘附肽修飾的二氧化硅-金納米復(fù)合材料。
[0070]實(shí)施例5:合成阿霉素修飾的復(fù)合納米材料
[0071]在實(shí)施例3得到的Cys-PEG-Dox (ImM)水溶液加入與IOmM DTT還原胱胺的雙硫鍵，生成SH-PEG-Dox。過量的DTT使用截留分子量1000的透析袋透析除去。然后將SH-PEG-Dox加入到實(shí)施例4得到的ImL肝癌靶向肽A54修飾的二氧化硅-金核殼粒子(168 X 1011個(gè)/mL)水溶液中，混合溶液在常溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)，離心分離除去過量的SH-PEG-Dox，得到目的產(chǎn)物肝癌靶向的載有阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，最后將肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料修飾好的分散于ImL去離子水中，儲藏在4°C冰箱中備用。
[0072]實(shí)施例6:阿霉素體外釋放測定
[0073]本實(shí)施例采用透析法進(jìn)行體外藥物釋放，精密稱取二份20mg的Cys-PEG-Dox樣品，溶解后裝入截留分子量1000的透析袋中，分別置于盛有50mL醋酸鹽緩沖溶液(pH5.3)和磷酸鹽緩沖溶液(PH7.4)離心管中。然后將其置于恒溫振動箱中，37°C，IOOrpm轉(zhuǎn)速條件下，定時(shí)取ImL釋放液，并立即補(bǔ)加等量的緩沖溶液。釋放出的阿霉素的量使用分光光度計(jì)分析其在488nm處吸光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線使用PBS緩沖溶液配制的一系列的Dox溶液來標(biāo)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示的pH響應(yīng)的阿霉素的體外釋放圖，表明本實(shí)施例復(fù)合材料載有的阿霉素能較快釋放，以較小阿霉素用量實(shí)現(xiàn)良好毒性效果。
[0074]實(shí)施例7:顯微鏡研究納米復(fù)合材料靶向性
[0075]將3X105個(gè)肝癌細(xì)胞BEL-7402細(xì)胞接種于覆蓋有蓋玻片的12孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，等細(xì)胞覆蓋面積達(dá)到孔板面積的80%時(shí)，吸棄先前的培養(yǎng)基，加入含有肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料培養(yǎng)基(含有10% FBS和I %雙抗)，為了研究熱療和化療的協(xié)同作用，分成兩組，第一組37°C下培養(yǎng)6小時(shí)；第二組43°C下培養(yǎng)0.5小時(shí)后再37°C下培養(yǎng)5.5小時(shí)。接著共培養(yǎng)1-12小時(shí)，未加納米復(fù)合材料的癌細(xì)胞組作為陰性對照組，治療結(jié)束后，取出載有細(xì)胞的蓋玻片，PI染色30-60秒，染色結(jié)束后使用PBS洗滌3次，并使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再用PBS洗去殘留的多聚甲醛，甘油封片劑封片后置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。如圖9所示的BEL7402納米復(fù)合材料熱療和化療協(xié)調(diào)治療的光學(xué)和熒光顯微鏡照片。其中，9表示陰性對照組，10表示含靶向肽的納米復(fù)合材料組，“ + ”表示熱治療組，表示無熱療組。
[0076]實(shí)施例8:納米復(fù)合材料協(xié)同治療效果的評價(jià)
[0077]使用流式細(xì)胞術(shù)來評價(jià)本發(fā)明肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的熱療毒性。首先，將肝癌細(xì)胞BEL-7402接種6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2.5X IO5個(gè)細(xì)胞，在37°C下含有5%濃度CO2潮濕空氣環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)后，為了研究熱療對化療效果的影響，將與肝癌靶向的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料共培養(yǎng)的細(xì)胞分為兩組:第一組37°C下培養(yǎng)6小時(shí)；第二組43°C下培養(yǎng)0.5小時(shí)后再37°C下培養(yǎng)5.5小時(shí)。作為對照，未修飾靶向肽的載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料和未加納米復(fù)合材料的細(xì)胞培養(yǎng)組進(jìn)行同樣的操作處理。培養(yǎng)結(jié)束后，胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，冰冷的PBS洗滌2次，用IXBinding Buffer重懸 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個(gè)/mL，取100 μ L細(xì)胞懸液至5mL流式細(xì)胞管中，加入5 μ LAnnexin V-FITC和5 μ L PI，混勻，室溫避光染色15分鐘，每管再加入 400 μ L 的 Binding Buffer,使用流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur, BD Bioscience)分析細(xì)胞凋亡和死亡情況。如圖8所示的BEL7402納米復(fù)合材料熱療和化療協(xié)調(diào)治療的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果。其中，6表示陰性對照組，7表示不含靶向肽的納米復(fù)合材料組對照組，8表示含靶向肽的納米復(fù)合材料組，“ + ”表示熱治療組，表示無熱療組。
[0078]以上實(shí)施例7和8表明，與37°C孵育條件相比，經(jīng)過43°C熱處理后，與納米復(fù)合材料共培養(yǎng)的癌細(xì)胞凋亡和死亡的比例明顯升高，顯示本發(fā)明具有良好的熱療和化療相結(jié)合的協(xié)同作用。
[0079]實(shí)施例9
[0080]實(shí)施例1中第(I)步中的聚乙二醇2000 (PEG2000)分別用聚乙二醇1000 (PEG1000)、聚乙二醇4000 (PEG4000)替代進(jìn)行功能化修飾，得到不同鏈長的SH-PEG-Dox。
【權(quán)利要求】
1.一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，包括二氧化硅-金納米核殼粒子、靶向粘附肽、以及阿霉素；其中，所述阿霉素經(jīng)化學(xué)修飾形成SH-PEG-Dox前藥后以Au-S鍵連接在所述二氧化硅-金納米核殼粒子，所述靶向粘附肽以Au-S鍵連接在所述二氧化娃-金納米復(fù)合粒子。
2.如權(quán)利要求1所述的肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述復(fù)合材料在近紅外區(qū)700~1200nm具有最大等離子激原共振峰。
3.如權(quán)利要求1所述的肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述二氧化硅-金納米復(fù)合粒子包括核、以及殼；其中，所述核為二氧化硅納米粒子，所述核的粒徑為50~300nm ;所述殼為金,所述殼的厚度為5~30nm ;所述殼通過化學(xué)鍍沉積于所述核的表面。
4.如權(quán)利要求1所述的肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述靶向粘附肽為特異性粘附肽。
5.如權(quán)利要求4所述的肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述靶向粘附肽為肝癌靶向肽A54。
6.如權(quán)利要求1所述的 肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述SH-PEG-Dox前藥包括聚乙二醇、以及通過共價(jià)鍵分別連接在所述聚乙二醇兩端的胱胺和阿霉素。
7.如權(quán)利要求7所述的肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量為1000~lOOOODa。
8.一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的制備方法，其特征在于，合成二氧化硅-金納米核殼粒子；將引入半胱胺基團(tuán)的靶向粘附肽通過與金殼形成Au-S鍵從而鍵合在所述二氧化硅-金納米核殼粒子表面；再將SH-PEG-Dox前藥通過與金殼形成Au-S鍵從而鍵合到納米金核殼粒子表面，合成得到所述肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料。
9.一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于，所述納米復(fù)合材料通過表面修飾的靶向性粘附肽主動靶向到肝癌組織，并通過細(xì)胞吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。
10.一種肝癌靶向載阿霉素的二氧化硅-金納米復(fù)合材料的應(yīng)用，其特征在于，富集所述納米復(fù)合材料的肝癌組織在波長600~2000nm激光器照射后，通過所述納米復(fù)合材料的等離子激原共振將光能轉(zhuǎn)換成熱能。
【文檔編號】A61P35/00GK103990123SQ201310052033
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月17日
【發(fā)明者】劉順英, 梁重時(shí), 謝葉歸 申請人:華東師范大學(xué)