專利名稱：含有非天然氨基酸的突變蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程藥物領(lǐng)域，涉及在BAFF及其突變體中特異性引入非天然氨基酸，以及利用原核生物表達(dá)系統(tǒng)在BAFF中特異性引入非天然氨基酸的方法，突變后的BAFF具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能，可以用于治療自身免疫疾病藥物的制備。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的BAFF是腫瘤壞死家族的第13位成員，于1999年被發(fā)現(xiàn)并克隆成功，又被稱為 BLyS、TALL-l、THANK、TNFSF20、TNFSF13B、ZTNF4 等[1]。BAFF 是體內(nèi) B 細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)因子，通過(guò)與其受體的結(jié)合促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化、增殖與成熟。例如，BAFF與受體BCMA相互作用介導(dǎo)細(xì)胞的存活和增殖以及增強(qiáng)B細(xì)胞的抗原呈遞反應(yīng)；受體TACI則在B細(xì)胞中觸發(fā)IgG和IgA種類轉(zhuǎn)換重組，介導(dǎo)免疫球蛋白的多樣化；BAFF與受體BAFF-R相互作用，則通過(guò)NF-κ B途徑降低前凋亡蛋白的蛋白水平，誘導(dǎo)抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和阻止抑制蛋白的翻譯等，從而調(diào)控細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)分化，同時(shí)也影響T細(xì)胞活動(dòng)。BAFF的特殊功能使其地位十分重要，如果BAFF在體內(nèi)的表達(dá)水平過(guò)多，則將導(dǎo)致B細(xì)胞增生，而B(niǎo)細(xì)胞又會(huì)產(chǎn)生致病的自身抗體，并且負(fù)責(zé)抗原遞呈、抗原展示、產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，并轉(zhuǎn)移至炎癥部位等重要功能，進(jìn)而誘發(fā)疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、紅斑狼瘡綜合征(SLE)、干燥綜合征(SS)等。因此，通過(guò)抑制BAFF活性，阻斷其所誘導(dǎo)的一系列B細(xì)胞活動(dòng)，可以起到治療自身免疫疾病的作用。目前，以BAFF為靶點(diǎn)治療自身免疫疾病的藥物開(kāi)發(fā)思路主要有兩種。一種是制備BAFF特異性抗體，通過(guò)抑制過(guò)表達(dá)的BAFF，從而阻止B細(xì)胞過(guò)度增殖活化，由人類基因組科學(xué)和葛蘭素史克公司研發(fā)的單克隆抗體Belimumab,已于2011年3月被FDA批準(zhǔn)可用于SLE患者的治療(商品名為Benlysta );另一種是制備BAFF的可溶性受體，其可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BAFF,阻斷BAFF所誘導(dǎo)的信號(hào)通路，起到治療自身免疫疾病的作用，由ZymoGenetics公司和默克雪蘭諾公司研發(fā)的融合蛋白Atacic印t，已經(jīng)進(jìn)入II/III期臨床試驗(yàn)。這些藥物的臨床數(shù)據(jù)表明，抑制BAFF的活性可以有效地減緩自身免疫疾病的病癥。然而由于這些藥物只能引起被動(dòng)免疫反應(yīng)，所以都存在著用藥劑量大、副作用多等缺點(diǎn)，Atacicept更是因?yàn)?50mg的高劑量皮下注射用藥對(duì)患者造成嚴(yán)重的不利因素，而導(dǎo)致此部分實(shí)驗(yàn)終止。與被動(dòng)免疫相比，能夠引起機(jī)體產(chǎn)生主動(dòng)免疫反應(yīng)的疫苗類藥物，在用藥量、安全性以及病人依從性方面都具有較大優(yōu)勢(shì)。由于BAFF是自體蛋白，機(jī)體的自身免疫耐受現(xiàn)象成為BAFF疫苗制備的重要障礙，所以提高其免疫原性成為相關(guān)治療性疫苗制備的關(guān)鍵技術(shù)。可以采用目前常用的添加佐劑的方法來(lái)提高免疫原性，但是此方法效果不明顯，難以有效地誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生；又或者可以對(duì)BAFF進(jìn)行改造，融合某些外源的T細(xì)胞抗原表位等來(lái)提高免疫原性，此方法雖能產(chǎn)生抗體，但是對(duì)外源片段要求高，且BAFF的改造位點(diǎn)局限，因此應(yīng)用受限。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明涉及利用原核生物表達(dá)系統(tǒng)，在來(lái)源于人的BAFF或其片段中定點(diǎn)引入非天然氨基酸，利用外源基團(tuán)的高免疫原性，使得突變體能夠突破免疫耐受，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗BAFF抗體。這種突變體有望成為治療自身免疫疾病的候選藥物。技術(shù)方案一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF突變體中的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變成非天然氨基酸。所述的BAFF來(lái)源于人。所述的BAFF突變體包括smBAFF、s Δ BAFF及上述兩種突變體的片段或衍生物。所述的BAFF突 變體包括smBAFF，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。所述的BAFF突變體中非天然氨基酸的突變位點(diǎn)為22Try、52Try、65Try、105Try或119Glu。所述的非天然氨基酸包括對(duì)硝基-L-苯丙氨酸、間硝基-L-苯丙氨酸、鄰硝基-L-苯丙氨酸、3-L-硝基苯丙氨酸、對(duì)氨基-L-苯丙氨酸、間氨基-L-苯丙氨酸、鄰氨基-L-苯丙氨酸或3-L-氨基苯丙氨酸。所述的BAFF突變體中非天然氨基酸的突變位點(diǎn)為22Try、65Try、或119Glu，且所述的非天然氨基酸包括對(duì)硝基-L-苯丙氨酸。利用原核生物系統(tǒng)表達(dá)重組BAFF突變體的方法，其特征在于，所述的BAFF突變體中的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變成非天然氨基酸。所述的重組BAFF突變體用于制備治療自身免疫疾病藥物的應(yīng)用。具體來(lái)說(shuō)BAFF(UniProtKB:Q9Y275.1)在體內(nèi)以膜結(jié)合型和可溶型兩種活性形式存在，二者生物學(xué)活性基本一致。膜結(jié)合型蛋白由285個(gè)氨基酸組成，其中l(wèi)_46aa為胞內(nèi)區(qū)，47-73aa為跨膜區(qū)，74-285aa為胞外區(qū)；可溶型蛋白(sBAFF)由152個(gè)氨基酸(134_285aa)組成，是膜結(jié)合型BAFF在體內(nèi)蛋白酶作用下水解釋放得到的胞外區(qū)片段，也是其發(fā)揮功能的主要區(qū)域。作為疫苗的候選藥物，本發(fā)明涉及的目標(biāo)分子必須在保證其結(jié)構(gòu)與BAFF類似的同時(shí)，還要確保其沒(méi)有生物學(xué)活性，這樣才能有效地解決作為疫苗藥物的安全性問(wèn)題。已有研究表明，217-224aa這八個(gè)氨基酸對(duì)人BAFF活化淋巴細(xì)胞功能至關(guān)重要，當(dāng)這八個(gè)氨基酸被兩個(gè)甘氨酸(GG)殘基替換后所得到的突變體smBAFF(SEQ ID NO:1)只能結(jié)合BAFF受體，而不能活化淋巴細(xì)胞[3]。同時(shí)這八個(gè)氨基酸也可以被替換成兩個(gè)絲氨酸(SS)、絲氨酸甘氨酸(SG)和甘氨酸絲氨酸(GS)等。另外，sBAFF序列中142_160aa丟失后形成sABAFF，此分子也不具備刺激淋巴細(xì)胞的活性，但是可以有效地與受體結(jié)合[4]。所以，smBAFF、s ABAFF或這兩種蛋白的突變體等都可以進(jìn)行非天然氨基酸修飾來(lái)研發(fā)自身免疫疾病藥物，本發(fā)明以smBAFF為例進(jìn)行闡述。以sBAFF的三級(jí)結(jié)構(gòu)為原型(PDB NO:1JH5)，利用Discovery studio軟件對(duì)其進(jìn)行分析。綜合考慮T細(xì)胞表面抗原位點(diǎn)以及在三級(jí)結(jié)構(gòu)中暴露性，預(yù)測(cè)22Tyr、52Tyr、65Tyr、105Tyr、119Glu等可以作為非天然氨基酸的插入位點(diǎn)。本發(fā)明選擇N端22Tyr、中間65Tyr以及C端119Glu進(jìn)行突變，將各位點(diǎn)的原氨基酸突變成對(duì)硝基苯丙氨酸(PNO2Phe)，設(shè)計(jì)突變體 PNO2Phe22SmBAFF(SEQ ID NO:2)、pN02Phe65smBAFF(SEQ IDNO:3)、PNO2Phel11SmBAFF(SEQ IDNO:4)。為了比較硝基對(duì)免疫原性的影響，設(shè)計(jì)65位Tyr突變成Phe的Phe65SmBAFF (SEQ ID NO:5)。利用DNAWORK在線分析軟件對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行大腸桿菌偏愛(ài)密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)，并由Invitrogen公司合成smBAFF(SEQ IDNO:6)目的基因。運(yùn)用oVerlappingPCR技術(shù)在各突變位點(diǎn)引入琥珀密碼子，分別利用引物Pl(SEQ IDNO:11)、22P2 (SEQIDNO:13)、22P3(SEQ IDNO:14)、P4 (SEQ IDNO:12)合成目的基因 smBAFF22 (SEQIDNO:7);利用引物Pl (SEQ ID NO:11)、65P2 (SEQ ID NO:15)、65P3 (SEQ ID NO: 16)、P4 (SEQID NO: 12)合成目的基因 SmBAFF65 (SEQ ID NO:8);利用引物Pl (SEQ ID NO:11)、119P2(SEQID NO:17)、119P3(SEQ ID NO:18)、P4 (SEQ ID NO: 12)合成基因 SmBAFF119 (SEQ ID NO:9)；利用引物 Pl (SEQ ID NO:11)、PheP2(SEQ ID NO: 19)、PheP3 (SEQ ID NO:20)、P4 (SEQ IDNO:12)合成目的基因PhesmBAFF (SEQ ID NO:10)。將合成的目的基因序列smBAFF連接至載體PMD18-T Simple(TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)，經(jīng)南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，獲得帶有正確序列的T-smBAFF,將T-smBAFF與載體pET28a (Novagen,購(gòu)買自Invitrogen公司)分別通過(guò)BamH1、XbaI雙酶切，并用T4DNA Ligase (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)連接，形成表達(dá)載體pET28a-smBAFF。通過(guò)同樣的酶切連接步驟，獲得帶有正確目的基因的pET28a-smBAFF22> pET28a_smBAFF65、pET28a_smBAFF119、pET28a_PhesmBAFF。 待表達(dá)載體完成之后，構(gòu)建能夠利用大腸桿囷表達(dá)系統(tǒng)在BAFF中定點(diǎn)引入pN02Phe的輔助質(zhì)粒。該質(zhì)粒包括來(lái)源于Methanococcusjannaschii屬的抑制性tRNA(tRNATyr)以及氨酰tRNA合成酶(MjTyrRS)。對(duì)tRNATyVMjTyrRS進(jìn)行突變改造及正交性篩選，最終將其構(gòu)建至PACYC184載體(購(gòu)買自Invitrogen公司)中獲得pAC-tRNA-RS輔助載體[5]。將已構(gòu)建好的帶有各目的基因的pET28a表達(dá)載體與輔助載體pAC-tRNA-RS共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素和氯霉素兩種抗生素進(jìn)行雙向篩選，篩選后的單菌落接種于卡那霉素/氯霉素雙抗性的GMML培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。GMML培養(yǎng)基是不含有天然氨基酸的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，可以避免天然氨基酸對(duì)非天然氨基酸插入的干擾。在培養(yǎng)過(guò)程中，添加非天然氨基酸和IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，低溫收集菌體，超聲破碎，離心取上清，利用離子交換和親和層析純化`后即可獲得含有硝基的BAFF突變體。將表達(dá)的各BAFF突變體經(jīng)過(guò)SDS-PAGE、Western_Blotting檢測(cè)鑒定，并且將純化產(chǎn)物進(jìn)行肽質(zhì)量指紋圖譜實(shí)驗(yàn)，證實(shí)各BAFF突變體均在指定位點(diǎn)正確引入相應(yīng)PNO2Phe。經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)確證之后，對(duì)各突變蛋白進(jìn)行體內(nèi)外活性研究。體外實(shí)驗(yàn)選取人外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用淋巴細(xì)胞分離液(購(gòu)買自AXIS-SHIELD)離心分離新鮮人外周血，獲得IO6個(gè)/mL人外周血單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)4小時(shí)后，分別加入羊抗人IgM共刺激劑及各BAFF突變體，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于48h、72h和96h取細(xì)胞液進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，smBAFF原型蛋白不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，而引入硝基的各突變蛋白刺激的細(xì)胞液中均檢測(cè)到了抗體，并且與sBAFF能夠交叉反應(yīng)。因?yàn)槭笕薆AFF的同源性高達(dá)97 %，研究表明人sBAFF注入小鼠體內(nèi)后不能引起IgG的升高，即形成了一個(gè)相對(duì)耐受的環(huán)境，并且研究者們多用小鼠來(lái)研究BAFF在人體免疫體系中的功能，所以本發(fā)明選用BALB/c小鼠進(jìn)行體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)。將各突變蛋白連續(xù)5次給藥，每次相隔時(shí)間一周，自第一次給藥后14天開(kāi)始定期眼眶取血進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠對(duì)人sBAFF同樣形成免疫耐受，在此情況下，硝基基團(tuán)的引入可以明顯提高smBAFF原型蛋白的免疫原性，突破耐受刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，并且產(chǎn)生的抗體與sBAFF有很強(qiáng)的交叉反應(yīng)。有益效果
本發(fā)明涉及在BAFF中引入一些化學(xué)基團(tuán)，如硝基、氨基等，利用這些外源基團(tuán)的高免疫原性提高BAFF蛋白的免疫原性，從而突破免疫耐受，使機(jī)體產(chǎn)生特異性抗BAFF抗體。此方法不受蛋白修飾位點(diǎn)的限制，可以靈活選擇。并且，目前已經(jīng)有一系列研究證實(shí)硝基的引入可以有效提高免疫原性。例如，機(jī)體中某些蛋白在一氧化氮合成酶(iNOs)過(guò)量表達(dá)時(shí)會(huì)發(fā)生酪氨酸殘基的硝化，這些硝化的蛋白可以轉(zhuǎn)化成為自身抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)；以二硝基氟苯與自體癌瘤結(jié)合產(chǎn)生的二硝基酚修飾的自體癌瘤，可以作為自體疫苗治療癌癥；Lani LHardy等用化學(xué)合成的方法將抗原表位肽中的酪氨酸置換成為硝基酪氨酸，發(fā)現(xiàn)硝基酪氨酸的引入明顯影響了 MHC I類限制性抗原表位的識(shí)別。含有化學(xué)基團(tuán)的氨基酸都是非天然氨基酸，一般的化學(xué)修飾方法難以有效地將其引入目標(biāo)蛋白中。而遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)，又稱非天然氨基酸定點(diǎn)改造技術(shù)，該技術(shù)可以通過(guò)對(duì)氨酰tRNA合成酶和tRNA進(jìn)行改造，模擬天然蛋白的翻譯過(guò)程，用生物合成的方法實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)中定點(diǎn)引入含特殊基團(tuán)的非天然氨基酸[2]。這種方法可以對(duì)目標(biāo)蛋白的任意位點(diǎn)進(jìn)行特異性修飾，目前已經(jīng)廣泛運(yùn)用于蛋白質(zhì)工程的研究中。例如，可以利用引入的非天然氨基酸與修飾劑的特異性反應(yīng)，來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白的特異性修飾；利用一些具有光化學(xué)活性的非天然氨基酸來(lái)研究蛋白質(zhì)在體內(nèi)外的功能；或者利用弓I入非天然氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等。本發(fā)明涉及在原核生物中，利用非天然氨基酸定點(diǎn)改造技術(shù)將含有高免疫原性化學(xué)基團(tuán)的非天然氨基酸如對(duì)硝基苯丙氨酸、鄰硝基苯丙氨酸、間硝基苯丙氨酸、三硝基苯丙氨酸、對(duì)氨基苯丙氨酸、鄰氨基苯丙氨酸、間氨基苯丙氨酸、三氨基苯丙氨酸等定點(diǎn)引入到BAFF或其片段中，利用外源基團(tuán)的高免疫原性，在免疫耐受的環(huán)境下刺激機(jī)體產(chǎn)生抗BAFF抗體，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，起到治療自身免疫疾病的作用。


圖 l、pET28a-smBAFF22 載體構(gòu)建圖。A.SmBAFF22Pl 22、P22 138 片段合成 PCR圖。Lanel:P1 22 ；M:150bp Marker ；Lane2:P22 138。B.SmBAFF22 基因 overlappingPCR 結(jié)果圖。M:250bp Marker ；Lane I: SmBAFF22 基因。C.pET28a-smBAFF22 載體酶切及菌落PCR 驗(yàn)證圖。M:250bp M arker ； Lane 1:pET28a_smBAFF22 質(zhì)粒；Lane2:pET28a_smBAFF22 載體酶切驗(yàn)證圖；Lane3:pET28a-smBAFF22載體菌落PCR驗(yàn)證圖。圖 2、PNO2Phe22SmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 及 Western Blotting 結(jié)果圖。
A.PNO2Phe22SmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 結(jié)果圖。M:蛋白 Marker ；Lane I:pN02Phe 存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe 不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。B.pN02Phe22smBAFF 表達(dá) Western Blotting 結(jié)果圖。M:Marker ； Lane I:pN02Phe存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。圖3、PNO2Phe22SmBAFF 純化結(jié)果及 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。A.pN02Phe22smBAFF 純化結(jié)果。
B.PNO2Phe22SmBAFF 的 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。圖4、pET28a-smBAFF65 載體構(gòu)建圖。A.SmBAFF65Pl 65、P65 138 片段合成 PCR圖。M: 150bp Marker ； Lane I:P1 65 ；Lane2:P65 138。B.SmBAFF65 基因 overlappingPCR 結(jié)果圖。M:250bp Marker ;Lane1:SmBAFF65 基因。C.pET28a_smBAFF65 載體酶切及菌落PCR 驗(yàn)證圖。M:250bp Marker ； Lane 1:pET28a_smBAFF65 質(zhì)粒；Lane2:pET28a_smBAFF65 載體酶切驗(yàn)證圖；Lane3:pET28a-smBAFF65載體菌落PCR驗(yàn)證圖。
圖 5、PNO2Phe65SmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 及 Western Blotting 結(jié)果圖。
A.pN02Phe65smBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 結(jié)果圖。M:蛋白 Marker ；Lane 1:宿主菌不經(jīng)過(guò) IPTG誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane3:pN02Phe存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。
B.pN02Phe65smBAFF 表達(dá) Western Blotting 結(jié)果圖。M:Marker ； Lane 1:pN02Phe 存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。圖6、pN02Phe65smBAFF 純化結(jié)果及 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。A.pN02Phe65smBAFF 純化結(jié)果。B.pN02Phe65smBAFF 的 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。圖 7、pET28a-smBAFF119 載體構(gòu)建圖。A.SmBAFF119Pl 119、Pl 19 138 片段合成 PCR 圖。M:150bpMarker ； Lane I:P1 119 ；Lane2:P119 138。B.SmBAFF119 基因overlapping PCR 結(jié)果圖。M:250bp Marker ; Lane 1: SmBAFF119 基因。C.pET28a_smBAFF119載體酶切及菌落 PCR 驗(yàn)證圖。M:250bp Marker ；Lane 1:pET28a_smBAFF119 質(zhì)粒；Lane2:pET28a-smBAFF119 載體酶切驗(yàn)證圖；Lane3:pET28a-smBAFF119 載體菌落 PCR 驗(yàn)證圖。圖 8、PNO2Phe119SmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 及 Western Blotting 結(jié)果圖。
A.PNO2Phe119SmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 結(jié)果圖。M:蛋白 Marker ； Lane I:pN02Phe 存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe 不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。B.pN02Phe119smBAFF 表達(dá) Western Blotting 結(jié)果圖。M:Marker ； Lane I:pN02Phe存在時(shí)表達(dá)結(jié)果；Lane2:pN02Phe不存在時(shí)表達(dá)結(jié)果。圖9、PNO2Phe119SmBAFF 純化結(jié)果及 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。A.pN02Phe119smBAFF 純化結(jié)果。
B.PNO2Phe119SmBAFF 的 PMF 驗(yàn)證結(jié)果。圖 10、pET28a-PhesmBAFF 載體構(gòu)建圖。A.PhesmBAFFPl 65、P65 138 片段合成 PCR 圖。M:15 0bpMarker ； Lane I:P1 65 ；Lane2:P65 138。B.PhesmBAFF 基因overlapping PCR 結(jié)果圖。M:250bp Marker ； Lane 1:PhesmBAFF 基因。C.pET28a_PhesmBAFF載體酶切及菌落 PCR 驗(yàn)證圖。M:250bp Marker ； Lane I:pET28a-PhesmBAFF 質(zhì)粒；Lane2:pET28a_PhesmBAFF 載體酶切驗(yàn)證圖；Lane3:pET28a_PhesmBAFF 載體菌落 PCR 驗(yàn)證圖。圖 ll、PhesmBAFF 表達(dá) SDS-PAGE 及 Western Blotting 結(jié)果圖。A.PhesmBAFF 表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果圖。M:蛋白Marker ；Lane1:誘導(dǎo)前對(duì)照；Lane2:誘導(dǎo)后結(jié)果圖。B.PhesmBAFF表達(dá) Western Blotting 結(jié)果圖。M:Marker ;Lanel:PhesmBAFF 表達(dá) Western Blotting 結(jié)果圖。圖12、PhesmBAFF純化結(jié)果及PMF驗(yàn)證結(jié)果。A.PhesmBAFF純化結(jié)果。B.PhesmBAFF的PMF驗(yàn)證結(jié)果。圖13、各突變蛋白體外刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞液ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖14、各突變蛋白刺激BALB/c小鼠后血清ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步詳述本發(fā)明。說(shuō)明書(shū)及實(shí)施例中采用的菌株、質(zhì)粒、化學(xué)試劑等，如未加特殊說(shuō)明均按常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行操作，或遵照供應(yīng)商提供的說(shuō)明進(jìn)行操作。實(shí)施例1pN02Phe22smBAFF的表達(dá)、純化及鑒定根據(jù)TOB數(shù)據(jù)庫(kù)中BAFF (UniProtKB:Q9Y275.1)氨基酸序列信息，參照大腸桿菌密碼子偏愛(ài)原則，設(shè)計(jì)原型蛋白smBAFF (SEQ ID NO:6)的基因序列,送往Invitrogen公司合成。以原型蛋白基因?yàn)槟０?，運(yùn)用Overlapping PCR技術(shù)將22位氨基酸密碼子突變成琥珀密碼子TAG，合成SmBAFF22 (SEQ ID NO:7)。設(shè)計(jì)引物如下:引物Pl (SEQ ID NO:11):5/ GGATCCGACGACGACGACAA3'引物22P2(SEQ ID NO:13):5' GGTCTAAGAACCCTTTTGGATCGTC3'引物22P3(SEQ ID NO:14):5' TCTTAGACCTTCGTTCCGTGGCTGC3'引物P4(SEQ ID NO:12):5/ CTCGAGTTACAGGAGTTTGA3'將合成的目的基因序列連接至載體pMD18-T Simple (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)，經(jīng)南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，獲得帶有正確序列的T-SmBAFF22。將T-SmBAFF22與載體pET28a(Novagen,購(gòu)買自Invitrogen公司)分別通過(guò)BamH1、XbaI雙酶切，并用T4DNA Ligase (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)連接，形成表達(dá)載體pET28a_smBAFF22。構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，證實(shí)正確連接有大小約為400bp的SmBAFF22，見(jiàn)圖1o
將pET28a-smBAFF22與能夠特異性引入對(duì)硝基苯丙氨酸的輔助質(zhì)粒pAC-tRNA-RS[5]共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素和氯霉素兩種抗生素進(jìn)行雙向篩選，篩選后的單菌落接種于卡那霉素/氯霉素雙抗性的GMML培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD6tltl 0.8時(shí)，加入終濃度為ImM的對(duì)硝基苯丙氨酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳圖顯示在培養(yǎng)基中存在非天然氨基酸時(shí)獲得了大小約為21kD的蛋白，使用鼠抗人BAFF抗體進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示正確表達(dá)了PNO2Phe22SmBAFF蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖2。將獲得的PNO2Phe22SmBAFF培養(yǎng)液，離心取菌體沉淀，超聲破碎，離心取上清，對(duì)上清液進(jìn)行純化。首先將上清液通過(guò)Q Sepharose Fast Flow在AKTA蛋白純化儀的監(jiān)控下，使用含有濃度為0.2M NaCl的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫主蛋白。其次將含有主蛋白的洗脫液通過(guò)N1-NTA進(jìn)行純化，分別采用50mM咪唑、500mM咪唑的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫雜蛋白以及主蛋白。將所得蛋白純化液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖
3。將獲得的突變體純品進(jìn)行肽質(zhì)量圖譜實(shí)驗(yàn)(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心代測(cè))，結(jié)果表明獲得了正確引入對(duì)硝基苯丙氨酸的pN02Phe22smBAFF，見(jiàn)圖3。實(shí)施例2PNO2Phe65SmBAFF的表達(dá)、純化及鑒定以原型蛋白smBAFF(SEQ ID NO:6)基因?yàn)槟０?，運(yùn)用Overlapping PCR技術(shù)將65位氨基酸密碼子突變成琥珀密碼子TAG，合成SmBAFF65 (SEQ ID NO:8)。設(shè)計(jì)引物如下:引物Pl (SEQ ID NO:11):5/ GGATCCGACGACGACGACAA3'引物65P2(SEQ ID NO:15):5' AGCCTACGTCTTGTCGGTGTAGAGC3'引物65P3(SEQ ID NO:16):5' GCTATGGGCCACCTGATTCAGCGTA3'引物P4(SEQ ID NO:12):5/ CTCGAGTTACAGGAGTTTGA3'將合成的目的基因序列連接至載體pMD18-T Simple (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)，經(jīng)南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，獲得帶有正確序列的T-smBAFF65。將T-SmBAFF65與載體pET28a(Novagen,購(gòu)買自Invitrogen公司)分別通過(guò)BamH1、XbaI雙酶切，并用T4DNA Ligase (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)連接，形成表達(dá)載體pET28a_smBAFF65。構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，證實(shí)正確連接有大小約為400bp的SmBAFF65，見(jiàn)圖4。將pET28a-smBAFF65與能夠特異性引入對(duì)硝基苯丙氨酸的輔助質(zhì)粒pAC-tRNA-RS[5]共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素和氯霉素兩種抗生素進(jìn)行雙向篩選，篩選后的單菌落接種于卡那霉素/氯霉素雙抗性的GMML培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD6tltl 0.8時(shí)，加入終濃度為ImM的對(duì)硝基苯丙氨酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳圖顯示在培養(yǎng)基中存在非天然氨基酸時(shí)獲得了大小約為21kD的蛋白，使用鼠抗人BAFF抗體進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示正確表達(dá)了PNO2Phe65SmBAFF蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖5。將獲得的PNO2Phe65SmBAFF培養(yǎng)液，離心取菌體沉淀，超聲破碎，離心取上清，對(duì)上清液進(jìn)行純化。首先將上清液通過(guò)Q Sepharose Fast Flow在AKTA蛋白純化儀的監(jiān)控下，使用含有濃度為0.2M NaCl的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫主蛋白。其次將含有主蛋白的洗脫液通過(guò)N1-NTA進(jìn)行純化，分別采用50mM咪唑、500mM咪唑的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫雜蛋白以及主蛋白。將所得蛋白純化液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖6。將獲得的突變體純品進(jìn)行肽質(zhì)量圖譜實(shí)驗(yàn)(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心代測(cè))，結(jié)果表明獲得了正確引入對(duì)硝基苯丙氨酸的pN02Phe65smBAFF，見(jiàn)圖6。實(shí)施例3PNO2Phe119SmBAFF的表達(dá)、純化及鑒定以原型蛋白smBAFF (SEQIDNO:6)基因?yàn)槟０?，運(yùn)用OverlappingPCR技術(shù)將119位氨基酸密碼子突變成琥珀密碼子TAG，合成SmBAFF119 (SEQ ID NO:9)。設(shè)計(jì)引物如下:$*P1(SEQIDN0:11):5/ GGATCCGACGACGACGACAA3'引物119P2(SEQ ID NO:17):5' GAGCTAGAGTTCGTCGCCTTCTTCG3'
引物119P3(SEQ ID NO:18):5' CTCTAGCTCGCTATTCCGCGTGAGA3'引物P4(SEQ ID NO:12):5/ CTCGAGTTACAGGAGTTTGA3'將合成的目的基因序列連接至載體pMD18-T Simple (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)，經(jīng)南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，獲得帶有正確序列的T-smBAFF119。將T-SmBAFF119 與載體 pET28a(Novagen,購(gòu)買自 Invitrogen 公司)分別通過(guò) BamH1、XbaI雙酶切，并用T4DNA Ligase (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)連接，形成表達(dá)載體pET28a-smBAFF119。構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，證實(shí)正確連接有大小約為 400bp 的 SmBAFF119 見(jiàn)圖 7。將PET28a-smBAFF119與能夠特異性引入對(duì)硝基苯丙氨酸的輔助質(zhì)粒pAC-tRNA-RS[5]共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素和氯霉素兩種抗生素進(jìn)行雙向篩選，篩選后的單菌落接種于卡那霉素/氯霉素雙抗性的GMML培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到OD6tltl 0.8時(shí)，加入終濃度為ImM的對(duì)硝基苯丙氨酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳圖顯示在培養(yǎng)基中存在非天然氨基酸時(shí)獲得了大小約為21kD的蛋白，使用鼠抗人BAFF抗體進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示正確表達(dá)了PNO2Phe119SmBAFF 蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖 8。將獲得的PNO2Phe119SmBAFF培養(yǎng)液，離心取菌體沉淀，超聲破碎，離心取上清，對(duì)上清液進(jìn)行純化。首先將上清液通過(guò)Q Sepharose Fast Flow在AKTA蛋白純化儀的監(jiān)控下，使用含有濃度為0.2M NaCl的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫主蛋白。其次將含有主蛋白的洗脫液通過(guò)N1-NTA進(jìn)行純化，分別采用50mM咪唑、500mM咪唑的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫雜蛋白以及主蛋白。將所得蛋白純化液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖9。將獲得的突變體純品進(jìn)行肽質(zhì)量圖譜實(shí)驗(yàn)(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心代測(cè))，結(jié)果表明獲得了正確引入對(duì)硝基苯丙氨酸的pN02Phe119smBAFF，見(jiàn)圖9。實(shí)施例4Phe65SmBAFF的表達(dá)、純化及鑒定以原型蛋白smBAFF(SEQ ID NO:6)基因?yàn)槟０澹\(yùn)用Overlapping PCR技術(shù)將65位Tyr密碼子突變成Phe密碼子,合成PhesmBAFF (SEQ ID N0:10)。設(shè)計(jì)引物如下:$*P1(SEQIDN0:11):5/ GGATCCGACGACGACGACAA3'引物PheP2(SEQ ID NO:19):5' AGCGAACGTCTTGTCGGTGTAGAGC3'引物PheP3(SEQ ID NO:20):5' GATTCAGCGTAAAAAGGGCGGCTCC3'引物P4(SEQ ID NO:12):5/ CTCGAGTTACAGGAGTTTGA3'將合成的目的基因序列連接至載體pMD18-T Simple (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)，經(jīng)南京思普金生物科技有限公司測(cè)序，獲得帶有正確序列的T-PhesmBAFF。將T-PhesmBAFF 與載體 pET28a(Novagen,購(gòu)買自 Invitrogen 公司)分別通過(guò) BamH1、XbaI雙酶切，并用T4DNA Ligase (TAKARA，購(gòu)買自大連寶生物)連接，形成表達(dá)載體pET28a-PhesmBAFF。構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，證實(shí)正確連接有大小約為 400bp 的 PhesmBAFF，見(jiàn)圖 10。

將pET28a-PhesmBAFF轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用卡那霉素抗生素進(jìn)行篩選，篩選后的單菌落接種于卡那霉素抗性的GMML培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到0D_ 0.8時(shí)，加入終濃度為ImM的對(duì)硝基苯丙氨酸和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳圖顯示獲得了大小約為21kD的蛋白，使用鼠抗人BAFF抗體進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示正確表達(dá)了 Phe65SmBAFF蛋白，結(jié)果見(jiàn)圖11。將獲得的Phe65SmBAFF培養(yǎng)液，離心取菌體沉淀，超聲破碎，離心取上清，對(duì)上清液進(jìn)行純化。首先將上清液通過(guò)Q Sepharose Fast Flow在AKTA蛋白純化儀的監(jiān)控下,使用含有濃度為0.2M NaCl的pH8.0、20mM的Tris-HCl緩沖液洗脫主蛋白。其次將含有主蛋白的洗脫液通過(guò)N1-NTA進(jìn)行純化，分別采用50mM咪唑、500mM咪唑的pH8.0、20mM的Tri s_HCl緩沖液洗脫雜蛋白以及主蛋白。將所得蛋白純化液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖12。將獲得的突變體純品進(jìn)行肽質(zhì)量圖譜實(shí)驗(yàn)(國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心代測(cè))，結(jié)果表明獲得了正確的 Phe65SmBAFF,見(jiàn)圖 12。實(shí)施例5BAFF各突變體體外活性檢測(cè)取新鮮人外周血5mL，按照說(shuō)明書(shū)使用淋巴分離液(購(gòu)買自AXIS-SHIELD)離心分離，最終獲得IO6個(gè)/mL人淋巴單個(gè)核細(xì)胞。將分離獲得的細(xì)胞液平均分裝在六孔板中，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后，分別加入羊抗人IgM共刺激劑2 μ g/mL及smBAFF蛋白20 μ g/mL,或者PNO2Phe22smBAFF、pN02Phe65smBAFF、pN02Phe119smBAFF、Phe65SmBAFF0 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h、72h、96h分別取200 μ L細(xì)胞液，離心取上清進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，smBAFF、PhesmBAFF不能刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗BAFF抗體；而引入硝基的突變蛋白PNO2Phe22smBAFF、pN02Phe65smBAFF、PNO2Phe119SmBAFF刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗體，并且抗體可以與sBAFF交叉反應(yīng)，見(jiàn)圖13。
實(shí)施例6BAFF各突變體體內(nèi)活性檢測(cè)由于鼠人BAFF的同源性高達(dá)97 %，并且研究者們多用小鼠來(lái)研究BAFF在人體免疫體系中的功能，故本發(fā)明選用BALB/c小鼠進(jìn)行體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)。分別用smBAFF、PhesmBAFF、pN02Phe22smBAFF、pN02Phe65smBAFF、pN02Phe119smBAFF 分別免疫 BALB/c 小鼠，第一周將純蛋白液與完全弗氏佐劑以1:1比例混合，以20 μ g/只藥量免疫小鼠，之后連續(xù)四周用蛋白液與不完全弗氏佐劑以1:1比例混合，20yg/只給藥。自第一次給藥后14天開(kāi)始，每隔7天進(jìn)行眼眶采血，離心取血清，運(yùn)用ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示小鼠對(duì)smBAFF、PhesmBAFF免疫耐受，不產(chǎn)生抗體，而引入硝基的pN02Phe22smBAFF、pN02Phe65smBAFF.pN02Phe119smBAFF刺激小鼠后，血清中產(chǎn)生明顯抗體，且產(chǎn)生的抗體可以與BAFF進(jìn)行交叉反應(yīng)，并且隨著給藥時(shí)間的增長(zhǎng)，抗體濃度逐漸增多，證實(shí)突變蛋白可以有效地產(chǎn)生抗BAFF抗體，見(jiàn)圖14。參考文獻(xiàn)1.Schneider BP, MacKay F，Steiner V, et al.BAFF, a novel Ligand of theTumor Necrosis Factor Family,Stimulates B Cells Growth.J Exp Med.1999,189(11):1747-1756.
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權(quán)利要求
1.一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF突變體中的一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變成非天然氨基酸。
2.如權(quán)利要求1所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF來(lái)源于人。
3.如權(quán)利要求2所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF突變體包括smBAFF、s Δ BAFF及上述兩種突變體的片段或衍生物。
4.如權(quán)利要求3所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF突變體包括smBAFF，其氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
5.如權(quán)利要求1-4所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的BAFF突變體中非天然氨基酸的突變位點(diǎn)為22Try、52Try、65Try、105Try或119Glu。
6.如權(quán)利要求5所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于，所述的非天然氨基酸包括對(duì)硝基-L-苯丙氨酸、間硝基-L-苯丙氨酸、鄰硝基-L-苯丙氨酸、3-L-硝基苯丙氨酸、對(duì)氨基-L-苯丙氨酸、間氨基-L-苯丙氨酸、鄰氨基-L-苯丙氨酸或3-L-氨基苯丙氨酸。
7.如權(quán)利要求6所述的一種含有非天然氨基酸的重組BAFF突變體，其特征在于所述的BAFF突變體中非天然氨基酸的突變位點(diǎn)為22Try、65Try、或119Glu，且所述的非天然氨基酸包括對(duì)硝基-L-苯丙氨酸。
8.如權(quán)利要求1-7任意一種重組BAFF突變體用于制備治療自身免疫疾病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程藥物領(lǐng)域，涉及一類能夠參與免疫調(diào)節(jié)的新型BAFF突變體。所述的BAFF突變體涉及使用原核系統(tǒng)表達(dá)的帶有非天然氨基酸的BAFF突變體。這種BAFF突變體可以通過(guò)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，可用于制備治療自身免疫疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P37/02GK103183734SQ20131005519
公開(kāi)日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者姚文兵, 黃捷, 高向東, 陳超, 田浤 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)