專利名稱：高產(chǎn)洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌及其用途和由該紅曲霉菌制備的功能紅曲的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于食品生物技術領域，涉及紅曲霉菌，尤其是一種高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌及其用途和由該紅曲霉菌制備的功能紅曲。
背景技術：
在探尋有效降血脂藥物的科學研究中，日本學者遠藤章和美國學者Albert分別于 1979 和 1980 年在紅曲菌(Monascus ruber)和土曲霉(Aspergillus terreus)中發(fā)現(xiàn)了膽固醇合成抑制劑，他們分別將其命名為莫納可林K (Monacolin k)和Mivinolin。Monacolin K與Mivinolin為結(jié)構(gòu)相同的同一類活性物質(zhì)，國際上后來將這兩種物質(zhì)統(tǒng)一命名為洛伐他汀(Lovastatin)。1985年,遠藤章教授等人從紅色紅曲菌M.ruber中又分離出與 Monacolin K 結(jié)構(gòu)相似的其它活性成分:Monacolin L, MonacolinX, Monacolin M,Dihydromevinolin 和 Dihydromonacolin L,他們被統(tǒng)稱為他汀同系物(Monacolins),它們均具有與Monacolin K類似的降血脂的功能。上述他汀類化合物是一類高效的降脂藥物，它能有效地抑制膽固 醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGCR)的活性，降低人體內(nèi)源性膽固醇合成，減少細胞內(nèi)膽固醇貯存；降低血中低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)的濃度，從而有效地預防動脈粥樣硬化；甚至能逆轉(zhuǎn)動脈粥樣硬化。紅曲是由紅曲菌在米上發(fā)酵而形成，因色澤深紅，稱之為紅曲，味微苦。紅曲菌又稱為紅曲霉，屬于真菌界(The Fungi)真菌門(Eumycota)、子囊菌亞門(Ascomycotina)、不整囊菌綱(Plectomyhcetes)、散囊菌目(Eurtotiales)、紅曲科(Monascaceae)、紅曲菌屬(Monascus Van.tiegh)。紅曲產(chǎn)品在我國有近千年的應用歷史，在20世紀80年代以前，紅曲產(chǎn)品主要由紅曲色素和紅曲酒兩大系列構(gòu)成。80年代后，隨著膽固醇合成抑制劑一Monacolin K在紅曲產(chǎn)品中的發(fā)現(xiàn)，它又被冠以功能紅曲的美譽，其預防保健功效日益受到廣泛關注。近年來有多篇文獻報道顯示功能性紅曲米對于不耐受他汀類藥物治療的患者能起替代治療作用，且其副作用發(fā)生率低于他汀類藥物治療的患者。通過對紅曲進一步的深入研究,人們發(fā)現(xiàn):除了 Monacolin k及其同系物,紅曲菌還能產(chǎn)生多種對人類有益的代謝產(chǎn)物，其中Y -氨基丁酸(簡稱GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。GABA具有降低血壓、輔助治療相關神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,如帕金森癥、老年癡呆癥等功效。當人體內(nèi)缺乏GABA時，會產(chǎn)生焦慮、不安、疲倦、憂慮等情緒，GABA可提升睡眠品質(zhì)，降低失眠的發(fā)生頻率。日本厚生勞動省和臺灣衛(wèi)生署分別于2001年和2005年將GABA成分列為食品，中華人民共和國衛(wèi)生部也于2009年9月27日將GABA列為新資源食品。紅曲中還含有多種其它活性成分:支鏈氨基酸等(減肥)；Dimerumic acid (護肝)；黃酮酹(抗氧化)；紅曲橙色素(抗癌)；麥角固醇(預防骨質(zhì)疏松)等等。紅曲還具有降血糖、抗炎和減肥功效。紅曲中的更多功能因子正逐步被人們挖掘和利用。
1995年，法國學者Blanc等證實一種腎毒性抗生素——桔霉素存在于紅曲產(chǎn)品中，使得紅曲產(chǎn)品的開發(fā)受到了阻礙。為了降低紅曲產(chǎn)品中桔霉素的含量和提高洛伐他汀產(chǎn)量，國內(nèi)外學者進行了從菌種篩選及發(fā)酵工藝調(diào)控到分子水平方面的基礎性研究。2000年，日本厚生勞動省在世界上首次頒布紅曲色素產(chǎn)品中桔霉素的限量標準(0.2mg/kg)，直到2009年9月，臺灣衛(wèi)生署才制定并實施了紅曲產(chǎn)品中的桔霉素限量標準:紅曲色素中桔霉素要求不超過0.2mg/kg (同日本)，原料用紅曲米的桔霉素限量為5 mg/kg。使用紅曲原料制成的食品，其桔霉素限量為2mg/kg。桔霉素在紅曲米中的限量標準是其在紅曲色素中的25倍，這從一個側(cè)面反應了紅曲米中桔霉素的控制難度遠大于紅曲色素。我國是紅曲的發(fā)祥地和使用大國，但至今仍未出臺對國際公認的真菌毒素-桔霉素的限量法規(guī)。因此，急需一種同時兼具高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸、低產(chǎn)色素并不產(chǎn)或極低產(chǎn)桔霉素特性的紅曲霉菌及由該紅曲霉菌制備的功能紅曲。通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關的公開專利公開文獻。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的 在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種高產(chǎn)洛伐他汀和Y -氨基丁酸；不產(chǎn)、極低產(chǎn)桔霉素，無苦味，并具有低產(chǎn)紅曲色素的紅曲霉菌，由該紅曲霉菌制備的功能紅曲可以應用在制備降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中。本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術方案如下:一種高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌,名稱為:C002，分類命名為:紅曲(Monascus sp.)，保藏編號為=CGMCC N0.6860，保藏日期:2012年11月26日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。利用上述紅曲霉菌制備的功能紅曲。而且，所述功能紅曲的制備步驟如下:固體發(fā)酵培養(yǎng)基厚度f 8cm，冷卻至室溫后將孢子懸液濃度為10卜108的紅曲霉菌種子液按體積質(zhì)量比ml/g為1(Γ25%的接種量混合入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3(T37°C培養(yǎng)3 10天，轉(zhuǎn)入2(T27°C培養(yǎng)2飛周，濕度40 80%，發(fā)酵結(jié)束后，置于4(T70°C干燥，即得功能紅曲。而且，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法為:將糧食培養(yǎng)基分別與水按質(zhì)量體積比g:ml為1:1 3的比例浸泡過夜，121°C滅菌20min。而且，所述糧食培養(yǎng)基為大米、黃米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麥、豌豆、糜子或苡米中的一種或幾種的混合物。而且，所述糧食培養(yǎng)基按糧食培養(yǎng)基:麥麩或米糠或豆柏的重量比為廣10:1的比例將糧食培養(yǎng)基與麥麩或米糠或豆柏進行復配。而且，所述紅曲霉菌種子液的制備方法如下:種子液培養(yǎng)基為葡萄糖l(T60g/L，蛋白胨 10 40g/L，NaNO3 I 10g/L，MgS04.7H20 I 5g/L，KH2PO4 0.1 10g/L，向種子液培養(yǎng)基中接種紅曲霉菌CGMCC N0.6860后，于14(T220rpm，3(T37°C培養(yǎng)12 24小時，得紅曲霉菌種子液。
而且，所述功能紅曲中無桔霉素或桔霉素含量< 5(^g/kg ;紅曲不產(chǎn)或低產(chǎn)紅曲色素；所述紅曲中洛伐他汀含量為:Tl2mg/g，Y-氨基丁酸含量為疒5 mg/g ;所述低產(chǎn)紅曲色素的紅曲色素色調(diào)為淡黃色，4IOnm測定黃色素的色價< 20U/g。如上所述的紅曲霉菌在制備降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。如上所述的功能紅曲在制備降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點是:1、本發(fā)明的紅曲霉菌具有高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸；不產(chǎn)、極低產(chǎn)桔霉素，無苦味，并具有低產(chǎn)紅曲色素的特點，紅曲霉菌CGMCC N0.6860菌株可利用包括大米、黃米、玉米、木薯等多種培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)功能性紅曲；該紅曲霉菌的低產(chǎn)紅曲色素的特性尤其適合相關功能性飲料的產(chǎn)品開發(fā)。2、本發(fā)明紅曲霉菌制備得到的功能紅曲主要功能性成分含有洛伐他汀3-12mg/g，Y -氨基丁酸(GABA)含量2-5 mg/g,桔霉素含量< 5(^g/kg，具有抑制腫瘤細胞增殖的功效；該功能性紅曲可用于開發(fā)有助于降血脂和改善睡眠的保健食品，應用于制備功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中。


圖1為本發(fā)明紅曲菌株CGMCC N0.6860在不同培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)圖；其中，A為黃米培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)圖，B為燕麥培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)圖，C為玉米培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)圖，D為大米培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)圖。圖2為本發(fā)明紅曲菌株CGMCC N0.6860發(fā)酵大米功能紅曲產(chǎn)品的實物照片；其中圖2-1為發(fā)酵大米功能紅曲上層俯視圖片，其中圖2-2為發(fā)酵大米功能紅曲底層俯視圖片。圖3為本發(fā)明紅曲霉菌CGMCC N0.6860發(fā)酵大米的功能紅曲產(chǎn)品乙醇提取液照片。該圖顯示低色價的功能紅曲其乙醇提取物淡黃色的色調(diào)。該色調(diào)非常適合于相關功能飲料的開發(fā)。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供一種紅曲屬紅曲霉(Monascus sp.)及其發(fā)酵制備的功能性紅曲。本發(fā)明提供的紅曲菌株具有高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸；不產(chǎn)、極低產(chǎn)桔霉素；無苦味；并具有低產(chǎn)紅曲色素的特點。該功能性紅曲主要功能性成分含有洛伐他汀3-12mg/g，Y -氨基丁酸(GABA)含量2-5 mg/g，桔霉素含量< 5(^g/kg; CGMCC N0.6860菌株可利用包括大米、黃米、玉米、木薯等多種培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)功能性紅曲；CGMCC N0.6860菌株發(fā)酵生產(chǎn)的功能性紅曲具有抑制腫瘤細胞增殖的效果；采用CGMCC N0.6860菌株生產(chǎn)的功能性紅曲可用于開發(fā)有助于降血脂和改善睡眠的保健食品；其低產(chǎn)紅曲色素的特性尤其適合相關功能性飲料的產(chǎn)品開發(fā)。一種高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌,名稱為:C002，分類命名為:紅曲(Monascus sp.)，保藏編號為=CGMCC N0.6860，保藏日期:2012年11月26日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。紅曲霉菌CGMCC N0.6860的形態(tài)學特征為:在大米、黃米、玉米、木薯、莜麥、豌豆、
黃豆、糜子、苡米等多種糧食培養(yǎng)基上菌絲體呈白色，無色素分泌或分泌到培養(yǎng)基中的色素呈淡黃色，見圖1。在黃米培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基和大米培養(yǎng)基4種培養(yǎng)基上紅曲菌株CGMCC N0.6860菌絲皆呈現(xiàn)白色，僅有少許淡黃色色素分泌到培養(yǎng)基質(zhì)中。光學顯微鏡觀察菌絲無色、有分枝及橫隔、多核；分生孢子單生或成鏈，球形或梨形；子囊球形；子囊孢子卵圓形、光滑、無色或淡黃色。上述的紅曲霉菌CGMCC N0.6860的篩選方法步驟如下:
稱取10克紅曲米粉(來源于福建泉州市集貿(mào)市場)，加入到90ml帶玻璃珠的無菌生理鹽水中，振搖10分鐘，10倍梯度稀釋。吸取0.1ml稀釋液涂布于馬鈴薯蔗糖(PDA)分離培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)3-7天，挑取單菌落轉(zhuǎn)移接種到新的分離培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)反復分離純化得到純化的紅曲菌株CGMCC N0.6860。上述紅曲霉菌CGMCC N0.6860制備紅曲的步驟如下:種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10 60g,蛋白胨10 40g, NaNO3 I 10g, MgS04.7H20I 5g，KH2PO4 0.1 10g，接種量3-5% (體積比，ml/ml)紅曲霉菌CGMCC N0.6860后，于14(T220rpm，3(T37°C培養(yǎng)12 24小時，得紅曲霉菌種子液。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:將大米等糧食培養(yǎng)基(糧食培養(yǎng)基為大米、黃米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麥、豌豆、糜子或苡米中的一種或幾種的混合物)分別與水以質(zhì)量體積比為1:廣3的比例浸泡過夜，121°C滅菌20min ；其中，也可將糧食培養(yǎng)基按重量比為f 10:1的比例將糧食培養(yǎng)基與麥麩、米糠或豆柏進行復配。固態(tài)發(fā)酵制備紅曲:固體發(fā)酵培養(yǎng)基厚度f 8cm，物料冷卻至室溫后將制備好的紅曲霉菌種子液(孢子懸液濃度IO6-1O8)按10-25% (體積質(zhì)量比，ml/g)的接種量混合入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3(T37°C培養(yǎng)3 10天，轉(zhuǎn)入2(T27°C培養(yǎng)2飛周，濕度40_80%，發(fā)酵結(jié)束后，置于4(T70°C干燥，即獲得功能紅曲。本發(fā)明紅曲菌株CGMCC N0.6860發(fā)酵大米功能紅曲產(chǎn)品的實物照片見圖2 ;其中圖2-1為發(fā)酵大米功能紅曲上層俯視圖片，其中圖2-2為發(fā)酵大米功能紅曲底層俯視圖片:顯示發(fā)酵大米產(chǎn)品表面呈現(xiàn)白色或微弱的淡黃色的低色價紅曲的特點。本發(fā)明紅曲霉菌CGMCC N0.6860發(fā)酵大米的功能紅曲產(chǎn)品乙醇提取液照片見圖3，該圖顯示低色價的功能紅曲其乙醇提取物淡黃色的色調(diào)。該色調(diào)非常適合于相關功能飲料的開發(fā)。實施例1種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖30_60g，蛋白胨 10_20g，NaNO3 5-10g, MgS04.7H20l-5g, KH2PO4 l-10g，接種紅曲霉菌CGMCC N0.6860后，于180rpm，37°C培養(yǎng)12小時，得種子液。固體發(fā)酵培養(yǎng)基:將大米與水以質(zhì)量體積比為1:廣3的比例浸泡過夜，121°C滅菌20mino固態(tài)發(fā)酵制備紅曲:固體發(fā)酵培養(yǎng)基厚度2_5cm，物料冷卻后將制備好的種子液按10%的接種量混合入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3-5天，轉(zhuǎn)入2(T27°C培養(yǎng)2 4周，濕度5(Γ80%。發(fā)酵結(jié)束后，置于70°C干燥，即可獲得功能紅曲。紅曲霉CGMCC N0.6860制備的功能紅曲中Monacolin k含量測定:高效液相色譜條件為:Agilent TC一18 (250mm X 4.6mm, 5 μ m)色譜柱；流動相:乙腈:7jC =6:4 ;檢測器:紫外檢測器；檢測波長:λ =237 nm ;柱溫:室溫;流速:lmL/min ;進樣量:20 μ L0樣品處理:準確稱取0.5000g紅曲干燥樣品(過100目篩)，置于20mL離心管中，加入8mL 75 %乙醇,超聲30 min, 3000r/min離心IOmin,重復3次,合并上清液,容量瓶使用蒸餾水定容至25mL，靜置30 min，經(jīng)0.22μπι濾膜過濾后待測。檢測結(jié)果見表I。紅曲霉CGMCC N0.6860制備的功能紅曲中GABA含量測定:高效液相色譜條件:AgilentEclipse AAA (1 50mm X 4.6mm, 5 μ m)色譜柱；米用梯度洗脫:流動相A:1.6 %。醋酸鈉，冰醋酸調(diào)PH7.2;流動相B:甲醇:乙腈:1.6 %。醋酸鈉=45:45:10，冰醋酸調(diào)pH 7.2 ;(T2min流動相B為20%，2 18min流動相B由20%上升至100%，然后維持4 min, 22 26min流動相B由100%降至20%。檢測器:紫外檢測器；檢測波長:λ =338nm ;柱溫:25°C ;流速:lmL/min ;進樣量:20 μ L。吸取200 μ L樣品溶液、200 μ L衍生劑(0ΡΑ 80 mg, β -巰基乙醇80 μ I,甲醇IOml)和ImL硼酸緩沖液(0.4 mmol/mL, pH
10.4)，振蕩5 min后經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾后檢測。檢測結(jié)果見表I。紅曲霉CGMCC N0.6860制備的功能紅曲中桔霉素含量測定:色譜條件:Agilent TC-C18(250mmX4.6mm,5ym)色譜柱；流動相:乙腈:甲醇:水=70:10:20(磷酸調(diào)ρΗ2.66-2.68);檢測器:熒光檢測器；檢測波長:入ex=331 nm, λ em=500nm ;柱溫:25°C;流速:lmL/min ;進樣量:20 μ L。樣品處理方法與檢測功能紅曲中MonacolinK的方法相同。檢測結(jié)果見表I。紅曲霉CGMCC N0.6860制備的功能紅曲的色價測定方法:樣品烘干研磨(過40目篩)，參考國標GB4926-2008所示方法，紅曲霉CGMCCN0.6860制備功能紅曲僅有淡黃色色素產(chǎn)生,測定波長選擇為410nm。檢測結(jié)果見表I。表I紅曲霉CGMCC N0.6860制備的功能紅曲的檢測結(jié)果
權利要求
1.一種高產(chǎn)洛伐他汀和Y-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌，其特征在于:名稱為:C002，分類命名為:紅曲(Monascus sp.)，保藏編號為:CGMCC N0.6860，保藏日期:2012年11月26日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。
2.利用如權利要求1所述的紅曲霉菌制備的功能紅曲。
3.根據(jù)權利要求2所述的功能紅曲，其特征在于:所述功能紅曲的制備步驟如下: 固體發(fā)酵培養(yǎng)基厚度f 8cm，冷卻至室溫后將孢子懸液濃度為10卜108的紅曲霉菌種子液按體積質(zhì)量比ml/g為1(Γ25%的接種量混合入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于3(T37°C培養(yǎng)3 10天，轉(zhuǎn)入2(T27°C培養(yǎng)2飛周，濕度40 80%，發(fā)酵結(jié)束后，置于4(T70°C干燥，即得功能紅曲。
4.根據(jù)權利要求3所述的功能紅曲，其特征在于:所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法為:將糧食培養(yǎng)基分別與水按質(zhì)量 體積比g:ml為1: f 3的比例浸泡過夜，121°C滅菌20min。
5.根據(jù)權利要求4所述的功能紅曲，其特征在于:所述糧食培養(yǎng)基為大米、黃米、玉米、豌豆、豆渣、木薯、麥、豌豆、糜子或苡米中的一種或幾種的混合物。
6.根據(jù)權利要求4所述的功能紅曲，其特征在于:所述糧食培養(yǎng)基按糧食培養(yǎng)基:麥麩或米糠或豆柏的重量比為廣10:1的比例將糧食培養(yǎng)基與麥麩或米糠或豆柏進行復配。
7.根據(jù)權利要求2所述的功能紅曲，其特征在于:所述紅曲霉菌種子液的制備方法如下:種子液培養(yǎng)基為葡萄糖l(T60g/L，蛋白胨l(T40g/L，NaN03 I 10g/L，MgS04.7Η20 I 5g/L, KH2PO4 0.riOg/L,向種子液培養(yǎng)基中接種紅曲霉菌CGMCC N0.6860后，于14(T220rpm，3(T37°C培養(yǎng)12 24小時，得紅曲霉菌種子液。
8.根據(jù)權利要求7所述的功能紅曲，其特征在于:所述功能紅曲中無桔霉素或桔霉素含量< 5(^g/kg ;紅曲不產(chǎn)或低產(chǎn)紅曲色素；所述紅曲中洛伐他汀含量為3 12mg/g，Y-氨基丁酸含量為2 5 mg/g ;所述低產(chǎn)紅曲色素的紅曲色素色調(diào)為淡黃色，410nm測定黃色素的色價< 20U/g。
9.如權利要求1所述的紅曲霉菌在制備降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。
10.如權利要求2至8任一項所述的功能紅曲在制備降血脂和改善睡眠的保健食品、功能性飲料和抑制腫瘤細胞增殖的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低產(chǎn)色素的紅曲霉菌，名稱為C002，分類命名為紅曲(Monascus sp.)，保藏編號為CGMCC NO.6860，保藏日期2012年11月26日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所。本發(fā)明的紅曲霉菌具有高產(chǎn)洛伐他汀和γ-氨基丁酸；不產(chǎn)、極低產(chǎn)桔霉素，無苦味，并具有低產(chǎn)紅曲色素的特點，紅曲霉菌CGMCC NO.6860菌株可利用包括大米、黃米、玉米、木薯等多種培養(yǎng)基質(zhì)生產(chǎn)功能性紅曲；該紅曲霉菌的低產(chǎn)紅曲色素的特性尤其適合相關功能性飲料的產(chǎn)品開發(fā)。
文檔編號A61P35/00GK103224890SQ20131006046
公開日2013年7月31日 申請日期2013年2月27日 優(yōu)先權日2013年2月27日
發(fā)明者陳勉華, 吉達維, 王玉榮, 孫妮娜, 高紅, 王昌祿 申請人:天津科技大學