專利名稱：結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于人類治療的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體。更具體而言，本發(fā)明涉及與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體以及其在治療特征在于TNF-α活性的病癥中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子a (TNF-a )是參與介導(dǎo)休克和多種人類疾病和病癥的病理生理學(xué)的一種細胞因子，所述人類疾病和病癥包括膿毒癥、感染、自身免疫性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎和其它腸病況、銀屑病、中毒性休克、移植排斥以及移植物抗宿主病。TNF-a主要由激活的巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生，但在急性炎癥反應(yīng)過程中也由嗜中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞產(chǎn)生。由于其在炎癥中的作用，在減輕炎性病癥的癥狀的努力中，TNF-a已作為重要的用于抑制的靶標而顯露出來。已追求了多種為了疾病的臨床治療而抑制TNF-a的方法，特別是包括可溶性TNF-a受體和特異于TNF-a的抗體的用途。結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)是抗體的最小功能性結(jié)合單元，并且相應(yīng)于抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)或輕鏈可變區(qū)(')。結(jié)構(gòu)域抗體具有約13kDa的分子量，或小于完整抗體大小的十分
之一 O 與常規(guī)抗體不同，結(jié)構(gòu)域抗體在細菌、酵母和哺乳動物系統(tǒng)中良好表達。它們的小尺寸允許更高的摩爾量/克產(chǎn)物，從而提供了效力/毫克劑量的顯著增加。此外，dAb可以用作構(gòu)建部件，以制備治療產(chǎn)物例如多重靶向性的包含dAb的分子，其中兩個或更多個dAb結(jié)合至兩個或更多個不同的分子靶，或者可以將dAb合并入為肺或口服施用而設(shè)計的結(jié)構(gòu)中。本發(fā)明者現(xiàn)在已設(shè)計出一種新的包含免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述可變結(jié)構(gòu)域連接至包括有截短的ChI結(jié)構(gòu)域的恒定區(qū)。推測包含恒定區(qū)有助于延長通常具有短的持續(xù)時間的dAb的體內(nèi)半衰期。新世界靈長類免疫球蛋白進化上遙遠的靈長類，例如新世界靈長類，足夠類似于人以具有類似于人抗體的抗體，從而使得當(dāng)衍生自此類靈長類的抗體被引入人中時，宿主不產(chǎn)生抗抗體免疫應(yīng)答。新世界靈長類(廣鼻猴下目(Platyrrhini))包含至少53個種，其通常分成2個科:狨科(Callithricidae )和懸猴科(Cebidae )。狨科由狨和|組成。懸猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、絨毛猴、懸猴、夜或梟猴和吼猴。先前的研究已表征了表達的普通狨(Callithrix jacchus)的免疫球蛋白重鏈儲庫(von Budingen H-C等人，Characterization of the expressed immunoglobulin IGHVrepertoire in the New World marmoset Callithrix jacchus.1mmunogenetics;53:557-563(2001))。鑒定了 6個IGHV亞群，其顯示了與它們的人IGHV對應(yīng)物的高度序列相似性。當(dāng)與互補決定區(qū)(CDR)相比較時，構(gòu)架區(qū)是更保守的，其中最高程度的可變性位于CDR3中。普通狨與人IGHV序列之間的相似性程度小于舊世界靈長類與人之間的相似性程度。發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明提供了與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含:(a)與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb);(b)經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c)人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個殘基，更優(yōu)選地不多于10個殘基，更加優(yōu)選地不多于5個殘基和更為優(yōu)選地單個殘基的截短的ChI結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者半胱氨酸殘基的單氨基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的核酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列。第四方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示核苷酸序列在高嚴緊度條件下雜交的核酸`序列。第五方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含有效量的根據(jù)第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。第六方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體在檢測人TNF-a的診斷應(yīng)用中的用途。第七方面，本發(fā)明提供了用于在人受試者中治療特征在于人TNF-a活性的病癥的方法，其包括給所述受試者施用根據(jù)本發(fā)明第二方面的藥物組合物。附圖簡述

圖1顯示了接納體(acceptor) dAb的氨基酸序列(SEQ ID No:5)和核苷酸序列(SEQ ID No:6)。圖2顯示了本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的優(yōu)選實施方案的結(jié)構(gòu)，作為(A)單體和(B) 二聚體。圖3顯示了十一個(11)狨和六個(6 )梟猴V K基因區(qū)段的核苷酸和氨基酸序列。圖4顯示了接納體dAb的氨基酸序列(SEQ ID No:5)和核苷酸序列(兩條鏈)(SEQID No:6和SEQ ID No:68)。圖中標示了 KpnI和SanDI的限制性消化位點，其切出包含CDR2的區(qū)域。被除去的CDR2殘基以下劃線標示。圖5顯示了化合物170 (SEQ ID No: 11)在鼠類L929細胞生存力測定法中中和TNF-α介導(dǎo)的細胞毒性的能力。圖6顯示了，化合物170 (SEQ ID No: 11)阻止TNF-α與人ρ55或p75TNF受體的相互作用。
圖7顯示了，表達跨膜TNF-α的NS027D4細胞(黑色實線)的化合物170 (SEQID No: 11)染色顯現(xiàn)出比不相關(guān)特異性同種型-匹配的對照(irrelevant specificityisotype-matched control)(灰色填充)更高的突光強度。圖8顯示了在細菌表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的化合物170 (SEQ ID No: 11)在ELISA中保持與TNF-α的結(jié)合。圖9顯示了相對于特異性對照人IgG1而言，化合物170 (SEQ ID No: 11)在TNF介導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎模型中的功效。以每周一次的間隔對小鼠進行評分(關(guān)節(jié)炎得分)(A)，和稱重(B)。圖10顯示了對化合物112 (SEQ ID No:59)和化合物170 (SEQ ID No:ll)的蛋
白質(zhì)表達的影響。圖11顯示了化合物170 (SEQ ID No: 11)的非還原性SDS PAGE分析，所述化合物170來自4X IOL先導(dǎo)細胞系(lead cell line)發(fā)酵并經(jīng)蛋白A純化。泳道1=測定法間對照；泳道2=分子量標準參照物；泳道3=空白；泳道4=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行I)中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行2)中的化合物170 ;泳道6=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行3)中的化合物170 ;泳道7=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行4)中的化合物170。圖12顯示了化合物170(SEQ ID No: 11)的還原性SDS PAGE分析，所述化合物170來自4X IOL先導(dǎo)細胞系(lead cell line)發(fā)酵并經(jīng)蛋白A純化。泳道1=測定法間對照；泳道2=分子量標準參照物；泳道3=空白；泳道4=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID(運行I)中的化合物170 (SEQ ID No: 11);泳道5=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行2)中的化合物170 ;泳道6=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行3)中的化合物170 ;泳道7=經(jīng)蛋白A純化的在IOL發(fā)酵ID (運行4)中的化合物170。發(fā)明詳述本發(fā)明者已產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其與人TNF-α結(jié)合并且被推測當(dāng)給人施用時展現(xiàn)出低免疫原性。該結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含相應(yīng)于免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(即結(jié)構(gòu)域抗體(dAb))的部分、鉸鏈區(qū)和相應(yīng)于抗體重鏈恒定區(qū)的部分，但其中所述恒定區(qū)具有截短的ChI結(jié)構(gòu)域。推測包含恒定區(qū)部分能增加dAb的體內(nèi)半衰期，以及提供效應(yīng)子功能，所述效應(yīng)子功能被認為是抗TNF抗體的抗炎機制的組成部分。第一方面，本發(fā)明提供了與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含:(a)與人TNF-α結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb);(b)經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列；(c)人或靈長類重鏈恒定區(qū)序列，其具有不多于20個殘基，更優(yōu)選地不多于10個殘基，更加優(yōu)選地不多于5個殘基和更為優(yōu)選地單個殘基的截短的ChI結(jié)構(gòu)域，其中所述經(jīng)修飾的鉸鏈區(qū)序列包含缺失或者半胱氨酸殘基的單氨基酸置換，所述半胱氨酸殘基通常促進重和輕抗體鏈間二硫鍵的形成。在一個優(yōu)選的實施方案中，ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)為XEPKSZDKTHTCPPCPA (SEQ IDNo:64)，其中X為纈 氨酸、亮氨酸或異亮苷酸，和Z不存在或為除半胱氨酸以外的其他氨基酸。優(yōu)選地，X為纈氨酸，和Z為絲氨酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述dAb包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，其中所述可變結(jié)構(gòu)域包含至少一個具有來源于新世界靈長類的序列的互補決定區(qū)(CDR)，其中所述 CDR 選自 AATKLQS (SEQ ID No:1),EASSLQS (SEQ ID No: 2),EASKLQS (SEQID No:3)和 SASNLET (SEQ ID No:4)。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述⑶R為⑶R2。在一個優(yōu)選的實施方案中，dAb具有選自下列的序列:DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITGRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 145 ; SEQ ID No: 7)DIQMTQSPS SLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 123 ; SEQ ID No:8)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLLPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 100 ; SEQ ID No:9)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLLPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 196 ; SEQ ID No: 10)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 134 ; SEQ ID No:52)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 137 ; SEQ ID No:53)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLVPEDFATYYCQQVVff RPFTFGQGTKVE I KR (化合物 121 ；SEQ ID No:54);和與這些序列之一至少95%，更優(yōu)選地至少96%、97%、98%或99%同一的序列。在進一步的優(yōu)選實施方案中，所述恒定區(qū)包含Ch2和Ch3結(jié)構(gòu)域，其一起具有下列序列:PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ； (SEQID NO:63)
或者與其至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%,98%或99%同一的氨基酸序列。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No:ll所不的序列。此處所用的術(shù)語“與......結(jié)合”意指抗原被免疫球蛋白可變區(qū)以I μ M或更低的
解離常數(shù)(Kd)進行結(jié)合，如使用例如BIAcore 表面等離子體共振系統(tǒng)和BIAcore 動力學(xué)評估軟件(例如，2.1版)通過表面等離子體共振分析所測量的。特異性結(jié)合相互作用的親和力或解離常數(shù)(Kd)優(yōu)選地為約500nM或更低，更優(yōu)選地約300nM或更低，以及優(yōu)選地至少300nM 至 50pM，200nM 至 50pM，和更優(yōu)選地至少 IOOnM 至 50pM，75nM 至 50pM，IOnM 至 50pM。此處所用的術(shù)語“dAb”指與抗原特異性地結(jié)合的抗體單可變結(jié)構(gòu)域(VH或VJ多肽。
在本發(fā)明的一個進一步的優(yōu)選實施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體與另一個根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體形成同或異二聚體。二聚化能夠增加抗原結(jié)合的強度，其中所述結(jié)合的強度與多個結(jié)合位點的結(jié)合親和力總和有關(guān)。為了促進二聚體的形成，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的鉸鏈區(qū)包含至少一個，和優(yōu)選地兩個半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體和一個相同的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體形成同二聚體。因此，在另一個方面中，本發(fā)明提供了與人TNF-α結(jié)合的二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體，其中所述二聚體由兩個根據(jù)本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體組成。優(yōu)選的是，二聚結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體為同二聚體，并且特別優(yōu)選的是，組成同二聚體的所述結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包含與SEQ ID No: 11所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的氨基酸序列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No: 11所示的序列。第二方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明第一方面的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的核酸序列。第三方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列至少60%同一的，優(yōu)選地至少80%同一的，更優(yōu)選地至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸序列，和最優(yōu)選地包含SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示的序列。第四方面，本發(fā)明提供了分離的核酸分子，其包含編碼與人TNF-a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體的序列，其中所述核酸分子包含與SEQ ID No:50或SEQ ID No:51所示核苷酸序列在高嚴緊度條件下雜交的核酸序列。在確定兩個多肽序列是 否落在同一性百分比限度內(nèi)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到必須進行并列比較或者序列的多重比對。在這樣的比較或比對中，差異將在不相同的殘基的定位中出現(xiàn)，這取決于用來進行比對的算法。在本文本中，提及兩個或更多個氨基酸序列之間的“同一性百分比”或者“相似性”應(yīng)被視為分別指所述序列之間相同的或相似的殘基的數(shù)目，如用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標準算法所測定的。例如，氨基酸序列同一性或相似性可以用GAP程序進行計算和/或用PILEUP程序(Computer GeneticsGroup, Inc.，University Research Park, Madison, Wiscons in, United States ofAmerica) (Devereaux 等人，1984)進行比對。GAP 程序使用了 Needleman 和 Wunsch (1970)的算法來使相同的/相似的殘基的數(shù)目最大化并使在比對中序列缺口的數(shù)目和長度最小化。備選地或者另外地，當(dāng)比較多于兩個的氨基酸序列時，可以使用Thompson等人(1994)的Clustal W程序。在確定兩個核苷酸序列是否落在這些百分比限度內(nèi)時，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到必須進行并列比較或者序列的多重比對。在這樣的比較或比對中，差異可在不相同的殘基的定位中出現(xiàn)，這取決于用來進行比對的算法。在本文本中，提及兩個或更多個核苷酸序列之間的“同一性百分比”應(yīng)被視為指所述序列之間相同的殘基的數(shù)目，如用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何標準算法所測定的。例如，可以采用BESTFIT程序或者其它合適的程序(Computer Genetics Group, Inc., University ResearchPark, Madison, Wisconsin, United States of America) (Devereaux 等人，Nucl.AcidsRes.，12:387-395, 1984)來對核苷酸序列進行比對并計算它們的同一性。
高嚴緊度優(yōu)選涉及在65°C和0.1XSSC (IXSSC=0.15M NaCl, 0.015M檸檬酸鈉，PH7.0)的條件下的雜交。在一個實施方案中，本發(fā)明還基于用于擴增新世界靈長類免疫球蛋白可變區(qū)基因的方法，例如使用對于重鏈和輕鏈可變區(qū)基因家族特異的引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)從提取自新世界靈長類淋巴細胞的核酸中進行擴增。例如，關(guān)于重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域基因(分別為Vh和的邊界的信息可以用于設(shè)計PCR引物，所述引物從經(jīng)克隆的重鏈或輕鏈編碼序列中擴增可變結(jié)構(gòu)域，所述重鏈或輕鏈編碼序列編碼已知與給定抗原相結(jié)合的抗體。然后，將擴增的可變區(qū)單獨地或者作為與另一本發(fā)明的人或靈長類恒定區(qū)多肽序列的融合物插入合適的表達載體中，以產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體。合適的表達載體將是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。VH、'和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域儲庫可以是天然存在的免疫球蛋白序列儲庫或合成的儲庫。天然存在的儲庫是例如從表達免疫球蛋白的細胞制備的儲庫，所述表達免疫球蛋白的細胞從一種或多種靈長類中收獲。此類儲庫可以是原初的(naive)，即從新生的表達免疫球蛋白的細胞制備，或者是重排的，即從例如成年靈長類B細胞制備。需要時，隨后對從天然儲庫或任何儲庫中鑒定的結(jié)合靶抗原的克隆實施誘變并進一步進行篩選，以產(chǎn)生和選擇具有改善的結(jié)合特征的變體。單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的合成儲庫是通過向經(jīng)克隆的可變結(jié)構(gòu)域中人工弓I入多樣性來制備的。可以通過例如噬菌體展示，就所希望的結(jié)合特異性和功能行為來篩選Vh和\結(jié)構(gòu)域儲庫。用于構(gòu)建噬菌體展示文庫和λ噬菌體表達文庫的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。噬菌體展示技術(shù)已在本領(lǐng)域中進行了廣泛描述，以及用于產(chǎn)生和篩選這樣的文庫以及對它們的產(chǎn)物進行親和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文獻中找到=Barbas等人，(1991) PNAS88:7978-7982 ;Clarkson 等人.(1991) Nature352:624-628 ;Dower 等人，PCT.91/17271，美國專利號 5，427，908，美國專利號 5，580，717 和 EP527, 839 ；Fuchs 等人，(1991)Bio/Technology9: 1370-1372 ；Garrad 等人，(1991)Bio/Technology9:1373-1377 ；Garrard 等人，PCTW092/09690 ;Gram 等人，(I992)PNAS89Z3576-358O5Griffiths 等人，(1993) EMB0J12:725-734 !Griffiths 等人，美國專利號 5，885，793 和 EP589, 877 ；Hawkins 等人，(1992)JMol Biol226:889-896 ；Hay 等人，(1992)Hum AutibodHybridomas3:81-85 ；Hoogenboom 等人，(1991)Nuc Acid Resl9:4133-4137 ；Huse 等人，(1989)Science246:1275-1281 ；Knappik 等人，(2000)JMol Biol296:57-86 ；Knappik等人，PCT W097/08320 ；Ladner 等人，美國專利號 5，223，409，5，403，484，5，571，698，5，837，500 和 EP436, 597 ；McCafferty 等人，(1990) Nature348:552-554 ；McCafferty 等人，PCT.W092/01047,美國專利號 5，969，108 和 EP589, 877 ;Salfeld 等人，PCT W097/29131,美國專利申請?zhí)?20050004354 ;和 Winter 等人，PCT W092/20791 和 EP368, 684。表達Vh和\結(jié)構(gòu)域儲庫的重組文庫可以在微生物例如酵母或細菌的表面上進行表達(參見 PCT 公開 W099/36569 和 98/49286)。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以通過重組方法來產(chǎn)生，包括從真核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生，所述真核表達系統(tǒng)包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞，以及真菌表達系統(tǒng)和病毒編碼的表達系統(tǒng)，如此處所描述的或者本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體可以用S抗體編碼核酸來制備，以便提供轉(zhuǎn)基因植物和培養(yǎng)的植物細胞(例如，但不限于，煙草和玉米)，其在植物的某些部位中或者在由其培養(yǎng)出的細胞中產(chǎn)生這樣的構(gòu)建體。作為非限制性的例子，表達重組蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因煙草葉已被成功用于提供大量的重組蛋白質(zhì)，例如，采用誘導(dǎo)型啟動子(參見例如，Cramer等人，Curr.Top.Microbol.1mmunol.240:95-1181999)和其中所引用的參考文獻。此外，轉(zhuǎn)基因玉米也已經(jīng)用于以商業(yè)生產(chǎn)水平來表達哺乳動物蛋白質(zhì)，其生物活性等價于在其他重組系統(tǒng)中生產(chǎn)的或者從天然來源中純化的蛋白質(zhì)(參見例如，Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-1471999和其中所引用的參考文獻)。也已從轉(zhuǎn)基因植物種子(包括煙草種子和馬鈴薯塊莖)中大量生產(chǎn)抗體，包括抗體片段例如單鏈抗體(scFv’s)(參見例如，Conrad等人，Plant Mol.Biol.38:101-109，1998和其中所引用的參考文獻)。因此，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體也可以根據(jù)已知的方法用轉(zhuǎn)基因植物來生產(chǎn)(也參見例如，F(xiàn)ischer 等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-1080ctober, 1999 ；Ma&Hein., TrendsBiotechnol.13:522-71995 ;Ma 等人，Plant Physiol.109:341-61995 ；ffhitelam 等人，Biochem.Soc.Trans.22:940-9441994 ;和其中所引用的參考文獻；以上每一篇參考文獻在此通過提及而整體合并入本文)。本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域抗體構(gòu)建體包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成方法的產(chǎn)物和通過重組技術(shù)從真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產(chǎn)生的產(chǎn)物。取決于在重組生產(chǎn)方法中所采用的宿主，本發(fā)明的抗體構(gòu)建體可以是糖基化的或者非糖基化的，其中優(yōu)選是糖基化的。這樣的方法在許多標準的實驗室手冊中已有描述，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor, N.Y.1989,第 17.37-17.42 節(jié)；Ausubel 等人，編輯，Current Protocols inMolecular Biology1987-1993,第 10，12, 13, 16, 18 和 20 章；Colligan 等人，Current Protocols in ProteinScience, John ffiley&Sons, NY, N.Y.1997-2001, Protein Science,第 12-14章，所有文獻在此通過提及而整體合并入本文。

在一種表達系統(tǒng)中，在核糖體上展示重組肽/蛋白質(zhì)文庫(例如參見Roberts，Rff 和 Szostak, J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.94:12297 — 123202 以及 PCT
發(fā)明者A·G·多伊爾, B·P·伍爾文, I·M·湯姆林森, J·A·李, P·A·詹寧斯 申請人:賽法隆澳大利亞控股有限公司