專利名稱：放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種用于研究放射性肺損傷病理機(jī)制、發(fā)生規(guī)律、影像診斷及評估動物模型的制備方法，本發(fā)明屬于醫(yī)藥模型技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
放射性肺損傷是胸部腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，有癥狀的放射性肺損傷的發(fā)生率高達(dá)30%以上，其進(jìn)程可呈不可逆性，最終可導(dǎo)致嚴(yán)重呼吸功能衰竭。因此，放射性肺損傷已成為胸部腫瘤放射治療的主要限制性因素。迄今，放射性肺損傷仍然是根據(jù)常規(guī)影像學(xué)手段(胸部平片及CT檢查)和臨床表現(xiàn)的綜合判斷，其中高分辨率CT (HRCT)陽性表現(xiàn)是目前相對客觀和準(zhǔn)確的依據(jù)。但遺憾的是，當(dāng)HRCT出現(xiàn)放射性肺損傷陽性表現(xiàn)時，大多數(shù)患者的放射性治療將近或已經(jīng)結(jié)束，放療方案難再作出調(diào)整，受損肺組織出現(xiàn)的后續(xù)改變基本上難以逆轉(zhuǎn)。因而，進(jìn)一步研究放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制，并尋找可能的用于放射性肺損傷早期診斷、早期干預(yù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。據(jù)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)所知，迄今尚未見有相對特異的能夠用于早期診斷放射性肺損傷的方法或手段。目前認(rèn)為放射性肺損傷的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明放射性肺損傷是由多個損傷因素共同作用的結(jié)果，也是組織損傷和機(jī)體修復(fù)失衡的最終表現(xiàn)形式。目前已知放射性肺損傷產(chǎn)生機(jī)制主要有細(xì)胞因子、氧自由基和靶細(xì)胞損傷等三種假說。雖然放射性肺損傷發(fā)病機(jī)制的上述三種主流學(xué)說，分別得到了一系列實(shí)驗(yàn)和試驗(yàn)性治療研究的證實(shí)。但靶細(xì)胞損傷、細(xì)胞因子和自由基并非各自獨(dú)立發(fā)揮作用，而是穿插于放射性肺損傷整個發(fā)病過程中，相互影響和作用構(gòu)成了較為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。它們啟動、失衡、放大的時間和影響因素各不相同，三者相互制約或相互協(xié)同的調(diào)控機(jī)制及失控因素尚不為人知。因此，它們目前很難有效地用來早期預(yù)報放射性肺損傷及其防治。但從上述三大假說中若能尋找到一個或幾個交互作用的共同節(jié)點(diǎn)，將可能對探明放射性肺損傷發(fā)生的機(jī)制產(chǎn)生新的思路。

基于此，在如期臨床工作中就發(fā)現(xiàn)一特殊征象:在接受完放療總劑量一半的照射劑量時，按美國腫瘤放射治療協(xié)作組織(RTOG)診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為I 3級的放射性肺損傷患者，在HRCT上絕大多數(shù)無異常征象，而在CT灌注成像上，絕大多數(shù)出現(xiàn)照射區(qū)肺野的異常灌注，尤其是毛細(xì)血管通透性不同程度的增加，并且其增加的程度與放射性肺損傷分級呈正相關(guān)，但照射區(qū)外的肺組織無此異常變化。多年來，國內(nèi)外學(xué)者一直在探索建立放射性肺損傷模型的方法。以往文獻(xiàn)中，建立放射性肺損傷動物模型多采用小鼠或大鼠等，但是由于對輻射敏感，死亡率相對較高，僅少數(shù)能存活至晚期的肺纖維化；鼠肺體積較小，利用鼠放射性肺損傷模型對放射性肺損傷進(jìn)行CT、MR及核醫(yī)學(xué)成像研究其機(jī)理的效果不佳。新西蘭大白兔體積中等偏小，其肺組織在CT、MR上成像較為清晰，對放射線中度敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種以便更進(jìn)一步開展有關(guān)的發(fā)病機(jī)制、診斷方法、預(yù)防治療等方面研究的放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，所述放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法包括如下步驟:
將雌雄不分、兔齡為1.0 1.2歲、體重為2.0 3.0 kg的新西蘭大白兔隨機(jī)分成總組數(shù)及每組內(nèi)兔只數(shù)完全相同的實(shí)驗(yàn)組和對照組；實(shí)驗(yàn)組和對照組均采用肌注麻醉后，先全肺CT掃描定位，后靶區(qū)勾畫，再做單側(cè)肺照射野設(shè)計(jì)和劑量計(jì)算的放療三維計(jì)劃，同側(cè)鎖骨上區(qū)、劍突下方及其對側(cè)胸腔均用鉛塊遮擋；采用直線加速器對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行照射，前后對穿射野，等中心平面為肺中平面，單側(cè)全肺單次大劑量照射，總劑量為25Gy，吸收劑量率為2Gy / min，源軸距(SAD)為IOOcm ;對照組放入直線加速器內(nèi)但不進(jìn)行照射，對照組在直線加速器內(nèi)所待時間與實(shí)驗(yàn)組在直線加速器內(nèi)照射時間相同；
實(shí)驗(yàn)組于照射后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺野分別取2處標(biāo)本，進(jìn)行HE染色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查；
對照組于放入直線加速器后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺葉分別取兩處標(biāo)本，進(jìn)行染 色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查。所述肌注麻醉具體操作是:先進(jìn)行地西泮肌注，用量為0.8^1.0ml/kg ;后進(jìn)行速眠新II號肌肉注射，用量為0.4^0.5 ml/kg。本研究所建立的動物模型能很好地模擬的人類放射性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及特征，具有造模操作簡單、造模成本低、成模時間短、模型死亡率低、易于復(fù)制、可控性佳、成像效果好等優(yōu)點(diǎn)，非常有利于放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)后續(xù)治療、療效評估等藥物開發(fā)與研究，具有規(guī)模推廣與應(yīng)用價值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。一種放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法包括如下步驟:
將雌雄不分、兔齡為1.(Tl.2歲、體重為2.(T3.0 kg的新西蘭大白兔隨機(jī)分成總組數(shù)及每組內(nèi)兔只數(shù)完全相同的實(shí)驗(yàn)組和對照組；實(shí)驗(yàn)組和對照組均采用肌注麻醉后，先全肺CT掃描定位，后靶區(qū)勾畫，再做單側(cè)肺照射野設(shè)計(jì)和劑量計(jì)算的放療三維計(jì)劃(TPS，CMS公司Xio型)，同側(cè)鎖骨上區(qū)、劍突下方及其對側(cè)胸腔均用鉛塊遮擋；采用直線加速器(SIEMENS Primus M)對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行照射，前后對穿射野，等中心平面為肺中平面，單側(cè)全肺單次大劑量照射，總劑量為25Gy，吸收劑量率為2Gy / min，源軸距(SAD)為IOOcm ;對照組放入直線加速器內(nèi)但不進(jìn)行照射，對照組在直線加速器內(nèi)所待時間與實(shí)驗(yàn)組在直線加速器內(nèi)照射時間相同；
實(shí)驗(yàn)組于照射后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺葉分別取兩處標(biāo)本，進(jìn)行染色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查；
對照組于放入直線加速器后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺葉分別取兩處標(biāo)本，進(jìn)行染色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查。所述肌注麻醉具體操作是:先進(jìn)行地西泮肌注，用量為0.8^1.0ml/kg ;后進(jìn)行速眠新II號肌肉注射，用量為0.4^0.5 ml/kg。上述的HE染色光鏡檢查時主要觀察肺泡、肺泡壁、肺泡間隔、間質(zhì)毛細(xì)血管改變。采用雙盲法在10倍鏡下隨機(jī)取10個視野測量肺泡壁厚度(相鄰肺泡之間的直線距離)、肺間質(zhì)面密度(肺間質(zhì)面積/視野單位面積)、肺泡腔面密度(肺泡腔面積/視野單位面積)和纖維及纖維母細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算各自每一視野的平均值。上述的透射電鏡檢查采用HITACHI H-600 (日立公司，日本)透射電鏡觀察、攝片，觀察肺泡壁、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜等超微結(jié)構(gòu)變化，三位資深電鏡教師(雙盲法)對每一標(biāo)本在10000倍鏡下平均取十個視野計(jì)算膠原纖維相對含量，取三者計(jì)算結(jié)果的平均值。上述的免疫組化檢查即檢測局部肺組織腫瘤壞死因子a (TNF-a )、轉(zhuǎn)化生長因子￠1 (TGF-M)等細(xì)胞因子的表達(dá)。灌注成像觀察
采用Siemens FLASH螺旋CT掃描機(jī)(德國西門子新雙源CT)進(jìn)行兔全肺灌注成像及常規(guī)高分辨率成像，重點(diǎn)分析、觀察局部肺血容量、血流量及毛細(xì)血管通透性，以期觀察肺組織放射照射后的功能變化。放射性肺損傷兔階梯模型CT灌注成像時須進(jìn)行:
1、靜脈置針:耳部局部消毒，取耳緣靜脈穿刺留置頭皮針(連接裝有部分生理鹽水的5ml注射器)，經(jīng)膠帶固定。 2、氣管插管:在小號直喉鏡明視下插入內(nèi)徑3.0 mm氣管插管，采用動物專用呼吸機(jī)(Harvard Apparatus Model 683,美國)，行機(jī)械通氣(潮氣量調(diào)節(jié)在45 ml,呼吸頻率調(diào)節(jié)在30次/分)。3、機(jī)械呼吸:經(jīng)耳緣靜脈留置針注射肌肉松弛藥(注射用苯磺順阿曲庫銨，
0.r0.2 mg/kg)以完全抑制兔自主呼吸，立即連接調(diào)試好的動物呼吸機(jī)，保證動物被動呼吸。4、掃描準(zhǔn)備:準(zhǔn)備并調(diào)試好CT增強(qiáng)用高壓注射器及CT掃描機(jī)參數(shù)。使用對比劑為非離子型(歐乃派克，300 mgl/mL)，用量為5.0 ml，設(shè)定注射速率為0.8 mL/s，延遲5秒掃描。掃描參數(shù):管電壓80 kV，管電流mAs自動調(diào)節(jié)，球管轉(zhuǎn)速0.33秒/轉(zhuǎn)。將耳緣靜脈留置針與CT增強(qiáng)用高壓注射器連接。5、灌注掃描:選定右心室或肺動脈主干層面為中心層面，包括全肺，即肺尖至橫膈范圍。設(shè)定對比劑注射起始時間和掃描起始時間為同步，在呼吸機(jī)致實(shí)驗(yàn)兔吸氣末時立即暫停呼吸機(jī)，同時啟動高壓注射和CT掃描，連續(xù)動脈掃描采集，2(T30次，重建層厚、間距均為 1.5 mm。6、圖像分析:將掃描圖像傳至CT工作站后，利用配置的灌注軟件進(jìn)行圖像后處理，分別測量兩側(cè)肺的上、中、下野的灌注值，即局部血流量(rBF)、局部血容量(rBV)及局部毛細(xì)血管通透性(rPS)。7、血清檢查:在步驟6后同時行實(shí)驗(yàn)兔開胸處理，充分曝露心臟后，利用5 ml注射器(2 ml針頭)刺入右心室抽取3 ml全血后，立即注入促凝管內(nèi)暫存。與后續(xù)的試管集中離心后提取上清液(血清)至1.5 ml EP管內(nèi)，置入-70度冰柜保存，以備細(xì)胞因子的檢測。結(jié)果顯示
實(shí)驗(yàn)組所有兔受照射肺均產(chǎn)生了放射性肺損傷，早期以急性炎癥反應(yīng)為主，晚期以進(jìn)行性肺纖維化為特征，具體為:
1、照射后I小時至8周以不同程度的放射性肺炎為主，照射后8周以后開始大量纖維母細(xì)胞及纖維細(xì)胞增殖，局部膠原纖維不同程度地沉積，此期以放射性肺纖維化為主，伴不同程度的肺體積縮小、胸腔積液等。2、實(shí)驗(yàn)組受照射1小時后局部肺組織TNF- a表達(dá)、48小時后TGF- ^ I表達(dá)與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?！?、光鏡下，實(shí)驗(yàn)組受照射1小時后肺泡壁厚度、肺間質(zhì)面積密度、24小時后間質(zhì)內(nèi)纖維母細(xì)胞和纖維細(xì)胞數(shù)量與對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并分別與照射后的時間直線相關(guān)。4、電鏡下，實(shí)驗(yàn)組各時間點(diǎn)之間膠原纖維相對含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對照組各時間點(diǎn)之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組受照射48小時后肺內(nèi)膠原纖維相對含量與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并與照射后時間直線相關(guān)。5、CT灌注成像示rBF與充血毛細(xì)血管百分比的Pearson相關(guān)分析結(jié)果有相關(guān)關(guān)系，rBV與充血毛細(xì)血管百分比亦有線性相關(guān)關(guān)系。故rBF和rBV與病理上毛細(xì)血管擴(kuò)張有依存關(guān)系。rPS與毛細(xì)血管外紅細(xì)胞數(shù)兩者間有顯著的相關(guān)關(guān)系；rPS與基底膜破壞中斷的毛細(xì)血管百分比兩者問有顯著直線相關(guān)關(guān)系和依存關(guān)系。這些結(jié)果表明，25Gy單肺單次高能X線照射能制作穩(wěn)定、可靠的兔放射性肺損傷模型，較好地模擬了放射性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展的演變過程，具有與人類放射肺損傷相似的特點(diǎn)，即放射性肺損傷的急性期、慢性期，或者早、中、晚期的演變過程。從而證實(shí):本發(fā)明的方法成功建立了放射性肺損傷兔階梯模型。本發(fā)明的方法所建立的動物模型能很好的模擬人類放射性肺損傷特征，具有造模操作簡單(只需單側(cè)全肺25Gy高能射線照射)、造模成本低、成模時間短(單次全劑量照射，72小時左右)、多時期的階梯模型(不同時間點(diǎn)不同程度的放射性肺損傷)、動物死亡率低(肌注鎮(zhèn)靜劑及麻醉劑，安全性高、麻醉時間充足，較靜脈或腹腔注射麻醉易控制給藥劑量)、易于復(fù)制(可隨意重復(fù)制作并在照射后不同時間點(diǎn)隨意觀察)、可控性好(注射麻藥的量及次數(shù)隨意控制)、成像效果好(兔屬中型動物，兩肺容積大，結(jié)構(gòu)層次分明清晰)等優(yōu)點(diǎn)。該模型非常有利于胸部相關(guān)疾病放射治療的實(shí)驗(yàn)研究及放射性肺損傷機(jī)制、診斷、療法等相關(guān)研究，在目前尚沒有放射性模型金標(biāo)準(zhǔn)的情況下具有推廣價值。需說明的是，以上對本發(fā)明的具體描述僅用來說明本技術(shù)方案而非限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的教導(dǎo)下，可以對本技術(shù)方案進(jìn)行局部修改或等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨范圍或構(gòu)思范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.一種放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法，其特征是該制備方法包括如下步驟: 將雌雄不分、兔齡為1.(Tl.2歲、體重為2.(T3.0 kg的新西蘭大白兔隨機(jī)分成總組數(shù)及每組內(nèi)兔只數(shù)完全相同的實(shí)驗(yàn)組和對照組；實(shí)驗(yàn)組和對照組均采用肌注麻醉后，先全肺CT掃描定位，后靶區(qū)勾畫，再做單側(cè)肺照射野設(shè)計(jì)和劑量計(jì)算的放療三維計(jì)劃，同側(cè)鎖骨上區(qū)、劍突下方及其對側(cè)胸腔均用鉛塊遮擋；采用直線加速器對實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行照射，前后對穿射野，等中心平面為肺中平面，單側(cè)全肺單次大劑量照射，總劑量為25Gy，吸收劑量率為2Gy / min，源軸距為IOOcm ;對照組放入直線加速器內(nèi)但不進(jìn)行照射，對照組在直線加速器內(nèi)所待時間與實(shí)驗(yàn)組在直線加速器內(nèi)照射時間相同； 實(shí)驗(yàn)組于照射后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺野分別取兩處標(biāo)本，進(jìn)行染色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查； 對照組于放入直線加速器后第1、6、12、24、48、72小時及第1、2、4、8、16、24周處死以作階梯性觀察、分析，若出現(xiàn)死亡則進(jìn)行增補(bǔ)，每一兔處死后即刻開胸，在兩肺中帶的上、中、下肺野分別取兩處標(biāo)本，進(jìn)行染色光鏡檢查、透射電鏡檢查與免疫組化檢查。
2.如權(quán)利要求1所述的放射性肺損傷兔階梯模型的制備方法，其特征是:所述肌注麻醉具體操作是:先進(jìn)行地西泮肌注，用量為0.8 1.0ml/kg;后進(jìn)行速眠新II號肌肉注射，用量為 0.4 0.5 ml/kg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種放射性肺損傷兔模型的制備，其特征為先以肌注麻醉，然后固定后以單次全肺野25Gy高能X射線照射。另建立健康未照射的對照組，分不同照射后時間點(diǎn)進(jìn)行觀察研究，經(jīng)血清、病理學(xué)、電鏡、高分辨率CT及CT灌注成像等結(jié)果證實(shí)，成功建立了放射性肺損傷兔模型。本研究所建立的動物模型能很好地模擬的人類放射性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律及特征，具有造模操作簡單、造模成本低、成模時間短、模型死亡率低、易于復(fù)制、可控性佳、成像效果好等優(yōu)點(diǎn)，非常有利于放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)后續(xù)治療、療效評估等藥物開發(fā)與研究，具有規(guī)模推廣與應(yīng)用價值。
文檔編號A61N5/00GK103100144SQ20131006267
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月28日
發(fā)明者方向明, 胡曉云 申請人:胡曉云