專利名稱：一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制作方法
一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于骨組織修復(fù)支架材料制造領(lǐng)域，具體涉及一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架及其制備方法。
背景技術(shù)：
生物醫(yī)學(xué)材料的研究與開發(fā)對國民經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展具有十分重要的意義。近幾十年來，生物醫(yī)學(xué)材料的研究與開發(fā)取得了很大進(jìn)展，使成千上萬的患者獲得了康復(fù)，大大提高了人類的生命質(zhì)量。硬組織材料是生物醫(yī)學(xué)材料的重要組成部分，人體硬組織生物活性替代材料應(yīng)具有行使替代部位的生理功能，如支撐作用或骨引導(dǎo)作用、能模擬人體骨的生長與吸收、參與植入部位的新陳代謝、與組織進(jìn)行物質(zhì)交換等。具有高度生物活性的人體硬組織替代材料一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。按照仿生學(xué)的原理，越是與機(jī)體相似的材料越是能夠被機(jī)體接納。研制一種與天然骨組織結(jié)構(gòu)、性能相一致的骨替代材料，一直是骨組織工程材料研究的目標(biāo)。
天然骨是由無機(jī)和有機(jī)基質(zhì)巧妙結(jié)合在一起形成的天然復(fù)合體，其中無機(jī)質(zhì)大部分是羥基磷灰石(HAP)，有機(jī)質(zhì)大部分是纖維性膠原蛋白和少量多糖。從廣義上說，它可近似看作以骨膠原為基體材料、羥基磷灰石為增強(qiáng)材料而構(gòu)成的有機(jī)-無機(jī)復(fù)合材料。基于此，膠原基納米羥基磷灰石類復(fù)合材料成為了近年來骨材料研究的熱點(diǎn)之一。但由于該類材料存在機(jī)械性能差和降解速率過快，無法與骨生長速度很好地匹配等缺點(diǎn)，使其難以單獨(dú)成為良好的骨組織工程支架。近幾年來，研究者們通過仿生合成、交聯(lián)處理、引入第三相等方法來提高膠原基納米羥基磷灰石復(fù)合材料的性能。
殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚多糖，其結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分一糖胺聚糖十分類似，降解產(chǎn)物對人體無毒副作用，具有良好的生物降解性和生物相容性。在外形方面，殼聚糖可制成管狀、膜、片、微粒等多種形狀的多孔材料，已廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域。殼聚糖的力學(xué)性能強(qiáng)于膠原，在體液環(huán)境中降解速率能滿足骨組織工程的需要，并且能和膠原很好的復(fù)合，增加膠原的穩(wěn)定性。透明質(zhì)酸(HYA)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種重要天然多糖，具有高度含水能力，可以特異地與CD44受體結(jié)合，在調(diào)節(jié)細(xì)胞行為方面有重要作用。在膠原中復(fù)合透明質(zhì)酸，可以利用其優(yōu)越的生物功能，促進(jìn)細(xì)胞分化與增殖，有助于得到新生組織。
基于此，本發(fā)明利用殼聚糖、透明質(zhì)酸、膠原的分子交聯(lián)技術(shù)和納米羥基磷灰石的自組裝仿生學(xué)原理結(jié)合冷凍干燥相分離技術(shù)，在成分仿生的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)仿生制備類似天然骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的人工骨缺損修復(fù)支架。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架及其制備方法。本發(fā)明制得的三維立體多孔支架具有較大孔隙率和微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞粘附生長、細(xì)胞外基質(zhì)沉淀、營養(yǎng)與氧氣進(jìn)入、代謝產(chǎn)物的排出；支架上含有細(xì)胞特異性識別位點(diǎn)，有利于細(xì)胞粘附、生長，更重要的是能激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持正常細(xì)胞的表型表達(dá)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案: 從仿生角度出發(fā)，選用殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術(shù)結(jié)合原位復(fù)合方法，在成分仿生的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)仿生制備類似天然骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的人工骨缺損修復(fù)支架。多級孔徑結(jié)構(gòu)是指納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架具有微米級、納米級的多級孔徑分布。
一種制備如上所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的方法包括以下步驟: (1)將透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，殼聚糖和膠原溶解于體積分?jǐn)?shù)為I 2%的乙酸溶液中； (2)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原的乙酸溶液中，攪拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67在步驟(2)的混合溶液中分別加入2 3mol/L可溶性鈣鹽溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸鹽溶液； (4)往步驟(3)的混合溶液中加入交聯(lián)劑，常溫交聯(lián)4 8h，最終混合液注入模具，移至2 4°C冰箱預(yù)冷凍3 5h，再放入-10 -80°C冷凍至少12h ； (5)將步驟(4)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； (6)將步驟(5)的干燥樣品置于0.5 1.5mol/L的堿溶液中浸泡8 15h,再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-10 _80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
步驟(3)所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣，可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。
步驟(I)所述的膠原為I型活性膠原蛋白，透明質(zhì)酸選用它的鈉鹽。
步驟(3)的可溶性鈣鹽溶液和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔20 40min加入。
步驟(4)所述的交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS);交聯(lián)劑EDC的濃度為2 4mg/mL，NHS的濃度為I 3mg/mL。
步驟(6)的堿溶液是0.5 1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水(v: V=I 2:1)溶液。
步驟(4)的最終混合液中，殼聚糖的濃度為16 20g/L，膠原的濃度為2.5 5 g/L，透明質(zhì)酸的濃度為0.5 1.5 g/L，加入的Ca/P前驅(qū)體溶液理論形成HAP量為10 20g/L。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于:殼聚糖在組成和結(jié)構(gòu)上與糖胺聚糖具有部分相似性，且生物相容性好；透明質(zhì)酸是一種糖胺聚糖，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，具有保濕、促進(jìn)離子溶質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ?，能通過與其他基質(zhì)分子相互作用，保持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性和彈性；膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，本身含有RGD生物活性短肽，可特異性識別并與細(xì)胞表面整連蛋白受體鍵合，促進(jìn)細(xì)胞 的黏附與生長。原位形成的羥基磷灰石類似人體內(nèi)生物礦化生成的羥基磷灰石，無毒、安全、具有良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)性。因此，選用殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸為有機(jī)基質(zhì)，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無機(jī)相納米羥基磷灰石的先驅(qū)物，采用冷凍干燥相分離技術(shù)原位構(gòu)筑與人體骨組織細(xì)胞外基質(zhì)相近的人工骨缺損修復(fù)支架，相對于其他骨缺損修復(fù)支架有以下優(yōu)點(diǎn): (1)納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架含有精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)序列，可特異性識別并與細(xì)胞表面整連蛋白受體鍵合，促進(jìn)細(xì)胞的黏附與生長; (2)納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架具有微米級、納米級的多級孔徑結(jié)構(gòu)；這種多級孔徑結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的附著、鋪展、遷移，培養(yǎng)液和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸及交換，從而有利于細(xì)胞生長； (3)采用原位復(fù)合的制備方法，使得羥基磷灰石在支架上實(shí)現(xiàn)了納米級分散，相界面的結(jié)合力得到加強(qiáng)，改善了支架的力學(xué)性能； (4)可以通過改變交聯(lián)劑的用量來控制交聯(lián)度，得到具有不同生物降解性能和力學(xué)性能的復(fù)合支架； (5)該復(fù)合支架的制備工藝條件溫和，操作方便。


圖1-3具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架的SEM掃描電子顯微鏡圖。
圖4是具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架圖3的放大圖(箭頭所指是支架上的納米顆粒)。
圖5是具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架上附著的納米粒的XRD衍射圖譜。
圖6具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架的Hoechst33258熒光染色圖(100X)。
圖7-9 SD乳鼠成骨細(xì)胞與具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架組裝體的H0echst33258熒光染色圖(100X)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為16:3:0.5:10 ； 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于1%(ν/ν)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌lh，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述有機(jī)組分混合溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔20min加入； 5)接著加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)5h；EDC的濃度為2mg/mL，NHS的濃度為lmg/mL ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍5h，再放入-10°C冷凍12h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于 0.5mol/L KOH的乙醇/水溶液中浸泡IOh,再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-10°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
實(shí)施例2 1)配制2mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為18:2.5:1:12; 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于1.5%(v/v)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌0.5h，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述步驟(3)有機(jī)組分溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔30min加入； 5)往上述混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)6h；EDC的濃度為3mg/mL，NHS的濃度為1.5mg/mL ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍4h，再放入-20°C冷凍24h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于lmol/LNaOH的乙醇/水溶液中浸泡10h，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
實(shí)施例3 1)配制2.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為18:4:1:15 ； 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于2%(v/v)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌lh，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述步驟(3)有機(jī)組分溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔40min加入； 5)往上述混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)7h；EDC的濃度為4mg/mL，NHS的濃度為3mg/mL ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍4h，再放入_80°C冷凍 12h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于lmol/LKOH的乙醇/水溶液中浸泡12h，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
實(shí)施例4 1)配制2.5mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為20:5:1.5:20 ； 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于1%(ν/ν)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入 到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌0.8h，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述步驟(3)有機(jī)組分溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔30min加入； 5)往上述混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)8h；EDC的濃度為3mg/mL，NHS的濃度為2mg/mL ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍3h，再放入-10°C冷凍 24h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于1.5mol/L NaOH的乙醇/水溶液中浸泡15h,再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-1o°c冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
實(shí)施例5 1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.2mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為20:4:1:15 ； 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于2%(v/v)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌lh，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述步驟(3)有機(jī)組分溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔25min加入； 5)往上述混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)6h；EDC的濃度為2mg/mL，NHS的濃度為1.5mg/mL ;最終混合液注 入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍5h，再放入_80°C冷凍24h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于lmol/LKOH的乙醇/水溶液中浸泡12h，再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
實(shí)施例6 1)配制3mol/L的可溶性鈣鹽溶液，1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸、理論形成HAP的質(zhì)量比為16:5:0.5:12 ； 2)按照上述配比稱取一定量的透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，一定量的殼聚糖、膠原溶解于1.5%(v/v)乙酸溶液； 3)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原乙酸溶液中，攪拌0.5h，使其充分混合均勻； 4)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67往上述步驟(3)有機(jī)組分溶液中分別加入一定體積的可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔35min加入； 5)往步驟(4)混合溶液中加入一定量的交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，常溫交聯(lián)5h；EDC的濃度為4mg/mL,NHS的濃度為3mg/mL ;最終混合液注入模具，移至4°C冰箱預(yù)冷凍4h，再放入_20°C冷凍12h ； 6)將步驟(5)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； 7)將上述所得干燥樣品置于0.5mol/L NaOH的乙醇/水溶液中浸泡12h,再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，_20°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
將SD乳鼠成骨細(xì)胞與所制備的支架進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，考察具有微米/納米多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架的細(xì)胞學(xué)特性。
結(jié)論:本制備方法可以使得原位復(fù)合支架根據(jù)實(shí)際需要預(yù)成型成各種形狀；由SEM圖可以觀察到支架形成較好的相互貫穿的連通孔隙結(jié)構(gòu)，具有微米級、納米級的多級孔徑分布，支架孔壁上有均勻分布的細(xì)小的納米顆粒。由支架的XRD圖譜，可發(fā)現(xiàn)支架中的無機(jī)結(jié)晶物的衍射峰與HAP的特征峰一致，且其衍射峰存在寬化、彌散現(xiàn)象，表明支架中無機(jī)相的結(jié)晶粒度低，晶格發(fā)育不完整，與天然骨的無機(jī)相類似。SD乳鼠成骨細(xì)胞與支架聯(lián)合培養(yǎng)，使用Hoechst33258熒光染料染色，觀察細(xì)胞在支架上的粘附、增殖、生長情況。從熒光染色圖可以看出，加入細(xì)胞懸液4h后，已有細(xì)胞在支架上粘附；48 h后支架上細(xì)胞數(shù)量明顯增加，72 h后可以觀察到細(xì)胞在支架上呈均勻分布，支架上的細(xì)胞數(shù)量越來越多；在聯(lián)合培養(yǎng)過程中成骨細(xì)胞一直保持著良好的生長狀態(tài)，說明復(fù)合支架的細(xì)胞相容性好。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā) 明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架，其特征在于:從仿生角度出發(fā)，選用殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術(shù)結(jié)合原位復(fù)合方法，在成分仿生的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)仿生制備類似天然骨組織細(xì)胞外基質(zhì)的人工骨缺損修復(fù)支架。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架，其特征在于:以殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸為有機(jī)相，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無機(jī)相納米羥基磷灰石的先驅(qū)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架，其特征在于:多級孔徑結(jié)構(gòu)是指納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架具有微米級、納米級的多級孔徑分布。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)將透明質(zhì)酸溶解于去離子水中，殼聚糖和膠原溶解于體積分?jǐn)?shù)為I 2%的乙酸溶液中； (2)緩慢將透明質(zhì)酸溶液加入到殼聚糖/膠原的乙酸溶液中，攪拌0.5 lh，使其充分混合均勻； (3)在劇烈攪拌下，按照HAP的化學(xué)計(jì)量比Ca/P= 1.67在步驟(2)的混合溶液中分別加入2 3mol/L可溶性鈣鹽溶液和1.2 1.8mol/L可溶性磷酸鹽溶液； (4)往步驟(3)的混合溶液中加入交聯(lián)劑，常溫交聯(lián)4 8h，最終混合液注入模具，移至2 4°C冰箱預(yù)冷凍3 5h，再放入-10 -80°C冷凍至少12h ； (5)將步驟(4)所得的冷凍樣品轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥至完全脫水； (6)將步驟(5)的干燥樣品置于0.5 1.5mol/L的堿溶液中浸泡8 15h,再用去離子水反復(fù)浸洗至中性，-10 _80°C冷藏后進(jìn)行冷凍干燥，即得到具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣，可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉。
6.根據(jù)權(quán)利 要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(I)所述的膠原為I型活性膠原蛋白，透明質(zhì)酸選用它的鈉鹽。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(3)的可溶性鈣鹽溶液和可溶性磷酸鹽溶液，二者間隔20 40min加入。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(4)所述的交聯(lián)劑為1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺；交聯(lián)劑1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺的濃度為2 4mg/mL，N-羥基琥拍酰亞胺的濃度為I 3mg/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(6)的堿溶液是0.5 1.5mol/L KOH或NaOH的乙醇/水溶液，其中乙醇與水的體積比為I 2:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架的制備方法，其特征在于:步驟(4)的最終混合液中，殼聚糖的濃度為16 20g/L，膠原的濃度為`2.5 5 g/L，透明質(zhì)酸的濃度為0.5 1.5 g/L，加入的Ca/P前驅(qū)體溶液理論形成HAP量為 10 20 g/L ο
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有多級孔徑結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合骨缺損修復(fù)支架及其制備方法，從仿生角度出發(fā)，為了更好的模擬天然骨組織中細(xì)胞外基質(zhì)的組分、結(jié)構(gòu)與功能，選用殼聚糖、膠原、透明質(zhì)酸和羥基磷灰石組分的組合，利用冷凍干燥相分離技術(shù)結(jié)合原位復(fù)合方法制備類似天然骨細(xì)胞外基質(zhì)的人工骨缺損修復(fù)支架。本發(fā)明制備程序簡單，工藝條件溫和，制備的納米羥基磷灰石/殼聚糖/膠原/透明質(zhì)酸骨缺損修復(fù)支架在組成與結(jié)構(gòu)上與天然骨基質(zhì)類似，性能優(yōu)越，具有可塑性，可被加工成所需要的形狀。
文檔編號A61L27/26GK103143059SQ20131006453
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月1日
發(fā)明者陳景帝, 余其鳳, 張惠, 張玉玨, 張其清 申請人:福州大學(xué)