專(zhuān)利名稱(chēng)：蜂毒抗菌肽Anoplin在血癌治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin的抗腫瘤作用。具體地，本發(fā)明涉及:治療受試者中癌癥、緩解受試者中癌癥癥狀或抑制癌細(xì)胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療癌癥、緩解癌癥癥狀或抑制癌細(xì)胞增殖的藥物、藥劑或藥物組合中的用途；以及涉及一種藥學(xué)產(chǎn)品，其包括作為活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及該藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。
背景技術(shù)：
癌癥是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病，目前全球癌癥死亡人數(shù)高于艾滋病、結(jié)核病和瘧疾死亡人數(shù)的總和，已成為全球頭號(hào)殺手[1]。全世界每年死于惡性腫瘤的人數(shù)超過(guò)700萬(wàn)，其中中國(guó)約有160多萬(wàn)人。美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)負(fù)責(zé)人約翰.塞弗林說(shuō)，如今全球每8名死者中就有I人死于癌癥。而白血病是一類(lèi)造血系統(tǒng)的惡性疾病，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，占腫瘤發(fā)病率的第六位,在我國(guó)各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占男性的第6位和女性的第8位，在兒童及35歲以下的死亡率中占第I位。WHO預(yù)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，新增癌癥病例和癌癥患者死亡率也將會(huì)以每年1%的速度遞增，而在中國(guó)、俄羅斯和印度這些國(guó)家增長(zhǎng)速度會(huì)更快，估計(jì)到2030年全球?qū)⒖赡苡?500萬(wàn)人遭受癌癥的折磨，將新增2700萬(wàn)癌癥病例，死于癌癥的人數(shù)將達(dá)到1700萬(wàn)人，這一數(shù)字對(duì)許多國(guó)家的健康護(hù)理體系來(lái)說(shuō)是難以承受的。近年來(lái)，隨著臨床上多種抗生素的大量應(yīng)用，已經(jīng)導(dǎo)致了多藥耐藥問(wèn)題的出現(xiàn)。青霉素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲基異噁唑、四環(huán)素類(lèi)、氟奎諾酮、氯霉素、萬(wàn)古霉素等抗生素的耐藥及多藥耐藥 的致病菌的感染也逐年呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重的威脅人類(lèi)的健康。因此常規(guī)抗生素的抗性增加問(wèn)題已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)新的抗生素的需求激勵(lì)了人類(lèi)治療學(xué)對(duì)發(fā)展抗菌肽的興趣[2_4]。抗菌肽是生物防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)抗外源性病原體的肽類(lèi)物質(zhì)，是生物天生的、非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前研究者已經(jīng)從細(xì)菌、昆蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、人體和植物體中分離得到了上千種抗菌肽[3_5]。大多數(shù)天然分離的抗菌肽及數(shù)千種由它們改造而來(lái)的抗菌肽都具有廣譜的抗菌活性。它們大多能夠殺死革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，令人振奮的是有一小部分的抗菌肽已被證明具有抗腫瘤、抗病毒的活性[4_11]，一些抗菌肽也被證明具有中和脂多糖以及恢復(fù)適當(dāng)免疫應(yīng)答的能力[5]。越來(lái)越多的研究提出了一些陽(yáng)離子抗菌肽，這些抗菌肽對(duì)細(xì)菌有毒性作用但是對(duì)哺乳動(dòng)物的正常細(xì)胞無(wú)毒性作用。這些研究相當(dāng)大程度上提高了陽(yáng)離子抗菌肽的重要性，無(wú)論是人工合成的還是從天然物中提取的抗菌肽對(duì)于增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的免疫力和作為臨床上使用的抗生素都具有非常大的潛力。目前，一些抗菌肽已經(jīng)參與臨床前和臨床試驗(yàn)包括促進(jìn)傷口愈合，治療囊性纖維病，輸尿管感染，痤瘡，以及參與干細(xì)胞移植[12 15]。Anoplin是最近從獨(dú)居黃蜂毒液中分離得到的一種迄今發(fā)現(xiàn)的最短的具有線(xiàn)性α-螺旋結(jié)構(gòu)的抗菌肽[16]，僅由10個(gè)氨基酸組成,其序列為:Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-1le-Lys-Thr-Leu-Leu-NH2。研究發(fā)現(xiàn)Anoplin具有明顯的對(duì)抗革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的作用，而對(duì)人類(lèi)的紅血球無(wú)溶血作用[17]。但是到目前為止還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道該迄今發(fā)現(xiàn)的自然界存在的最小的線(xiàn)性多肽是否具有抗腫瘤的作用。因此，本發(fā)明成果將來(lái)若能市場(chǎng)化，市場(chǎng)空間將比較龐大，發(fā)展前景也十分可觀(guān)。附:抗菌肽Anoplin的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列:Gly-Leu-Leu-Lys-Arg-1le-Lys-Thr-Leu-Leu-NH
發(fā)明內(nèi)容
為了向腫瘤患者提供治療腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀的新途徑或提供更廣泛的選擇，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽Anoplin具有顯著的抗腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀的作用。因此，本發(fā)明一方面提供了一種治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀或抑制腫瘤細(xì)胞的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的抗菌肽Anoplin。本發(fā)明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制備用于治療腫瘤的藥物、藥劑或藥物組合物中的用途。本發(fā)明的再一方面提供了 一種藥學(xué)產(chǎn)品，其包括作為活性成分的抗菌肽Anoplin;以及包括該涉及藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。


圖1為Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞作用24h，48h，72h和96h的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中:(A)MEL 細(xì)胞；(B) K562 細(xì)胞；(C) TE-1 細(xì)胞；(D) Bel-7404 細(xì)胞；圖2 為 Anoplin 對(duì) MEL 細(xì)胞在 24h (A)，48h (B) , 72h (C)和 96h (D)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)作用的可見(jiàn)光顯微鏡圖片；圖3為PI染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的影響，其中:(A)MEL細(xì)胞對(duì)照組和不同劑量Anoplin處理組的PI熒光染色照片；(B)K562細(xì)胞對(duì)照組和不同劑量Anoplin處理組的PI熒光染色照片；圖4為掃描電鏡技術(shù)檢測(cè)Anoplin處理前后對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜表面形態(tài)的影響。(A)未經(jīng)加藥處理的MEL細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，有大量的微絨毛。(B)加入162μΜ的Anoplin處理的MEL細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)大量孔洞，細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄。(C)加入100 μ M Anoplin處理的MEL細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)部分破壞，細(xì)胞內(nèi)容物滲出。(D)未經(jīng)加藥處理的Κ562細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜表面光滑。(E)加入300 μ M Anoplin處理的Κ562細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)斷裂和縫隙。(F)加入225 μ M Anoplin處理的Κ562細(xì)胞，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)部分破壞，出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞內(nèi)容物滲出。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的發(fā)明人選用人慢性粒性白血病細(xì)胞Κ562，小鼠紅白血病細(xì)胞MEL，人食管癌細(xì)胞TE-1和人肝癌細(xì)胞Bel-7404為腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽Anoplin具有抗腫瘤作用。因此，本發(fā)明一方面提供了一種治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀的方法，其中包括向所述受試者施用有效量的抗菌肽Anoplin。本發(fā)明也提供了一種抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其包括將所述腫瘤細(xì)胞與抗菌肽Anoplin接觸的步驟。本發(fā)明的另一方面提供了抗菌肽Anoplin在制備用于治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤相關(guān)癥狀或抑制腫瘤細(xì)胞增殖的藥物或藥劑或藥物組合物中的用途。本發(fā)明的再一方面提供了一種藥學(xué)產(chǎn)品(例如藥物或藥劑)或藥物組合物，其包括作為活性成分的抗菌肽Anoplin ;以及包括該涉及藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。對(duì)于本發(fā)明所述的受試者，其優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為人。雖然本發(fā)明以腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了舉例說(shuō)明，但術(shù)語(yǔ)“腫瘤”可包括血癌及其他癌癥，以及相關(guān)癥狀。對(duì)于本發(fā)明的抗菌肽Anoplin，其可為任何能夠治療或緩解受試者中腫瘤或腫瘤癥狀的抗菌肽Anoplin。當(dāng)然,本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)抗菌肽Anoplin進(jìn)行各種修飾以提高其抗腫瘤功效。這類(lèi)修改的抗菌肽Anoplin也是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的作為活性成分的抗菌肽Anoplin可以連同藥學(xué)上可接受的載體一起使用。除活性成分外，本發(fā)明的方法、用途和產(chǎn)品還可以包含合適的藥學(xué)上可接受的載體，包括促進(jìn)活性化合物加工成制劑的賦形劑和助劑。例如適于注射或輸注的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射液和水性和非水性無(wú)菌混懸劑，所述無(wú)菌注射液可任選地包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑和能使制劑與目的接收者的血液等壓的溶質(zhì)，所述無(wú)菌混懸劑可包括懸浮劑和增稠劑。所述制劑可存在于單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿，并且可以保存在凍結(jié)干燥的(凍干)條件，在立即使用前僅需要加入無(wú)菌液體載體，例如注射用水。本發(fā)明的活性成分任選地可與固體賦形劑相組合，且任選地磨碎所得到的混合物，并且需要時(shí)，在加入合適的助劑后，加工顆粒的混合物，以獲得所需劑型。合適的賦形劑特別是填充劑例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素或淀粉制劑、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時(shí)，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。本發(fā)明的活性成分的有效量可為治療或緩解腫瘤或腫瘤癥狀或抑制腫瘤細(xì)胞的任何量，其可以是相當(dāng)于約0.l-15mg抗菌肽Anoplin,優(yōu)選0.2_12mg抗菌肽Anoplin的劑量單位。更優(yōu)選地，劑量單位包括約2-5mg的抗菌肽Anoplin。最優(yōu)選地,劑量單位包括約3-4mg的抗菌肽Anoplin。有效量的測(cè)定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的公開(kāi)內(nèi)容的啟示下。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以任意有效劑量數(shù)施用給藥受試者。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優(yōu)選從約4-10次劑量，最優(yōu)選約6次劑量。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在給藥過(guò)程中，以每三周給藥約一次的頻率將本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，給藥為通過(guò)注射。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以按用于通過(guò)任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式配制。本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品 (藥物、藥劑)或藥物組合物的劑量單位是基于常規(guī)進(jìn)行給藥受試者。例如，劑量單位可以給藥多于每日一次、每周一次、每月一次等。劑量單位可以是以?xún)纱?周為基礎(chǔ)給藥，即每周兩次，例如每三天一次。
如本文所使用的，“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內(nèi)的或開(kāi)放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語(yǔ)“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本發(fā)明適當(dāng)?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開(kāi)的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)踐。本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品中所包含的涉及該藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)可以含有如下內(nèi)容:適應(yīng)癥(例如腫瘤)、施用劑量(例如上述所示例性說(shuō)明的)以及可能產(chǎn)生的副作用等等。本文已采用的術(shù)語(yǔ)和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語(yǔ)，并且在此種術(shù)語(yǔ)和表述的使用中不預(yù)期排除所示和所述特征或其部分的任何等價(jià)物，但應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修飾在請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公開(kāi)，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開(kāi)的概念的修飾和變化，并且此類(lèi)修飾和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。為更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但這些實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對(duì)本申請(qǐng)的限制。實(shí)施例1.材料和方法1.1材料、儀器和試劑1.1.1細(xì)胞株及多肽人慢性粒性白血病細(xì)胞K562、小鼠紅白血病MEL細(xì)胞、人食管癌TE-1細(xì)胞和人肝癌Bel-7404細(xì)胞均購(gòu)自中 國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)?？咕腁noplin由杭州中肽公司采用固相多肽合成方法合成。1.1.2主要試劑
DMEM培養(yǎng)基Gibco公司
FBSHyclone 公丨丨I
臺(tái)盼藍(lán)Sigma公司
MTTSigma 公「I
DMSO(二甲基亞砜)Sigma-Aldrich 公司
PI聯(lián)科生物有限公司
Hoechst 33342Il云天生物科技有限公司
細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒凱基生物有限公司
細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒貝博生物有限公司
1.1.3試劑配制磷酸鹽緩沖液(Phosphatebuffer saline, PBS):8g 氯化鈉，0.2g 氯化鉀，2.9g 磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，IL去離子水，4°C保存。Anoplin用PBS配成3X 1(Γ3Μ的母液。配成的母液經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌后分裝至1.5mL的EP管中，_20°C分別保存。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)MEL，K562，TE-1 和 Bel-7404 細(xì)胞分別培養(yǎng)于含 10%FBS (Fetal bovine serum)的 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基中(含谷氨酰胺、IOmM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -l-piperazineethanesulfonic acid)、1.0mM 丙酮酸鈉、lOOU/mL 青霉素和100 μ g/mL鏈霉素)，于37°C、5%C02、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.2.2MTT比色法檢測(cè)抗菌肽Anoplin對(duì)細(xì)胞活力的影響(I)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心3分鐘，棄掉舊培養(yǎng)基，加適量新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)將細(xì)胞濃度均調(diào)整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔100μ1，則為3000個(gè)細(xì)胞每孔。小鼠骨髓細(xì)胞調(diào)至10000個(gè)細(xì)胞每孔。(3)懸浮細(xì)胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ 1，對(duì)照組細(xì)胞則加入20 μ I培養(yǎng)基。(4)藥物加完后加入8 0 μ I DMEM培養(yǎng)基將體系補(bǔ)充至200 μ I。(5)將細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%C02及飽和濕度環(huán)境下，在24h，48h，72h和96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入10 μ I (5mg/ml)MTT,培養(yǎng)4小時(shí)后離心并吸掉上層液體，向每孔加入150μ1 DMSO溶解紫色結(jié)晶，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm的光吸收值。根據(jù)下面公式計(jì)算藥物的抑制率:抑制率=(加藥組OD值-對(duì)照組OD值)/對(duì)照組OD值*100%1.2.3普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響(I)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心3分鐘，棄掉舊培養(yǎng)基，加適量新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(2)將細(xì)胞濃度均調(diào)整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔100μ1，則為3000個(gè)
細(xì)胞每孔。(3)懸浮細(xì)胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ 1，并且加入不同濃度的紫杉醇20μ I作為陽(yáng)性藥物對(duì)照，對(duì)照組細(xì)胞則加入20μ I培養(yǎng)基。(4)藥物加完后加入80 μ I DMEM培養(yǎng)基將體系補(bǔ)充至200 μ 1.
(5)將細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%C02及飽和濕度環(huán)境下，在24h，48h，72h和96h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。1.2.4小分子PI熒光染色實(shí)驗(yàn)觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響PI是一種小分子熒光染料，可以通過(guò)破損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞核中與核內(nèi)染色物質(zhì)結(jié)合，但是完整的細(xì)胞膜不能攝入P1.
(I)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MEL細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心3分鐘，棄掉舊培養(yǎng)基，加適量新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(2)將細(xì)胞濃度均調(diào)整為3X104/ml接種于96孔板中，每孔1ΟΟμl，則為3000個(gè)
細(xì)胞每孔。(3)懸浮細(xì)胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽20 μ 1，對(duì)照組細(xì)胞則加入20 μ I培養(yǎng)基。(4)藥物加完后加入80 μ I DMEM培養(yǎng)基將體系補(bǔ)充至200 μ 1.
(5)將細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%C02及飽和濕度環(huán)境下，在12h時(shí)吸掉培養(yǎng)基，加入稀釋后的PI染液50 μ 1，37°C、5%C02及飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)10分鐘后于熒光顯微鏡下觀(guān)察。(6)在GREEN濾光片下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)熒光變化情況。1.2.5掃描電鏡實(shí)驗(yàn)觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)細(xì)胞膜的作用(1)用多聚賴(lài)氨酸包被玻片，備用。(2)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，1000轉(zhuǎn)離心3分鐘，棄掉舊培養(yǎng)基，加適量新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。(3)先把包被好的玻片置于24孔板中，再將細(xì)胞濃度均調(diào)整為3X 104/ml接種于24孔板中，每孔400 μ 1，則為12000個(gè)細(xì)胞每孔。(4)懸浮細(xì)胞鋪完后立即加入稀釋為不同濃度的兩種抗菌肽80 μ 1，對(duì)照組細(xì)胞則加入80 μ I培養(yǎng)基。(5)藥物加完后加入520 μ I DMEM培養(yǎng)基將體系補(bǔ)充至1000 μ 1.
(6)將細(xì)胞培養(yǎng)在37°C、5%C02及飽和濕度環(huán)境下24h.
(7)加入Iml PBS漂洗5分鐘，洗兩次，洗掉培養(yǎng)基。(8)每孔加入lml3%戊二醛溶液，4度固定2小時(shí)。吸掉戊二醛，PBS洗兩次。(9)每孔加入lml2%四氧化鋨溶液，4度固定2小時(shí)。吸掉2%四氧化鋨溶液，PBS洗兩次。(10)乙醇梯度脫水:50%-70%-80%-90%-100% 每次 5 分鐘。(11)乙腈置換:50%-70%-80%-90%-100%每次15分鐘至純乙腈時(shí)將乙腈吸干，保鮮膜封口，扎小洞。(12)在凍干機(jī)里干燥大約45分鐘，樣品達(dá)到完全干燥。(13)鍍金膜。(14) Hitachi S-4800掃描電子顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞膜變化。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1MTT法檢測(cè)抗菌肽Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌肽Anoplin在24h，48h，72h和96h能劑量和時(shí)間依賴(lài)的抑制腫瘤細(xì)胞MEL (圖1A)，K562 (圖1B)，TE-1 (圖1C)和Bel-7404 (圖1D)的增殖。2.2普通光學(xué)顯微鏡觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的影響通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡實(shí)時(shí)觀(guān)察能更直觀(guān)的顯示出抗菌肽Anoplin對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，見(jiàn)圖2。2.3小分子PI熒光染色實(shí)驗(yàn)觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)細(xì)胞膜通透性的影響通過(guò)PI攝取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Anoplin處理后腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了明顯變化。Anoplin未處理的對(duì)照細(xì)胞在突光顯微鏡下看不到突光,而加了 Anoplin處理的腫瘤細(xì)胞除了了明顯的紅色熒光，且紅色熒光的數(shù)量隨著藥物濃度的增加而加強(qiáng)，見(jiàn)圖3。
2.4掃描電鏡實(shí)驗(yàn)觀(guān)察抗菌肽Anoplin對(duì)細(xì)胞膜的作用進(jìn)一步用掃描電鏡實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Anoplin處理腫瘤細(xì)胞后，細(xì)胞膜發(fā)生了明顯變化。未處理的對(duì)照細(xì)胞細(xì)胞膜表面光滑，可見(jiàn)大量微絨毛，而抗菌肽Anoplin處理后的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)了孔洞，斷裂，形態(tài)不規(guī)則等變化，見(jiàn)圖4?？梢?jiàn)抗菌肽抑制腫瘤細(xì)胞的增殖主要是通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜而起作用的。綜上可見(jiàn)，抗菌肽Anoplin對(duì)所測(cè)試的四種腫瘤細(xì)胞都具有抑制其生長(zhǎng)的作用。且其抑制機(jī)理可能是通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)而實(shí)驗(yàn)的。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在本發(fā)明的實(shí)踐中采用除具體例示那些外的方法和原材料等而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。任何此類(lèi)方法和原材料等的所有的本領(lǐng)域已知的功能等價(jià)物都預(yù)期包括在本發(fā)明中。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)理解，可對(duì)本說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求書(shū)中描述的本發(fā)明進(jìn)行各種變動(dòng)和修飾，且本發(fā)明包括所有此類(lèi)變動(dòng)和修飾。本發(fā)明還包括本說(shuō)明書(shū)中單獨(dú)或同時(shí)提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征中的任何2個(gè)或更多個(gè)的任何和所有組合。參考文獻(xiàn):
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權(quán)利要求
1.蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療受試者中白血病、緩解受試者中白血病癥狀或抑制白血病細(xì)胞增殖的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動(dòng)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中所述的哺乳動(dòng)物為人。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的蜂毒抗菌肽Anoplin是PEG化的。
全文摘要
本發(fā)明涉及蜂毒抗菌肽Anoplin在血癌治療中的用途。具體地，本發(fā)明涉及治療受試者中癌癥、緩解受試者中白血病癥狀或抑制白血病細(xì)胞增殖的方法；蜂毒抗菌肽Anoplin在制備用于治療白血病、緩解白血病癥狀或抑制白血病細(xì)胞增殖的藥物、藥劑或藥物組合中的用途；以及涉及一種藥學(xué)產(chǎn)品，其包括作為活性成分的蜂毒抗菌肽Anoplin和包括涉及該藥學(xué)產(chǎn)品的說(shuō)明書(shū)。
文檔編號(hào)A61K38/08GK103142994SQ20131006910
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月4日
發(fā)明者付彩云, 盧燕, 朱麗娜, 趙輔昆, 張世馥 申請(qǐng)人:浙江理工大學(xué)