一種可溶性微針疫苗貼片及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于經(jīng)皮給藥的可溶性微針貼片，特別涉及可溶性微針疫苗貼片及其制備方法。本發(fā)明的可溶性微針疫苗貼片是由不含目標藥物的可溶性微針基底部分和含有目標藥物的可溶性微針針體部分所組成；疫苗及適用于此種疫苗的佐劑的目標藥物負載在可溶性微針針體的前端，疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑是負載在納米顆粒上，且納米顆粒是均勻地分布在溶性微針針體的前端；所述可溶性微針疫苗貼片的基質(zhì)材料是生物相容性的水溶性高分子材料。本發(fā)明制作的適用于疫苗經(jīng)皮免疫的可溶性微針疫苗貼片，其可溶性微針針體具有足夠的硬度，能有效刺穿皮膚表層的角質(zhì)層，進入皮膚的針體的前端部分可以實現(xiàn)快速溶解并釋放出儲存在針體的前端中的目標藥物。
【專利說明】一種可溶性微針疫苗貼片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，特別涉及以具有生物相容性的水溶性高分子材料作為基質(zhì)制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片及其制備方法。
【背景技術】
[0002]目前大部分臨床治療藥物以及疫苗都是采用注射手段進行給藥。注射雖然具有快速、低成本以及可以適用于各種類型藥物的優(yōu)點，但是卻必須由技術熟練的護士進行操作，不適用于病人自己給藥。同時注射手段也存在因針頭反復利用帶來各種傳染病的風險。經(jīng)皮給藥克服了上述缺點并以其快速簡單的給藥方式，越來越受到人們的關注。
[0003]針對疫苗而言，皮膚中含有朗格漢斯細胞(Langerhans cells, LCs)和樹突細胞(dendritic cells, DCs)等大量的專職抗原呈遞細胞(antigen-presentingcells, APC),使得皮膚成為一個良好的免疫接種位點(Bos JD, KapsenbergML.The skin immune system:progress in cutaneous b1logy.1mmunolToday1993;14 (2):75 - 8 ;Banchereau J，Steinman RM.Dendritic cells and thecontrol of immunity.Naturel998;392 (6673):245 - 52 ；Kupper TSjFuhlbriggeRC.1mmune surveillance in the skin:mechanisms and clinical consequences.Nat Rev Immunol2004;4(3):211 - 22)0在經(jīng)皮免疫中，由于免疫位點有更多的APC使得經(jīng)皮免疫要比肌肉注射節(jié)省藥劑量(Charest AFj McDougall J, GoldsteinMB.A randomized comparison of intradermal andintramuscular vaccinat1nagainst hepatitis B virus in incident chronic hemodialysis patients.AmJKidney Dis 2000;36 (5):976 - 82 ；Egemen A，Aksit Sj Kurugol Zj Erensoy S，BilgicA，Akilli M.Low-dose intradermal versusintramuscular administrat1nof recombinant hepatitis B vaccine: a comparison of immunogenicityininfants and preschool children.Vaccinel998;16 (16):1511 - 5 ;SabchareonA,Chantavanich P，Pasuralertsakul S， Pojjaroen—Anant C，PrarinyanupharbV，Attanath P，et al.Persistence of antibodies in children after intradermal orintramuscularadministrat1n of preexposure primary and booster immunizat1nswith purified Vero cell rabiesvaccine.Pediatric Infect Dis J1998;17 (11):1001 -7)。但是目前研究表明疫苗經(jīng)皮免疫傾向于誘導更強的輔助性T細胞2(Th2)型體液免疫應答，對許多疾病而言輔助性T細胞I(Thl)型的細胞免疫應答也是必須的(Fu S.QuanjiiDosesparing enabled by skin immunizat1n with influenza virus-like particle vaccineusing microneedles，，，J.Control.Release.147 (2010) 326 - 332 ；K outsonanos D.G，uTransdermal Influenza Immunizat1n with Vaccine-Coated MicroneedleArrays”，Transdermal Vaccinat1n.4(2009)47-73)。因此需要選擇合適的佐劑和抗原的呈遞方式來提高經(jīng)皮免疫所誘導的細胞免疫反應應答，實現(xiàn)體液免疫反應和細胞免疫反應的平衡。研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒負載抗原后，在經(jīng)皮免疫過程中納米顆?？梢员黄つw中的APC直接吞噬從而誘導細胞免疫。更重要的是很多納米顆粒材料本身也具有佐劑的功能，并且其中直徑在30~300納米的免疫剌激復合物(Immune stimulating complex, ISCOM)更容易通過剌激Toll受體活化APC，誘導細胞免疫反應(Behazine Combadierej BriceMahe.Particle-based vaccines for transcutaneous vaccinat1n.Comparative Immunology, Microb1logy&Infect1us Diseases31 (2008) 293 - 315)。目前在經(jīng)皮免疫中多種納米顆粒被開發(fā)出來作為疫苗的載體比如:聚乳酸聚羥基乙酸(PLGA) (HedleyML,Curley Jj Urban R.Microspheres containing plasmid-encoded antigens elicitcytotoxic T-cell responses.Nat Med 1998 ; 4(3):365 - 8 ；Denis-Mize KS，DupuisM，MacKichan ML, Singh M，Doe Bj O^Hagan D，et al.Plasmid DNA adsorbed onto cat1nicmicroparticles mediates target gene express1n and antigen presentat1n bydendritic cells.Gene Ther 2000; 7 (24): 2105 - 12)，聚乳酸(PLA)，聚原酸酯(POE), ^質(zhì)體，免疫剌激復合物(ISCOMS)和殼聚糖(Reddy STj Swartz MAj Hubbell JA.Targetingdendritic cells with b1materials:developing the next generat1n of vaccines.Trends Immunol2006; 27 (12):573 _9)等。但是傳統(tǒng)的經(jīng)皮給藥方式，由于納米顆粒粒徑較大，受到皮膚角質(zhì)層的阻擋，藥物透過率低，導致藥物有效利用率低。因此經(jīng)皮給藥系統(tǒng)必須能夠有效地使藥物穿過皮膚表面角質(zhì)層的阻擋，提高藥物的有效利用率。
[0004]隨著微加工技術的發(fā)展，多種可以進行經(jīng)皮給藥的微針給藥系統(tǒng)被發(fā)展起來。微針不但可以剌穿皮膚表面角質(zhì)層，完成藥物的經(jīng)皮輸送，而且其剌入的深度又不觸及神經(jīng)，不會引起疼痛和皮膚的損傷。其中流感疫苗(0.121111，￥.6.23111^^11，1.Yej Z.Y.Wenj Y.L.Gaoj L.Pan，1.Skountzouj H.S.Gill，M.R.Prausnitzj C.L.Yang, R.W.Compansj Immunizat1n by vaccine-coated microneedle arrays protects againstlethal influenza virus challenge, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.106 (2009) 7968 - 7973 ；D.G.Koutsonanosj M.d.P.Martin, V.G.Zarnitsynj S.P.Sullivan, R.W.Compansj M.R.Prausnitzj 1.SkountzoujTransder mal influenza immunizat1n with vaccine-coatedmicroneedle arrays, PLoS 0ne4 (2009)e4773)、乙肝疫苗(Α.Κ.Andrianov，D.P.DeCollibus，H.A.Gillis，Η.H.Khaj A.Marin, M.R.Prausnitz，L.A.Babiukj H.Townsend, G.Mutwirij Poly[di (carboxylatophenoxy)phosphazene is a potent adjuvantfor intradermal immunizat1n, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.106 (2009) 18936 - 18941)，丙肝 DNA 疫苗(H.S.Gill, J.Soderholm，M.R.Prausnitzj M.Sallberg ，Cutaneousvaccinat1n using microneedles coated with hepatitis C DNA vaccine,GeneTher.17(2010)811 -814)等在涂布針(coating)中得到使用，并且在小鼠免疫試驗中了取得了比同劑量肌肉注射免疫更好的免疫球蛋白G (IgG)滴度。但是由于涂布針微針載藥量低，而且在疫苗應用中難以跟佐劑，尤其是納米顆粒佐劑同時使用，影響了涂布針在納米顆?？乖d體中的應用。在微針使用中還可以將實心微針作用于皮膚形成藥物通過的微孔道，然后將藥物貼劑敷在微針作用后位置，讓藥物經(jīng)過微孔道輸送入皮膚內(nèi)。雖然這種方法可以滿足疫苗和佐劑的同時使用，但是使用貼劑時，作用時間過長，藥物利用率低。更重要的是對于那些傳統(tǒng)的以金屬以及單晶硅為材料的微針在使用過程中存在針體折斷殘留在皮膚中的潛在風險。因此微針給藥系統(tǒng)仍然需要進一步的改進，得到一種使用簡單，載藥量高，而且可以適用于多種藥物，在疫苗利用可以做到與佐劑聯(lián)合使用的微針給藥系統(tǒng)。[0005]由水溶性高分子材料作為基質(zhì)制作的可溶性(dissolving)微針或者叫做自溶性(self-dissolving)微針被開發(fā)出來。其中目標藥物被混勻在微針針體制作基質(zhì)中，制成含藥微針，當針體插入皮膚中后，伴隨著針體的溶解藥物釋放到皮膚內(nèi)。通過選用不同的基質(zhì)可以控制針體在皮膚中的溶解速度，實現(xiàn)快速給藥或者緩釋給藥。例如以麥芽糖(日本專利特開2003-238347號公報；日本專利特開2005-154321號公報；日本專利特開2005-152180號公報)、蠶絲蛋白(國際專利W02012/054582A2 )、透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素、聚乙烯吡咯燒酮(Polyvinyl Pyrrolidone, PVP)、聚甲基乙烯基醚和馬來酐復合物(copolymer of methy vinyl ether and maleic anhydeide, PMVE/MA)以及多種多糖組合等作為基質(zhì)來制作可溶性微針(Akira Yamamoto, “The developmentand characteristics of novel microneedle arrays fabricated from hyaluronicacid, and their applicat1n in the transdermal delivery of insulin，，，Journal of Controlled Release xxx(2012)xxx ；Chien~Chung Fu 和 Hsing-Wen Sung，“Multidrug release based on microneedle arrays filled with pH-responsivePLGA hollow microspheres，，，B1materials33 (2012) 5156-165 ；Ryan F.Donnelly,“Microneedle-mediated intradermal nanoparticle delivery:Potential for enhancedlocal administrat1nof hydrophobic pre-formed photosensitisers，，，Photodiagnosisand Photodynamic Therapy (2010) 7, 222一231 ;J.C.Birchall，“Low temperaturefabricat1n of b1degradable sugar glass microneedles fortransdermal drugdelivery applicat1ns”，Journal of Controlled Releasel58 (2012) 93 - 101 ;);上述材料中可以滿足在室溫條件下添加藥物，并且不影響針體硬度及形態(tài)的主要有PVP、HA和硫酸軟骨素。
[0006]在目前的可溶性微針經(jīng)皮給藥研究中，流感疫苗(S.P.Sullivan, D.G.Koutsonanosj M.D.Martin, J.W.Lee, V.Zarnitsynj S.0.Choi, N.Murthyj R.W.Compansj 1.SkountzoujM.R.Pr ausnitzj Dissolving polymer microneedle patches for influenzavaccinat1n, Nat.Med.16 (2010) 915 - 920 ；A.P.Raphael, T.W.Prow, M.L.Crichton, X.F.Chen,G.1.P.Fernando, M.A.F.KendalI, Targeted,needle — freevaccinat1ns in skin using multi layered,densely-packed dissolving microproject1narrays, Smal 16 (2010) 1785 - 1793)、乙肝表面抗原(H.J.H.B.Hirschbergj G.G.P.V.deWijdevenj A.B.Kelderj G.P.J.M.van den Dobbelsteenj G.F.A.Kerstenaj B1needles (TM)as vaccine carriers,Vaccine26 (2008)2389 - 2397),霍亂疫苗(Η.Hirschberg，G.deWijdevenj H.Kraanj J.P.Amori j，G.F.A.Kerstenj B1needles as alternative deliverysystem for hepatitis B vaccine, J.Control.Releasel47 (2010) 211 - 217.)均表現(xiàn)出比肌肉注射免疫更好的免疫效果。這說明可溶性微針應用于疫苗的經(jīng)皮給藥是可行的。Chien-Chung Fu和Hsing-Wen Sung報道了用含有中空的PLGA納米顆粒的基質(zhì)制作可溶性微針，實驗結果顯示將PLGA納米顆粒添加到可溶性微針針尖后并沒有影響納米顆粒及微針真針尖自身的性質(zhì)(C.J.Kej Y.J.Linj Y.C.Huj I L Chiangj K.J.Chenj I C.Yang, H.L.Liuj C.C.Fuj H.W.Sung, Multidrug release based on microneedle arrays filled withpH-responsive PLGA hollow microspheres，B1materials33(2012)5156-165)。
[0007]絕大多數(shù)疫苗必須與佐劑聯(lián)合使用才能發(fā)揮有效地免疫保護效果，然而在現(xiàn)有的可溶性微針研究中，佐劑和疫苗的聯(lián)合使用并沒有對免疫效果產(chǎn)生顯著的改善。因此在可溶性微針疫苗制劑的實用化開發(fā)中如何有效地聯(lián)合使用疫苗和佐劑成為一個必須要解決的問題。本發(fā)明正是致力于解決疫苗和佐劑在可溶性微針中的聯(lián)合使用問題。
[0008]在可溶性微針的制作過程中，制作方法也是多種多樣，例如:在參考文獻(美國專利US2009/0182306A1 ;國際專利W02012/023044A1)中公開了的可以用多種可溶性物質(zhì)制作可溶性微針，尤其說明了以輕甲基纖維素(carboxymethyIcellulose, CMC)為基質(zhì)制作的可溶性微針，并公開了使用離心和真空的方法使溶液進入模具的針孔并制作可溶性微針。此外用拉拽方式(國際專利W02008/010681A1)和重物壓力(國際專利W02012/054582A2)等方法也被用來制作可溶性微針。為了有效地利用藥物，理想的微針是使藥物僅存在于能有效進入皮膚內(nèi)的微針針體的部位。采用上述離心方法，在中國專利CN101868229A中提供了一種利用硫酸軟骨素作為基質(zhì)，制作的可溶性微針中藥物僅僅分布在針體位置；在文獻(Mark R.Prausnitz, “Fabricat1n of Dissolving Polymer Microneedles forControlled Drug Encapsulat1n and Delivery:Bubble and Pedestal MicroneedleDesigns”, Journal of Pharmaceutical Acience, 99 (2010))中也報道了以 PVP/聚乙烯酉享(PVA)為基質(zhì)制作的僅在部分針尖載藥的可溶性微針。
[0009]但是現(xiàn)在常用的可溶性微針制作方法中，離心方法操作不便，不適于大規(guī)模的使用；真空制作微針的方法不便于制作只在部分針尖載藥的微針；使用重物壓力法會因為模具微孔中的氣體不能完全排除，進而導致制作的微針針尖不夠尖銳，影響實際應用。因此開發(fā)一種新型的方便快捷的可溶性微針制作方法也是本發(fā)明要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了解決【背景技術】中存在的問題，本發(fā)明提供一種用水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗 經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片。本發(fā)明的可溶性微針疫苗貼片是由不含目標藥物的可溶性微針基底部分和含有目標藥物的可溶性微針針體部分所組成，疫苗及其佐劑負載在納米顆粒上并均勻的分布在可溶性微針針體部分的前端，實現(xiàn)疫苗和佐劑在可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥中的有效聯(lián)合使用，從而起到調(diào)節(jié)疫苗免疫應答的功能，提高Thl型免疫反應的效果，而且納米顆粒具有緩慢釋放目標藥物的特性，能進一步提高疫苗的免疫應答效果。
[0011]本發(fā)明進一步提供一種適合上述可溶性微針疫苗貼片的制備方法，并且通過優(yōu)化可溶性微針疫苗貼片的制備方法實現(xiàn)通過一種簡單有效的方法來制作由不含目標藥物的可溶性微針基底和含有目標藥物的可溶性微針針體所組成的可溶性微針疫苗貼片。
[0012]本發(fā)明的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片(也可簡單描述為可溶性微針)如圖1所示，是由不含目標藥物的可溶性微針基底和含有目標藥物的可溶性微針針體所組成，其中所述的目標藥物負載在所述的可溶性微針針體的前端；所述的目標藥物是疫苗及適用于此種疫苗的佐劑，所述的疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑是負載在納米顆粒上，并且所述的納米顆粒是均勻地分布在所述的可溶性微針針體的前端；所述納米顆粒具有緩慢釋放目標藥物的功能；所述納米顆粒具有改善疫苗免疫應答的功能。
[0013]本發(fā)明中所述的疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑是負載在納米顆粒上，其中疫苗:佐劑:納米顆粒的重量比在1::1:1~1:10:50范圍之內(nèi)。優(yōu)選疫苗、佐劑和納米顆粒在所述的可溶性微針針體中所占的總重量為0.1%~50% ;更優(yōu)選在所述的可溶性微針針體中所占的總重量為1%~15%。
[0014]優(yōu)選地，所述的可溶性微針基底和可溶性微針針體的材料都是水溶性高分子材料，選自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、透明質(zhì)酸鈉(HA)、硫酸軟骨素(CS)中的一種或者幾種。
[0015]優(yōu)選地，所述的水溶性高分子材料的重均分子量范圍為2000~100000，優(yōu)選重均分子量范圍為6000~40000。作為本發(fā)明中可溶性微針疫苗貼片的制作材料，優(yōu)選重均分子量為40000的PVP K30、重均分子量為7000~8000的HA、重均分子量為10000的CS和重均分子量為30000的CS中的一種。
[0016]本發(fā)明中作為制作可溶性微針疫苗貼片所使用的基質(zhì)材料是安全的生物相容性的水溶性高分子材料。所述的水溶性高分子材料干燥后必須有足夠的強度，保證可溶性微針針體的針尖可以有效刺穿皮膚。同時進入皮膚內(nèi)部的可溶性微針針體部分又能迅速吸取皮膚中的水分實現(xiàn)快速溶解，從而將可溶性微針針體的前端含有的目標藥物釋放入皮膚中。此外，本發(fā)明中所述的水溶性高分子材料有較好的分散劑作用，可以將不溶性藥物，尤其是納米顆粒均勻的分散在水溶性高分子材料中，并且納米顆粒在一定濃度范圍不影響可溶性微針針體的強度。
[0017]本發(fā)明中所述的可溶性微針疫苗貼片的基質(zhì)材料，優(yōu)先選擇使用PVP和HA的混合水溶性高分子材料(重量比為1:1~0.1:0.9)，以及CS和HA的混合水溶性高分子材料(重量比為1:1~0.1:0.9);作為可溶性微針疫苗貼片的制作材料，上述可溶性微針疫苗貼片的基質(zhì)材料在使用時，在背襯制作液中所占的重量百分含量可以在30wt%~80wt%之間，在此濃度范圍內(nèi)混合水溶性高分子材料有較好的流動性，便于在制作可溶性微針疫苗貼片的過程中容易鋪蓋在反轉模具的表面。
[0018]本發(fā)明中所述的目標藥物是負載在可溶性微針針體的前端，負載有目標藥物的可溶性微針針體部分優(yōu)選占整個可溶性微針針體總長度的20~80%(從可溶性微針針體的針尖起至可溶性微針針體的底端方向)，以避免目標藥物集中存在針體少量部分形成局部的高濃度藥物區(qū)域，影響了可溶性微針針體的硬度。同時可溶性微針針體的后端及可溶性微針疫苗貼片的背襯中不含有目標藥物，避免了因可溶性微針針體的后端及背襯不能進入皮膚釋放藥物而造成的藥物浪費，實現(xiàn)藥物利用效率最大化。
[0019]優(yōu)選地，所述的可溶性微針針體的高度為150~800微米，優(yōu)先選用高度為300~700微米的可溶性微針針體，可溶性微針針體的針尖的角度為30~40度。
[0020]在本發(fā)明中更優(yōu)先選用可溶性微針針體的針體的高度為650微米，可溶性微針針體的針尖的角度為30度的可溶性微針針體。上述的可溶性微針針體更適合于采用手壓方式進行可溶性微針疫苗貼片的經(jīng)皮給藥。
[0021]優(yōu)選地，所述的納米顆粒為聚羥基乙酸(poly(D, L-1actic-co-glycolicacid)copolymers, PLGA)納米顆粒、聚乳酸(poly (D, L-lactide)，PLA)納米顆粒、聚原酸酯(poly (ortho esters), POE)納米顆粒、脂質(zhì)體納米顆粒、殼聚糖納米顆粒中的一種；所述的納米顆粒的粒徑是10~100nm,優(yōu)先選取粒徑為100~500nm的納米顆粒。
[0022]本發(fā)明中所述的納米顆粒優(yōu)選為中空的納米顆粒。所述的中空的納米顆粒中優(yōu)先選擇中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒作為疫苗和佐劑的載體。[0023]優(yōu)選地，所述的納米顆粒在所述的可溶性微針針體中的重量百分含量在0.lwt%~20wt%之間，優(yōu)先選擇在lwt%~10wt%范圍之內(nèi)。
[0024]雖然在文獻(Chien-ChungFu 和 Hsing-Wen Sung, “Multidrug release basedon microneedle arrays filled with pH-responsive PLGA hollow microspheres，，，B1materials33 (2012) 5156-165)中有在可溶性微針中添加中空PLGA納米顆粒的報道，但是并沒有說明它們添加中空PLGA納米顆粒的作用。中國專利CN101868229A中雖然提到在可溶性微針中使用的目標物質(zhì)可以是微膠囊以及膠囊類物質(zhì)，但是所述膠囊微粒的粒徑在10微米以下,而本發(fā)明中適用的中空納米顆粒最優(yōu)的粒徑為100~500nm,而且中國專利CN101868229A中的微膠囊內(nèi)的目標物質(zhì)中提到的是肽、蛋白質(zhì)、核酸或者多糖，沒有限定目標物質(zhì)是可以用來提高疫苗免疫能力的疫苗及佐劑物質(zhì)。而且以上專利或文獻都沒有限定納米顆粒在可溶性微針中所占的重量百分含量。在不影響可溶性微針的針尖硬度的前提下，本發(fā)明中所述的納米顆粒在所述的可溶性微針針體中的重量百分含量在0.lwt%~20wt%之間，優(yōu)先選擇在lwt%~10wt%范圍之內(nèi)。
[0025]優(yōu)選地，所述的疫苗可以選自減毒活疫苗、亞單位疫苗、多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗中的一種。
[0026]本發(fā)明中所述的減毒活疫苗是將病原微生物(細菌或病毒)在人工訓育的條件下，促使病原微生物產(chǎn)生定向變異，使其極大程度地喪失致病性，但仍保留一定的剩余毒力、免 疫原性和繁衍能力。優(yōu)先選用麻疹疫苗、風疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙腦減毒活疫苗或手足口疫苗。
[0027]本發(fā)明中所述的亞單位疫苗是從細菌或病毒培養(yǎng)物中，以生物化學和物理方法提取純化有效特異性抗原制成的疫苗，或者是通過基因工程菌表達純化有效特異性抗原制成的疫苗。優(yōu)先選用乙肝疫苗或流感疫苗。
[0028]本發(fā)明中所述的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗是由長鏈糖分子構成，如細菌的多糖莢膜。優(yōu)先選用肺炎球菌疫苗、A群流腦疫苗或A+C群流腦疫苗。
[0029]本發(fā)明中所述的DNA疫苗是將編碼某一種病原生物特異抗原的基因插入到DNA載體上，獲得的具有疫苗性質(zhì)的DNA疫苗。優(yōu)先選擇表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗。
[0030]本發(fā)明中所述的病毒載體疫苗是將遺傳改造的重組病毒作為載體，再從某一病原生物中獲得一段特定的基因，將獲得的一段特定的基因插入到重組病毒載體中，獲得的具有疫苗性質(zhì)的重組活病毒疫苗。所述的重組活病毒疫苗優(yōu)先選用痘病毒載體疫苗或腺病毒載體疫苗。所述的痘病毒載體疫苗優(yōu)先選用表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的痘病毒載體疫苗；所述的腺病毒載體疫苗優(yōu)先選用表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的腺病毒載體疫苗。
[0031]優(yōu)選地，所述的佐劑是本身不具抗原型，在與疫苗配合使用中可以通過提升對體液免疫反應的刺激來增強疫苗免疫應答的非特異性免疫增強劑。
[0032]優(yōu)選地，所述的佐劑需要與疫苗聯(lián)合使用，所述的佐劑優(yōu)先選擇Thl型(I型輔助性T細胞)佐劑，在Thl型佐劑中優(yōu)先選擇人未甲基化寡聚脫氧核苷酸(CpG 0ND)。
[0033]本發(fā)明中，中空陽離子脂質(zhì)體納米顆?？梢载撦dCpG OND和疫苗，并直接將CpGOND和疫苗呈遞給皮膚中的專職抗原呈遞細胞，從而提高CpG OND的佐劑效果，進而提高疫苗的免疫反應實現(xiàn)使用少量疫苗既可達到有效免疫保護作用的效果。并且負載疫苗和CpGOND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆?？梢詫⒁呙绾虲pG OND緩慢釋放，實現(xiàn)藥物的持續(xù)高效利用。
[0034]本發(fā)明的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片的制作是在密閉容器中并于2~5倍大氣壓下作用10~30秒鐘，使含有目標藥物的黏度優(yōu)選低于100厘帕(cP)的水溶性高分子材料的水溶液進入反轉模具的針孔中，在2°C~40°C的條件下干燥；然后加入黏度為600~2000厘帕(cP)的不含目標藥物的水溶性高分子材料的水溶液，放置于溫度為2°C~40°C的條件下干燥后形成可溶性微針貼片。
[0035]本發(fā)明的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片的制備方法包括以下步驟:
[0036](I)配制含有納米顆粒、疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑的水溶性高分子材料的水溶液作為針體制作液(即可溶性微針針體的制作液)，然后將針體制作液覆蓋到表面具有所需數(shù)量的針孔的反轉模具中；在密閉容器中于2~5倍大氣壓下作用10~30秒鐘，使針體制作液進入到所述的針孔中，回收反轉模具上的剩余針體制作液(回收后的針體制作液可再重復利用)；將已加入針體制作液的反轉模具于溫度為2°C~40°C的條件自然晾干，在反轉模具中得到可溶性微針針體，且負載有疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑的納米顆粒是均勻地分布在所述的可溶性微針針體的前端；
[0037](2)將水溶性高分子材料溶解于水中，得到濃度為30wt%~80wt%，黏度為600~2000厘帕(cP)的不含目標藥物的水溶性高分子材料的水溶液作為背襯制作液(即可溶性微針疫苗貼片的背襯制作液)，然后倒入步驟(1)覆蓋有針體制作液并干燥后得到的反轉模具中，室溫下放置；然 后置于密閉容器中，在密閉容器中于2~5倍大氣壓下作用I~10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然后將覆蓋有背襯制作液的反轉模具于溫度為2°C~40°C的條件下干燥(優(yōu)選干燥的溫度為4°C )，得到由不含目標藥物的可溶性微針基底和含有目標藥物的可溶性微針針體所組成的可溶性微針疫苗貼片。
[0038]所述的反轉模具可按照如下方法進行制備:將表面具有所需數(shù)量的微針針體的金屬微針模具作為母模模具，取預聚合的聚二甲基硅氧烷和交聯(lián)劑的混合物并覆蓋在母模模具上，在溫度為80°C下放置(一般放置的時間為30分鐘左右)，其中聚二甲基硅氧烷:交聯(lián)劑的重量比為10:1，得到表面具有與所述的母模模具上微針針體的形狀和數(shù)量相適配的所需數(shù)量的針孔的反轉模具，以用來作為制作可溶性微針疫苗貼片的模具。
[0039]所述的針體制作液中的水溶性高分子材料的水溶液的重量百分含量為5~10%。
[0040]所述的針體制作液中的疫苗:佐劑:納米顆粒的重量比在1:1:1~1:10:50范圍之內(nèi)。
[0041]所述的針體制作液的黏度優(yōu)選低于100厘帕。
[0042]所述的納米顆粒在所述的可溶性微針針體制作液中的重量百分含量在0.lwt%~20wt%之間,優(yōu)先選擇在lwt%~10wt%范圍之內(nèi)。本發(fā)明的可溶性微針疫苗貼片在使用時，將可溶性微針針體的針尖(如圖1中5所指部位)對準所作用的皮膚位置，用手按壓可溶性微針疫苗貼片的背襯(如圖1中I所指部位)，可溶性微針針體刺穿皮膚角質(zhì)層后進入表皮。本發(fā)明的可溶性微針疫苗貼片的針體可以在3~15分鐘內(nèi)將目標藥物釋放到皮膚內(nèi)。給藥時間優(yōu)選為10分鐘，此時可以保證刺入皮膚部分的可溶性微針針體的前端完全溶解在皮膚中并將目標藥物釋放入皮膚。
[0043]本發(fā)明的有益效果在于:可以通過一種簡單有效的方法制作由不含目標藥物的可溶性微針疫苗貼片的基底部分和含有目標藥物的可溶性微針疫苗貼片的針體部分組成所述的可溶性微針疫苗貼片，其中目標藥物負載在所述的可溶性微針疫苗貼片的針體的前端，實現(xiàn)疫苗和佐劑在可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥中的有效聯(lián)合使用，從而起到調(diào)節(jié)疫苗免疫應答，提高Thl型免疫反應的效果，并得到相對平衡的Thl和Th2型免疫應答。克服了疫苗在經(jīng)皮免疫時優(yōu)先激起Th2型免疫反應，Thl型免疫反應相對低下的缺點。此外可溶性微針疫苗貼片使用方便簡單，不需要技術熟練的護士來操作，適用于病人自己給藥。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1.本發(fā)明的可溶性微針疫苗貼片的整體示意圖。
[0045]圖2.本發(fā)明制備可溶性微針疫苗貼片所使用的金屬微針模具的示意圖。
[0046]圖3.本發(fā)明制備可溶性微針疫苗貼片所使用的與圖2所示的金屬微針模具相適配的PDMS反轉模具的示意圖。
[0047]圖4.本發(fā)明的實施例1和實施例2中以臺盼藍作為模式疫苗，圖中深色部分表示模式疫苗在可溶性微針針體上的分布位置。
[0048]圖5.本發(fā)明的實施例1和實施例2中制成的可溶性微針針體的前端含有臺盼藍的可溶性微針疫苗貼片作用于豬耳朵皮膚后留下的針孔。
[0049]圖6.本發(fā)明的實施例3和比較例1、2、3所使用的可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥后，實施例和各比較例的IgG滴度。
[0050]圖7.本發(fā)明的實施例3和比較例1、2、3所使用的可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥后，實施例和各比較例的IgG2a/IgGl的比例。
[0051]圖8.本發(fā)明的實施例4和比較例4、5、6所使用的可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥后的實施例和各比較例的IgG滴度。
[0052]圖9.本發(fā)明的實施例4和比較例4、5、6所使用的可溶性微針疫苗貼片經(jīng)皮給藥后的實施例和各比較例的IgG2a/IgGl的比例。
[0053]圖10.本發(fā)明實施例5的可溶性微針疫苗貼片(貼片I)的可溶性微針針體中負載的HBSAg的總釋放率。
[0054]圖11.本發(fā)明實施例5的可溶性微針疫苗貼片(貼片2)的可溶性微針針體中的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒負載的HBSAg的總釋放率。
[0055]附圖標記
[0056]1.可溶性微針疫苗貼片的基底(背襯)
[0057]2.可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體
[0058]3.可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體的前端(含藥部分)
[0059]4.可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體的后端(不含藥部分)
[0060]5.可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體的針尖
[0061]6.可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體的底端【具體實施方式】
[0062]以下結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，但是本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0063]實施例1
[0064](I)反轉模具的制備:依托表面有36個(6X6行)高約650微米，底端直徑約250微米的四面體形微針針體的母模模具(如圖2所示)，取預聚合的聚二甲基硅氧烷10克和交聯(lián)劑I克的混合物并覆蓋在母模模具上，在溫度為80°C下放置30分鐘左右，得到表面具有與所述的母模模具上微針針體的形狀和數(shù)量相適配的所需數(shù)量的針孔的反轉模具；反轉模具的表面含有36個(6X6行)深度約650微米，底端直徑約250微米的正方形的針孔(如圖3所示)；針孔的錐角的角度為35度；
[0065](2)分別將負載有臺盼藍和CpG OND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒(中空陽離子脂質(zhì)體納米顆?？砂凑毡容^例3的方法制備得到，并且負載的方法也可按照比較例3的方法)加入到表2中所示的溶液編號為1-11的溶液中，分別得到作為針體制作液的溶液A，其中:中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒:CpG OND:臺盼藍的重量比為10:5:1，負載有臺盼藍和CpGOND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒在針體制作液中所占的重量百分含量為10%;然后將得到的11個針體制作液分別覆蓋到步驟(1)得到的11個表面具有36個正方形的針孔的反轉模具中；在密閉容器中按照表1中所示的大氣壓A及作用時間A，使針體制作液進入到所述的36個正方形的針孔中，回收反轉模具上的剩余針體制作液(回收后的針體制作液可再重復利用);將已加入針體制作液的反轉模具于表1中所示的溫度A條件下自然晾干；在11個反轉模具中分別得到可溶性微針針體，且負載有臺盼藍和CpG OND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒是分別均勻地 分布在11個可溶性微針針體的前端，可溶性微針針體的針尖的角度為35度；
[0066](3)將CS、HA、PVP K30按照不同比例溶解到水中，分別得到表3中所示的溶液編號為1-12的溶液B作為背襯制作液，然后將從溶液編號為1-12的溶液B中選取的背襯制作液隨機的倒入步驟(2)得到的11個覆蓋有針體制作液并干燥后得到的反轉模具中，室溫下放置5分鐘；然后置于密閉容器中，在密閉容器中按照表1中所示的大氣壓B及作用時間B，使所述的36個正方形的針孔中殘存的空氣溢出；然后將11個覆蓋有背襯制作液的反轉模具于表1中所示的溫度B條件下自然晾干，將干燥后的11個可溶性微針疫苗貼片小心取下，分別得到選取自表3中溶液編號為1-12的高分子材料為主要基質(zhì)材料的含有36根微針針體所組成的可溶性微針疫苗貼片，可溶性微針針體的高度約為650微米，針尖的角度為35度(如圖4所示)。其中負載有臺盼藍和CpG OND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒主要負載在上述得到的可溶性微針疫苗貼片的36根微針針體的每一根微針針體的前端約130~520微米的長度區(qū)域，每一根微針針體的后端沒有負載有臺盼藍和CpG OND的中空陽離子脂質(zhì)體納米顆粒(如圖4所示)。
[0067]本實施例中使用的針體制作液及背襯制作液中選用的PVP K30的重均分子量為40000、PVP K17的重均分子量為8000、HA的重均分子量為2000或者7000、CS的重均分子量為30000或者100000。
[0068]可溶性微針疫苗貼片的使用方法:將上述得到的以表3中1-12組高分子材料組合為主要基質(zhì)材料的可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針針體的針尖(如圖1中的5所示)對準所作用的豬耳朵皮膚(豬耳朵皮膚的角質(zhì)層同人皮膚角質(zhì)層的厚度相當，可以用來替代人皮膚進行微針針體硬度的測試)，用手按壓可溶性微針疫苗貼片的背襯(如圖1中的I所示)，按壓的時間為lOmin，然后取下作用后的可溶性微針疫苗貼片。作用后的豬耳朵皮膚如圖5所示，表面有36個清晰的藍色針孔，藍色針孔為可溶性微針疫苗貼片的可溶性微針中的臺盼藍釋放到皮膚中所留，表明可溶性微針貼片的可溶性微針針體可以有效地刺穿皮膚并將可溶性微針貼片中的可溶性微針針體中的臺盼藍釋放到皮膚中。
【權利要求】
1.一種以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的可溶性微針疫苗貼片是由不含目標藥物的可溶性微針基底和含有目標藥物的可溶性微針針體所組成；其中所述的目標藥物負載在所述的可溶性微針針體的前端；所述的目標藥物是疫苗及適用于此種疫苗的佐劑，所述的疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑是負載在納米顆粒上，并且所述的納米顆粒是均勻地分布在所述的可溶性微針針體的前端； 所述的可溶性微針基底和可溶性微針針體的材料都是水溶性高分子材料。
2.根據(jù)權利要求1所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的目標藥物是負載在所述的可溶性微針針體的前端，其負載有目標藥物的可溶性微針針體部分占整個可溶性微針針體總長度的20~80%。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的可溶性微針針體的高度為150~800微米；所述的可溶性微針針體的針尖的角度為30~40度。
4.根據(jù)權利要求1所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑是負載在納米顆粒上，其中疫苗:佐劑:納米顆粒的重量比在1:1:1~1:10:50范圍之內(nèi)；疫苗、佐劑和納米顆粒在所述的可 溶性微針針體中所占的總重量的百分含量為0.1%~50%。
5.根據(jù)權利要求1所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的水溶性高分子材料的重均分子量范圍為2000 ~100000。
6.根據(jù)權利要求1或5所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的水溶性高分子材料選自聚乙烯吡咯烷酮、透明質(zhì)酸鈉、硫酸軟骨素中的一種或者幾種。
7.根據(jù)權利要求1或4所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的納米顆粒的粒徑是10~100nm ;所述的納米顆粒選自聚羥基乙酸納米顆粒、聚乳酸納米顆粒、聚原酸酯納米顆粒、脂質(zhì)體納米顆粒、殼聚糖納米顆粒中的一種。
8.根據(jù)權利要求7所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的納米顆粒為中空的納米顆粒。
9.根據(jù)權利要求1或4所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的疫苗選自減毒活疫苗、亞單位疫苗、多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗中的一種； 所述的佐劑是Thl型佐劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片，其特征是:所述的減毒活疫苗是麻疹疫苗、風疹疫苗、腮腺炎疫苗、卡介苗、乙腦減毒活疫苗或手足口疫苗； 所述的亞單位疫苗是乙肝疫苗或流感疫苗； 所述的多糖-蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗是肺炎球菌疫苗、A群流腦疫苗或A+C群流腦疫苗；所述的DNA疫苗是表達乙型肝炎表面抗原基因(S)的DNA疫苗； 所述的病毒載體疫苗是重組活病毒疫苗，所述的重組活病毒疫苗是痘病毒載體疫苗或腺病毒載體疫苗； 所述的Thl型佐劑是人未甲基化寡聚脫氧核苷酸。
11.一種根據(jù)權利要求1~10任意一項所述的以水溶性高分子材料作為基質(zhì)材料制作的適用于疫苗經(jīng)皮給藥的可溶性微針疫苗貼片的制備方法，其特征是:所述的制備方法包括以下步驟: (1)配制含有納米顆粒、疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑的水溶性高分子材料的水溶液作為針體制作液，然后將針體制作液覆蓋到表面具有所需數(shù)量的針孔的反轉模具中；在密閉容器中于2~5倍大氣壓下作用10~30秒鐘，使針體制作液進入到所述的針孔中，回收反轉模具上剩余的針體制作液；將已加入針體制作液的反轉模具于溫度為2°C~40°C的條件自然晾干，在反轉模具中得到可溶性微針針體，且負載有疫苗及其適用于此種疫苗的佐劑的納米顆粒是均勻地分布在所述的可溶性微針針體的前端； (2)將水溶性高分子材料溶解于水中，得到濃度為30wt%~80wt%，黏度為600~2000厘帕的不含目標藥物的水溶性高分子材料的水溶液作為背襯制作液，然后倒入步驟(1)覆蓋有針體制作液并干燥后得到的反轉模具中，室溫下放置；然后置于密閉容器中，在密閉容器中于2~5倍大氣壓下作用I~10分鐘，使所述的針孔中殘存的空氣溢出；然后將覆蓋有背襯制作液的反轉模具于溫度為2°C~40°C的條件下干燥，得到由不含目標藥物的可溶性微針基底和含有目標藥物的可溶性微針針體所組成的可溶性微針疫苗貼片。
12.根據(jù)權利要求11所述的制備方法，其特征是:所述的針體制作液中的水溶性高分子材料的水溶液的重量百分含量為5~10% ； 所述的針體制作液中的疫苗:佐劑:納米顆粒的重量比在1:1:1~1:10:50范圍之內(nèi)。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的制備方法，其特征是:所述的針體制作液的黏度低于100厘帕。
【文檔編號】A61K39/09GK104027324SQ201310071361
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權日:2013年3月6日
【發(fā)明者】高云華, 郭雷 申請人:中國科學院理化技術研究所