專利名稱：攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體dna的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因組的靶向修飾包括對基因組內(nèi)源性基因序列的改造或者在基因組的特定位置插入外源性基因片段。這項(xiàng)技術(shù)為研究特定基因功能提供了有力工具，此外研究人員可以利用該技術(shù)建立特定的動物模型來進(jìn)行基因功能研究或新藥物的研發(fā)。傳統(tǒng)的基因靶向修飾技術(shù)是依賴于自然狀態(tài)下的同源重組(Homologous recombination, HR),效率非常低，大約為10_6,因而大大限制了該技術(shù)的應(yīng)用。鋅指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)的出現(xiàn)給基因組靶向修飾帶來了希望。ZFN技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新的技術(shù)，通過人工設(shè)計(jì)的ZFN在基因組DNA的特定位置切割產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSB)，繼而通過細(xì)胞內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制對斷裂部位的基因進(jìn)行修飾。同自然狀態(tài)下的同源重組技術(shù)相比較，ZFN技術(shù)可以使基因組靶向修飾的效率提高了 IO3 IO5倍。ZFN介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修飾已經(jīng)在多種體外培養(yǎng)的細(xì)胞中獲得成功，包括人的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES)和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotentstem cells, iPS)、植物、果蠅、爪蟾、線蟲、斑馬魚、小鼠、大鼠等的細(xì)胞,顯示出該技術(shù)的廣泛適用性，這將有力地推動基因靶向修飾技術(shù)的應(yīng)用研究。由于ZFN介導(dǎo)的基因靶向修飾技術(shù) 需要將ZFN表達(dá)元件和供體DNA同時(shí)導(dǎo)入到細(xì)胞中，因此將ZFN表達(dá)元件和供體DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞的效率成為影響ZFN介導(dǎo)的基因靶向修飾的效率的重要因素。在體外實(shí)驗(yàn)中通常采用核轉(zhuǎn)染的方法，這種方法轉(zhuǎn)染效率較高，然而該方法只局限于部分細(xì)胞，對有些細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率仍然是很低的，且該方法無法在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中使用。腺病毒載體由于其諸多特點(diǎn)，如:宿主范圍廣、病毒滴度高、載體容量大等，成為將ZFN表達(dá)元件和供體DNA同時(shí)導(dǎo)入到靶細(xì)胞中的一種理想的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題在于提供一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問題在于為攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒提供一種新用途。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:缺失El和E3區(qū)，在缺失區(qū)插入了鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA。本發(fā)明在缺失的El區(qū)插入供體DNA、在缺失的E3區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件，或在缺失的El區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件、在缺失的E3區(qū)插入供體DNA。本發(fā)明的鋅指核酸酶表達(dá)元件是由真核啟動子與其下游的鋅指核酸酶基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。本發(fā)明的真核啟動子是Tet-on誘導(dǎo)性啟動子,該Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成-J個(gè)重復(fù)的四環(huán)素反應(yīng)元件，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA，在右側(cè)tightminiCMV的下游插入一對鋅指核酸酶基因，在鋅指核酸酶基因的3 ’端連接有轉(zhuǎn)錄終止信號；所述的兩個(gè)鋅指核酸酶基因間通過自剪切多肽相連；所說的轉(zhuǎn)錄終止信號是SV40pA、TKpA中的一種；miniCMV的序列如下:GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCtight miniCMV 的序列如下:GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。本發(fā)明的供體DNA是靶向該腺病毒所攜帶的鋅指核酸酶的識別位點(diǎn)，它由上、下游同源臂組成，上、下游同源臂分別是由距離該腺病毒載體攜帶的鋅指核酸酶的識別位點(diǎn)Ibp到5000bp堿基數(shù)的DNA序列組成，每條同源臂的長度為50bp到3000bp。本發(fā)明的供體DNA在上、下游同源臂之間插入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、報(bào)告基因表達(dá)元件、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種。

上述攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒的構(gòu)建方法由以下步驟組成:1、構(gòu)建腺病毒骨架載體以商業(yè)化的pAdEasy-Ι載體為基礎(chǔ)進(jìn)行改造。構(gòu)建腺病毒E3區(qū)穿梭載體，在E3區(qū)穿梭載體中插入IacZa篩選基因和Swa I酶切位點(diǎn)，通過同源重組和藍(lán)白斑篩選將Swa I酶切位點(diǎn)引入到腺病毒缺失的E3區(qū)，獲得可以在缺失的E3區(qū)插入外源基因的腺病毒骨架載體。2、構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體將真核啟動子、鋅指核酸酶基因、轉(zhuǎn)錄終止信號依次插入到腺病毒E3區(qū)穿梭載體中。3、構(gòu)建攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體將供體DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒El區(qū)穿梭載體，在上、下游同源臂之間插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種。4、將攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體與Swa I線性化的腺病毒骨架載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體，將攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體與攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體。5、將構(gòu)建好的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體通過磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化獲得純化的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒。攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。


圖1是pAdEasy-Ι載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是腺病毒E3區(qū)穿梭載體pE3 shuttle的結(jié)構(gòu)圖。圖3是腺病毒骨架載體pAd5 backbone的結(jié)構(gòu)圖。圖4是鋅指核酸酶表達(dá)元件Tet on AAVSl ZFN結(jié)構(gòu)圖。圖5是pEl/AAVSl donor載體的結(jié)構(gòu)圖。圖6是攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒結(jié)構(gòu)圖。圖 7 是 Ad5(E3)Tet on AAVSl ZFN/ (El)AAVSl donor 對 U2-0S 細(xì)胞中 AAVSl 位點(diǎn)靶向修飾效率檢測。圖8 是 pEl/AAVSl UP-CMV-eGFP-TKpA-DOWN 載體的結(jié)構(gòu)圖。

圖9是pE3 shuttle Swa I載體的結(jié)構(gòu)圖。圖10是小鼠部分活化凝血酶原激酶時(shí)間檢測結(jié)果。
具體實(shí)施方案下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1以攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒為例，該腺病毒的結(jié)構(gòu)如下:該腺病毒載體是5型腺病毒載體，缺失了 El區(qū)和E3區(qū)。在缺失的E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成-J個(gè)重復(fù)的四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE),在7個(gè)重復(fù)的TRE兩端連接有啟動子核心元件,包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,miniCMV的序列如下:GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTCtight miniCMV 的序列如下:GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC。在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tightminiCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA，也可以是ΤΚρΑ。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入一對鋅指核酸酶基因AAVSI ZFNtJE向AAVSl位點(diǎn)的一對(左側(cè)AAVSl ZFNL和右側(cè)AAVSl ZFNR)鋅指核酸酶基因之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體缺失的El區(qū)插入了靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離AAVSl ZFN識別位點(diǎn)Ibp的長度為500bp的上游同源臂和距離AAVSl位點(diǎn)3bp長度為500bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間插入了 Sal I酶切位點(diǎn)，也可以插入Cla1、Xba1、XhoI酶切位點(diǎn)中的任意一種。該腺病毒的構(gòu)建方法如下:1.腺病毒骨架載體的構(gòu)建以商業(yè)化的pAdEasy-Ι載體(安捷倫科技有限公司,Agilent technologies)為基礎(chǔ)，該載體是El區(qū)和E3區(qū)缺失的5型腺病毒(Ad5)骨架載體(如圖1)。將其改造為可以在缺失的E3區(qū)插入外源表達(dá)基因的腺病毒骨架載體。(I)構(gòu)建攜帶LacZa篩選元件的E3區(qū)穿梭載體在上海生工合成以下引物:Pl:ENSHL for aattgcatatgggatccgcggccgcttcgaat;P2:ENSHL reverse agctattcgaagcggccgcggatcccatatgc;將ENSHL for 和 ENSHL reverse 在室溫退火獲得 ENSH I inker (EcoR IM-Nde 1-BamH 1-Not 1-Sfu 1-Hin d III M)。將 ENSH linker 與經(jīng)過 EcoR I 和 Hind III酶切處理的PUC19載體連接，連接條件:2 μ I ENSH linker片段，1μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5 μ I pUC19載體，0.5 μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆分別命名為PUC19/ENSHL。在上海生工合成以下引物:P3:E3 UP Nde I for ACATATGCCTTTCTCAAATTTAAGCGCG;P4:E3 UP BamH I reverse AGGATCCTTGATGTAATCCAAGGTTAG;P5:E3 DOWN Not I for AGCGGCCGCTTATTCCCTTTAACTAATA;P6:E3 DOWN Sfu I reverse ATTCGAA TTATTCTTGGGCAATGTATG;以pAdEasy-1為模板，用P3/P4通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增腺病毒E3區(qū)穿梭載體上游同源臂，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件為:94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、2分鐘，28個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得E3 UP片段；以P5/P6為引物，用同樣的方法可以獲得E3 DOWN片段，將這兩個(gè)片段分別與pGEM-T Easy載體連接。連接條件是'2 μ I PCR純化片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5μ I T載體，0.5μ1 Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆分別命名為PGEMT/E3 UP和pGEMT/E3 DOWN。將pGEMT/E3 UP用Nde I和BamH I酶切處理與經(jīng)過同樣酶切處理的pUC19/ENSHL連接，經(jīng)過同樣的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為PUC19/ENSHL/E3 UP。將PGEMT/E3 DOWN用Not I和Sfu I酶切處理，與經(jīng)過同樣酶切處理的pUC19/ENSHL/E3 UP連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pE3 shuttle (如圖2)。在上海生工合成IacZ a DNA序列:AGGATCCctatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcgg
tgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccag
ggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcATTTAAATaagcttggcgtaatcatggtcGC
GGCCGCA在該IacZ α序列中引入了 Swa I位點(diǎn)。將合成的IacZa片段用BamH I和Not I酶切，與經(jīng)過同樣酶切處理的pE3 shuttle載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pE3 shuttle/lacZa。(2)構(gòu)建E3區(qū)攜帶Swa I位點(diǎn)的腺病毒骨架載體將pE3 shuttle/lacZ α載體用Sfu I酶切使其線性化,與pAdEasy-Ι載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌涂布與氨芐抗性的培養(yǎng)基上，通過藍(lán)白班篩選(挑取藍(lán)色菌落)、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pAd5 backbone (如圖3)。至此獲得在缺失的E3區(qū)插入Swa I位點(diǎn)的腺病毒骨架載體。2.構(gòu)建攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體(I)嚴(yán)謹(jǐn)型Tet-on誘導(dǎo)性啟動子的構(gòu)建在上海生工合成引物，序列如下:P7:BXL for AATTgGGATCCTCTAGAGAATTCCTCGAGA;P8:BXL reverse AGCTTCTCGAGGAATTCTCTAGAGGATCCc;
將BXL for 和 BXL reverse 在室溫退火，獲得 BX linker 片段(EcoR IM-BamH 1-Xba 1-EcoR 1-Xho 1-Hind III )，將 BX Linker 片段與經(jīng)過 EcoR I 和 Hind III酶切處理的PUC19的載體連接獲得pUC19/BXL。在上海生工合成SV40pA和ΤΚρΑ，其序列如下:SV40pA(Xba I /BamH I ):TCTAGACACCGCGGGGAGATCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTGGATCCTKpA (Spe I /Not I ):ACTAGTGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGCGGCCGC載體pTet-on advanced,購自 CL0NTECH 公司，以 pTet-on advanced 為模板，經(jīng)過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA2S-M2，并在5’端引入EcoR I位點(diǎn)，3’端引入Spe I位點(diǎn)，引物序列如下:P9:rtTA2S-M2 EcoR I for GGAATTCATGTCTAGACTGGACAAG:P10:rtTA2S-M2 Spe I reverse GACTAGTTTACCCGGGGAGCATGTC ；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是:94°C、2分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、60秒，30個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得rtTA2S-M2，將回收片段與pGEM_T Easy載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定及測序獲得的陽性克隆稱為pGEMT/rtTA2S-M2。使用合成引物自身為模板和引物,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增tight miniCMV序列，并在5’端引入Sal I位點(diǎn)，3’端引入EcoR I位點(diǎn)，引物序列如下:Pll: tight miniCMV Sal I forGGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGT;P12:tight miniCMV EcoR I reverseGGAATTCGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGG。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是:94°C、2分鐘，94°C、30秒，55°C、30秒，72°C、20秒，30個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為2.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得tightminiCMV，將回收片段與pGEM_T Easy載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定及測序獲得的陽性克隆稱為pGEMT/tight miniCMV。將SV40pA(Xba I /BamH I )用Xba I和BamH I酶切處理，通過DNA凝膠電泳回收SV40pA片段與經(jīng)過同樣酶切處理的pUC19/BXL載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得的陽性克隆稱為PUC19/BXL/SV40。pTRE2pur載體購自CL0NTECH公司，經(jīng)Xho I與EcoR I雙酶切后，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回收TRE-miniCMV片段(該片段中包含7個(gè)重復(fù)的TRE和位于TRE左側(cè)的miniCMV)， 與經(jīng)同樣酶切的載體pUC19/BXL/SV40進(jìn)行，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得的陽性克隆稱為pUC19/BXL/TRE-miniCMV/SV40。將載體pGEMT/rtTA2S_M2經(jīng)EcoR I與Spe I雙酶切后，經(jīng)1.0%的瓊脂糖電泳后回收得到片段rtTA2S_M2，將其與經(jīng)EcoR I和Xba I酶切的載體pUC19/BXL/TRE-miniCMV/SV40連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得的陽性克隆稱為 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/rtTA2S-M2/SV40。將 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/rtTA2S-M2/SV40 用 EcoR I 酶切，然后用 T4 DNA polymerase 補(bǔ)平，從補(bǔ)平產(chǎn)物中取1.5μ1 DNA進(jìn)行連接，連接條件如下::補(bǔ)平產(chǎn)物1.5μ 1，10ΧΤ4連接酶緩沖液1μ 1，Τ4連接酶0.5 μ 1，三蒸水7 μ 1，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化、小提、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40。在上海生工合成引物，序列如下:P13:XHL for:TCGAGGAATTCATCGATACTAGTGCGGCCGCA;P14:XHL reverse:AGCTTGCGGCCGCACTAGTATCGATGAATTCC;將XHL for和XHL reverse在室溫退火獲得XH Linker片段(Xho 1-EcoR 1-Cla 1-Spe 1-Not 1-Hind III)。將 XHL 片段與經(jīng)過 Xho I 和 HindIII酶切處理的 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40 載體連接，連接條件是:2μ IXH Linker片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5 μ I酶切載體，0.5 μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL。將pGEMT/tight-miniCMV用Sal I和EcoR I酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收tight-miniCMV 片段，與經(jīng)過 Xho I 和 EcoR I 酶切處理的 pUC19/BXL/TRE_miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV。
將TKpA片段用Spe I和Not I酶切，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收TKpA片段，與經(jīng)過同樣酶切處理的 pUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為PUC19/BXL/TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpAo 將 pUC19/BXL/TRE_miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpA用BamH I和Not I酶切處理，并通過瓊脂糖凝膠電泳回收 TRE-miniCMV/EB/rtTA2S-M2/SV40/XHL/TminiCMV/TKpA 片段，與經(jīng)過同樣酶切處理的pE3shuttle載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，至此獲得了攜帶有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子的腺病毒E3區(qū)穿梭載體pE3/Tet on。(2)攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體的構(gòu)建在上海生工合成引物，序列如下:P15:EHL for AATTgATCGATACTAGTt;P16:EHL reverse AGCTaACTAGTATCGATc;將EHL for 和 E；HL reverse 在室溫退火獲得 Ε Linker 片段(EcoRI M-Cla 1-Spe 1-Hind III Μ)。將 EHL 片段與經(jīng)過 EcoR I 和 Hind III 酶切處理的 pUC19載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為PUC19/EHL。在上海生工合成鋅指核酸酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，即NLS-Flag-Fok I DD-T2A-NLS-HA_Fok IRR，并在序列的兩端引入Cla I和Spe I位點(diǎn)，在Flag和Fok I DD之間引入Hind III和Xho I位點(diǎn)用于插入左側(cè)的鋅指蛋白，在HA和Fok I RR之間引入Kpn I和BamH I位點(diǎn)用于插入右側(cè)的鋅指蛋白。鋅指核酸酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的序列如下: ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTGTCTCGAgCTGGGAGGCTCTCAGCTGGTTAAATCCGAGTTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTCCGCcATAAGTTGAAATACGTGCCTCACGAGTATATCGAACTGATCGAGATCGCCAGAAACTCAACCCAAGACAGGATTTTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTATGGCTATAGGGGAAAGCACCTCGGCGGGAGCAGGAAGCCCGACGGCGCCATTTATACAGTCGGGTCTCCAATCGACTATGGGGTCATCGTTGACACTAAGGCCTATTCCGGGGGTTACAACCTCCCAATAGGGCAGGctGACGAGATGCAGGACTACGTGGAGGAGAACCAAACAAGGAACAAGCATATAAACCCTAACGAGTGGTGGAAAGTATACCCTAGTTCTGTTACTGAGTTCAAGTTTCTCTTCGTGAGCGGACACTTCAAAGGAAATTACAAAGCTCAACTGACAAGACTGAATCATATTACTAACTGTAATGGTGccGTCCTGTCAGTGGAGGAACTGCTGATTGGCGGAGAGATGATCAAGGCAGGCACCCTTACTCTCGAAGAAGTGCGGCGAAAGTTTAATAACGGTGAAATCAACTTCTCTAGAGAGGGAAGGGGGTCTCTCCTGACCTGTGGGGATGTGGAAGAAAATCCCGGTCCGGAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGCAGCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCAGCTCACGGtACcaaGGaTCcCTGGGTGGATCTCAGTTGGTGAAATCCGAGCTGGAGGAGAAAAAGTCAGAGCTGCGCCACAAACTCAAGTACGTGCCACACGAATACATTGAGCTGATCGAGATCGCCAGGAACTCCACGCAGGACAGAATCCTgGAGATGAAGGTAATGGAATTTTTCATGAAGGTGTACGGCTACAGAGGCAAGCATCTGGGAGGGTCCCGCAAGCCTGATGGAGCAATCTACACCGTCGGAAGCCCCATaGATTACGGGGTAATCGTCGATACCAAAGCATATAGTGGCGGATACAACCTGCCAATCGGCCAAGCCCGGGAAATGCAGCGATACGTGGAAGAAAACCAGACTAGGAACAAACACATTAACCCAAACGAATGGTGGAAAGTCTATCCTAGCTCTGTGACGGAGTTCAAGTTTCTCTTTGTTTCCGGCCATTTCAAGGGGAATTACAAGGCTCAGCTGACAAGGCTGAATCATATTACTAATTGTAACGGGGCCGTTCTCTCAGTGGAAGAGCTGCTGATTGGCGGAGAGATGATTAAAGCCGGCACCCTTACCCTGGAAGAGGTTCGGCGGAAATTCAACAATGGCGAGATAAACTTTTGAACTAGT
將合成的鋅指核酸酶基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)用Cla I和Spe I酶切處理后與經(jīng)過同樣酶切處理的PUC19/EHL連接。連接條件是:2 μ I酶切純化片段，1μ I 10XΤ4連接酶緩沖液，0.5 μ I載體，0.5μ1 T4連接酶，6μl三蒸水，16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆命名為pUC19/EHL/Fok I DD_T2A_Fok I RR。根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指蛋白的序列，在上海生工合成靶向AAVSl位點(diǎn)的一對鋅指蛋白基因，分別命名為AAVSl ZFL和AAVSl ZFR0并且在AAVSIZFL和AAVSlZFR的兩端分別引入了 Hind II1-Sal I和Kpn 1-Bgl II酶切位點(diǎn)。序列如下:AAVSl ZFL:AAAGCTTATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCTACAACTGGCACCTGCAGAGACATATTAGGACCCACACCGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGGAGCGACCACCTGACCACCCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCCACAACTACGCCAGGGACTGCCATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGAACAGCACCAGAATCGGCCACACCAAAATTCATGTCGACA:AAVSl ZFR:AGGTACCATGGCCGAGAGACCCTTCCAGTGCAGGATCTGCATGCGGAACTTTAGCCAGAGCAGCAACCTGGCCAGACATATTAGGACCCACACCGGCGAAAAGCCCTTTGCTTGCGACATTTGCGGACGGAAATTCGCCAGAACCGACTACCTGGTGGACCACACAAAGATCCATACAGGAAGCCAGAAGCCATTTCAATGTAGAATTTGTATGAGGAATTTCTCCTACAACACCCACCTGACCAGACATATCCGGACACACACAGGGGAGAAACCATTCGCCTGTGATATCTGTGGCAGAAAGTTTGCCCAGGGCTACAACCTGGCCGGCCACACCAAAATTCATAGATCTA:將AAVS1ZFL 用 Hind III和 Sal I 酶切，與經(jīng)過 Hind III和 Xho I 酶切處理的 pUC19/EHL/Fok I DD-T2A-Fok I RR載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為 PUC19/EHL/AAVS1 ZFL-Fok I DD-T2A_Fok I RR。將 AAVS1ZFR 用 Kpn I 和 Bgl II 酶切處理，與經(jīng)過 Kpn I 和 BamH I 酶切處理的 pUC19/EHL/AAVSlZFL_Fok I DD-T2A_Fok I RR載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為PUC19/EHL/AAVS1 ZFN (即pUC19/EHL/AAVSIZFL-Fok I DD-T2A-AAVSIZFR-Fok I RR)。靶向 AAVSl 的一對鋅指核酸酶基因AAVSlZFL-Fok I DD和AAVSl ZFR-Fok I RR之間通過自剪切多肽T2A相連。將PUC19/EHL/AAVS1 ZFN用Cla I和Spe I酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳回收AAVSlZFN片段，與經(jīng)過同樣酶切處理的pE3/Tet on載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pE3/Tet on/AAVSl ZFN (如圖4)。至此獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體，該載體中鋅指核酸酶基因的表達(dá)是通過Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)節(jié)。在上海生工合成CMV啟 動子,序列如下:GGATCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATATCGATTTACTAGT ；用BamH I和Spe I酶切CMV片段，用Spe I和Not I酶切TKpA片段，通過瓊脂糖凝膠電泳回收CMV和TKpA片段，與經(jīng)過BamH I和Not I酶切處理的pE3 shuttle載體連接，連接條件如下:4 μ I CMV片段，4 μ I TKpA片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，0.5μ I酶切載體，0.5μ I Τ4連接酶，16°C連接過夜，質(zhì)粒提取，酶切鑒定獲得陽性克隆命名為ρΕ3/CMV-TKpAο將pE3/CMV_TKpA用Cla I和Spe I酶切處理，與之前回收好的AAVSl ZFN片段連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切鑒定獲得陽性克隆命名為PE3/CMV-AAVS1 ZFN-TKpA0至此獲得了攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體，該載體中鋅指核酸酶基因的表達(dá)由真核啟動子CMV調(diào)節(jié)。3.構(gòu)建攜帶靶向AAVSl的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體

在上海生工合成引物，序列如下:P17:KBL for CGGATCCATCGATACTAGTGCGGCCGCGTCGACA;P18:KBL reverseGATCTGTCGACGCGGCCGCACTAGTATCGATGGATCCGGTAC;將KBL for 和 KBL reverse 在室溫退火獲得 KB Linker 片段(Kpn 1-BamH 1-Cla 1-Spe 1-Not 1-Sal 1-Bgl II)。將KB Linker 片段與經(jīng)過Kpn I 和 Bgl II 酶切處理的pshuttle載體(購買自安捷倫科技有限公司，Agilent technologies)連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α細(xì)胞，并涂布于卡那抗性的培養(yǎng)基上，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl shuttle。依據(jù)AAVSl位點(diǎn)的基因組序列設(shè)計(jì)引物用于擴(kuò)增上下游同源臂，引物序列如下:P19:AAVSl UP Kpn I for AGGTACCcttcactcgctgggttccP20:AAVSl UP Sal I reverse AGTCGACggaggggacagataaaagP21:AAVSl DOWN Sal I for AGTCGACgtgacagaaaagccccatcP22:AAVSl DOWN Bgl II reverse AAGATCTcagccctgccaggacggg采用飛捷生物試劑公司的微量基因組DNA極速抽提試劑盒從HEK293細(xì)胞中提取人基因組DNA，并以此基因組DNA為模板，用引物P19/P20通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得上游同源臂AAVSl UP。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為:5 μ I IOXPCR bufferU μ I Ρ19、1μ1 Ρ20、
0.5μ I LA Taq、ly I基因組DNA、ly I IOmM dNTPs、40.5 μ I三蒸水。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件:94°C、5分鐘，940C >30秒，55°C >30秒，72°C、I分鐘，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為30次。用同樣的方法以P21/P22為引物，可獲得下游同源臂AAVSl DOWN。將AAVSl UP和AAVSl DOWN分別與PGEM-T Easy載體連接，連接條件是:2 μ I PCR純化片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，I μ I pGEM-T Easy, 0.5 μ I Τ4連接酶，5.5 μ I三蒸水，14.5°C連接過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序獲得陽性克隆，分別命名為pGEMT/AAVSl UP和pGEMT/AAVSl DOffN0將pGEMT/AAVSl UP 用 Kpn I 和 Sal I 酶切處理，pGEMT/AAVSl DOWN 用 Sal I 和Bgl II處理，通過瓊脂糖凝膠電泳分別回收AAVSl UP片段和AAVSl DOWN片段，與經(jīng)過Kpn I和Bgl II酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體pEl shuttle連接,連接條件:pEl shuttle載體
0.5 μ I, AAVSl UP 4 μ I, AAVSl DOWN 4 μ 1，10ΧΤ4 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4 連接酶 0.5μ 1，16°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl/AAVSl Donor(如圖5)。至此獲得了攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體，該供體DNA由500bp的上游同源臂和500bp的下游同源臂組成，在上游和下游同源臂之間引入了 Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。4.攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體的構(gòu)建(I)攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體的構(gòu)建將腺病毒骨架載體pAd5 backbone用Swa I線性化,與經(jīng)過Sfu I線性化的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體pE3/Tet on/AAVSlZFN共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3)Tet on AAVS1ZFN。將腺病毒骨架載體pAd5 backbone用Swa I線性化,與經(jīng)過Sfu I線性化的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體pE3/CMV-AAVSl ZFN-TKpA共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3)CMV AAVSlZFN。(2)攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體的構(gòu)建將pEl/AAVSl Donor 載體用 Pme I 線性化，與 pAd5 (E3) Tet on AAVSl ZFN 共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，將 轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BJ5183涂布于卡那抗性的培養(yǎng)基上，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3) Tet on AAVSI ZFN/ (El)AAVSldonor (如圖 6)。將pEl/AAVSl Donor 載體用 Pme I 線性化，與 pAd5 (E3) CMV AAVSl ZFN 共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BJ5183涂布于卡那抗性的培養(yǎng)基上，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3) CMV AAVSI ZFN/(El) AAVSI donor。至此就獲得了攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體。(3)對照腺病毒載體的構(gòu)建將pEl shuttle載體用Pme I線性化，與pAd5 (E3) CMV AAVSl ZFN共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BJ5183涂布于卡那抗性的培養(yǎng)基上，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5 CMV AAVSl ZFN。將pEl/AAVSl Donor載體用Pme I線性化，與腺病毒骨架載體pAd5 backbone共轉(zhuǎn)化BJ5183進(jìn)行同源重組，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌BJ5183涂布于卡那抗性的培養(yǎng)基上，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5 AAVSl Donor。5、腺病毒的包裝、擴(kuò)增、純化采用磷酸鈣法將Pac I 線性化的 pAd5(E3)Tet on AAVSl ZFN/(El) AAVSl donor腺病毒載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞系。經(jīng)過7 10天后，可見明顯的細(xì)胞病變，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心收獲病毒原液，經(jīng)2 3輪的病毒擴(kuò)增后,將所獲得的病毒原液感染10個(gè)150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的HEK293細(xì)胞，擴(kuò)增獲得的病毒原液用于后續(xù)的進(jìn)一步純化。感染的病毒的細(xì)胞經(jīng)過反復(fù)凍融3次(37°C /酒精干冰)后經(jīng)3500rpm離心15分鐘，通過兩次氯化銫密度梯度(下層1.4g/ml，上層1.2g/ml)離心(轉(zhuǎn)速20000轉(zhuǎn)/分鐘)獲得純化的Ad5(E3)Tet on AAVSlZFN/(El)AAVSI donor腺病毒載體，至此獲得純化的攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒。用同樣的方法可以獲得對照腺病毒Ad5(E3) CMV AAVSl ZFN/(El)AAVSl donor、Ad5CMV AAVSl ZFN、Ad5 AAVSl Donor。6、攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒對U2-0S細(xì)胞中AAVSl位點(diǎn)的靶向修飾以1父106的密度將似-05細(xì)胞接種于六、8、(:、0四個(gè)60111111培養(yǎng)皿。次日，用100M0I的Ad5(E3)Tet on AAVSl ZFN/(El) AAVSl donor感染A盤U2-0S，在感染完病毒后立即在培養(yǎng)基中加入2 μ g/ml的強(qiáng)力霉素(Doxycycline),每兩天換一次培養(yǎng)基,并加入新的強(qiáng)力霉素；用 100M0I 的 Ad5 (El)AAVSl donor 和 100M0I 的 Ad5 (E3) CMV AAVSl ZFN 共感染 B 盤U2-0S ;用 100M0I 的 Ad5 (El)AAVSl donor 感染 C 盤 U2-0S ；5μ g pE3/CMV-AAVSl ZFN-TKpA和20μ8 pEl/AAVSl Donor共轉(zhuǎn)染(電轉(zhuǎn))D盤U2-0S細(xì)胞。在感染或轉(zhuǎn)染后的第五天收集細(xì)胞，用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，DP304-02)提取基因組DNA，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近約Ikb的DNA片段，引物序列如下:P23:AAVSl detection primer for tgggtcctctccgggcatctctP24:AAVSl detection primer back gggagttttccacacggacac取500ng的該聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的產(chǎn)物，用20U的Sal I酶處理3小時(shí)后，跑DNA凝膠電泳檢測，用DNA凝膠成像系統(tǒng)拍照。結(jié)果如圖7由圖7中可見，與其它三組樣品相比，Ad5(E3)Tet on AAVSl ZFN/(El)AAVSldonor感染的U2-0S細(xì)胞對A AVSl位點(diǎn)有較高的靶向修飾效率。實(shí)施例2以攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA (供體DNA中攜帶報(bào)告基因表達(dá)兀件)的腺病毒載體的構(gòu)建為例，該載體的結(jié)構(gòu)如下:在該腺病毒載體的缺失的E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的TRE (rtTA2S_M2結(jié)合位點(diǎn))，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tightminiCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tightminiCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA，也可以是ΤΚρΑ，在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入鋅指核酸酶基因AAVSl ZFN。靶向AAVSl位點(diǎn)的一對(左側(cè)AAVSl ZFNL和右側(cè)AAVSl ZFNR)鋅指核酸酶之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體的缺失的El區(qū)插入了靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離AAVSl ZFN識別位點(diǎn)563bp長度為900bp的上游同源臂和距離AAVSl位點(diǎn)180bp長度為929bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間插入了 CMV-eGFP-TKpA報(bào)告基因表達(dá)兀件，也可以插入mcherry報(bào)告基因表達(dá)兀件、突光素酶報(bào)告基因表達(dá)兀件、Neomycin篩選基因表達(dá)元件、Hygromycin篩選基因表達(dá)元件中的任意一種。該腺病毒載體的構(gòu)建方法如下:本實(shí)施例的步驟3攜帶靶向AAVSl的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體的構(gòu)建過程如下:在上海生工合成引物，序列如下:
P25:AAVSl 900UP Kpn I for AGGTACCcggtatcagcgccctgcaccag ；P26:AAVSl 900UP BamH I reverse AGGATCCgctcagaggacatcacgtggt ；P27:AAVSl 929D0WN Sal I for AGTCGACggagggagagcttggcaggg ；P28:AAVSl 929D0WN Bgl II reverse AAGATCTcccagctcccctgcttctt ；以人基因組DNA為模板，以P25/P26為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得長度為900bp的上游同源臂AAVSl 900UP;以P27/P28為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得長度為929bp的下游同源臂AAVSl 929D0WN。用Kpn I和BamH I酶切pEl shuttle載體，與經(jīng)過同樣酶切處理的AAVSl 900UP片段連接，連接條件如下:4μ I酶切回收片段，1μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5μ I酶切載體，0.5μ I Τ4連接酶，4 μ I三蒸水，16°C連接過夜，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pEl/AAVSl 900UP。將pEl/AAVSl 900UP用Sal I和Bgl II酶切作為載體，與經(jīng)過同樣酶切處理的AAVSl 929D0WN片段連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pEl/AAVSl UP-D0WN。將pEl/AAVSl UP-D0WN載體用BamH I和Not I酶切，與實(shí)施例1中經(jīng)過BamH I和Spe I酶切并回收的CMV啟動子、Spe I和Not I酶切并回收的TKpA片段連接，連接條件如T:4μ I CMV片段，4 μ I TKpA片段，1μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5μ I酶切載體，0.5μ IΤ4連接酶，16°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl/AAVSlUP-CMV-TKpA-DOWN。在生海生工合成引物，序列如下:P29:eGFP Cla I for AATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA ；P30:eGFP Spe I reverse AACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT ；

以pEGFP-Nl (購買至Clontech公司)為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得eGFP基因，將該基因片段與pGEM-T Easy載體連接后，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pGEMT/eGFP。將pGEMT/eGFP用Cla I和Spe I酶切，與經(jīng)過同樣酶切處理的pEl/AAVSl UP-CMV-TKpA-DOWN載體連接，連接條件為:4μ I酶切回收片段，I μ 110ΧΤ4連接酶緩沖液，0.5μ I酶切載體，0.5μ I Τ4連接酶，4 μ I三蒸水，16°C連接過夜，經(jīng)過同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定，獲得陽性克隆命名為pEl/AAVSl UP-CMV-eGFP-TKpA-DOWN (如圖8)。至此獲得攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體，該供體DNA由900bp的上游同源臂和929bp的下游同源臂組成，在上、下游同源臂之間插入了 CMV-eGFP-TKpA報(bào)告基因表達(dá)元件，也可以插入mcherry報(bào)告基因表達(dá)元件、突光素酶報(bào)告基因表達(dá)元件、Neomycin篩選基因表達(dá)元件、Hygromycin篩選基因表達(dá)元件中的任意一種。其它步驟與實(shí)施例1相同，可獲得攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體，供體DNA中攜帶報(bào)告基因表達(dá)元件。實(shí)施例3以攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA (供體DNA包含50bp的上、下游同源臂)的腺病毒載體的構(gòu)建為例，該載體的結(jié)構(gòu)如下:在該腺病毒載體的E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的TRE (rtTA2S_M2結(jié)合位點(diǎn))，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tight miniCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA(也可以是TKpA)，在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入鋅指核酸酶基因AAVS1ZFN。靶向AAVSl位點(diǎn)的一對(左側(cè)AAVS1ZFNL和右側(cè)AAVSl ZFNR)鋅指核酸酶之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體的El區(qū)插入了靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離AAVSl ZFN識別位點(diǎn)Ibp長度為50bp的上游同源臂和距離AAVSl位點(diǎn)3bp長度為50bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間插入了 Sal I酶切位點(diǎn)，也可以插入Not I > Pac I > Pme I酶切位點(diǎn)中的任意一種。該腺病毒載體的構(gòu)建方法如下:在該實(shí)施例的步驟3攜帶靶向AAVSl的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體的構(gòu)建過程如下:在上海生工合成如下引物:P31:AAVSl UP 5Oarm Kpn I for AGGTACCagggccggttaatgtggct;P32:AAVSl UP 5Oarm Sal I reverse AGTCGACggaggggacagataaaagP33:AAVSl D0WN50arm Sal I for AGTCGACgtgacagaaaagccccatcP34:AAVSl D0WN50arm Bgl II reverse AAGATCTtatcaggagactaggaa以人基因組DNA為模板， 以P31/P32為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得50bp上游同源臂 AAVSl 50UP。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為:5μ1 10XPCR bufferU μ I Ρ31、1μ1 Ρ32、
0.5μ I LA Taq、ly I基因組DNA、ly I IOmM dNTPs、40.5 μ I三蒸水。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件:94°C、5分鐘，940C >30秒，55°C >30秒，72°C >20秒，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為30次。用同樣的方法以P33/P34為引物，可獲得50bp下游同源臂AAVSl 50D0WN。將AAVSl 50UP和AAVSl50D0WN分別與pGEM-T Easy載體連接，連接條件是:2 μ I PCR純化片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，1μ I T載體，0.5μ I Τ4連接酶，5.5μ1三蒸水，16°C連接過夜。然后用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序獲得陽性克隆，分別命名為pGEMT/AAVSl 50UP和pGEMT/AAVSl 50D0WN。將pGEMT/AAVSl 50UP 用 Kpn I 和 Sal I 酶切處理，pGEMT/AAVSl 50D0WN 用 Sal I和Bgl II處理，通過瓊脂糖凝膠電泳分別回收AAVSl 50UP片段和AAVSl 50D0WN片段，與經(jīng)過Kpn I和Bgl II酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體pEl shuttle連接,連接條件:ρΕ1shuttle 載體 0.5 μ 1，AAVSl 50UP 4 μ I, AAVSl 50D0WN 4 μ 1，IOX 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4連接酶0.5 μ 1，16°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl/AAVS lDonor3。至此獲得了攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體，該供體DNA由50bp的上游同源臂和50bp的下游同源臂組成，在上游和下游同源比之間引入了 Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，也可以插入Not 1、Pac 1、Pme I酶切位點(diǎn)中的任意一種。其它步驟與實(shí)施例1相同，可獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體。實(shí)施例4以攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶和供體DNA(供體DNA包含750bp的上游同源臂、3kb下游同源臂，在上、下游同源臂間引入了 Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))的腺病毒載體的構(gòu)建為例，該載體的結(jié)構(gòu)如下:在該腺病毒載體的E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的TRE(rtTA2S_M2結(jié)合位點(diǎn))，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tight miniCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA，也可以是ΤΚρΑ。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入鋅指核酸酶基因AAVSl ZFN。靶向AAVSl位點(diǎn)的一對(左側(cè)AAVSl ZFNL和右側(cè)AAVSl ZFNR)鋅指核酸酶之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體的El區(qū)插入了靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離AAVSl ZFN識別位點(diǎn)5000bp長度為750bp的上游同源臂和距離AAVSl位點(diǎn)Ibp長度為3000bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間插入了 Sal I酶切位點(diǎn)。該腺病毒載體的構(gòu)建方法如下:在該實(shí)施例的步驟3攜帶靶向AAVSl的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體的構(gòu)建方法如下:在上海生工合成如下引物:
P35:AAVSl 750bp UP Kpn I for AGGTACCCTGCCATCAGGAACTGAGP36: AAVSl 750bp UP Sal I reverseAGTCGACTCAATTTTATACTTTTGTGP37:AAVSl 3000bp DOWN Sal I for AGTCGACtggtgacagaaaagccccaP38:AAVSl 3000bp DOWN Bgl II reverse AAGATCTtccaccaagaagcgcacc以人基因組DNA為模板，用引物P35/P36通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得長度為750bp的上游同源臂AAVSl 750UP。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系為:5 μ I 10XPCR bufferU μ I Ρ35、
Iμ I Ρ36.0.5μ I LA Taq、I μ I 基因組 DNA、I μ I IOmM dNTPs、40.5 μ I 三蒸水。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件:94°C、5分鐘，940C >30秒，55°C >30秒，72°C、I分鐘，反應(yīng)循環(huán)次數(shù)為30次。用同樣的方法以P37/P38為引物，可獲得長度為3000bp的下游同源臂AAVSl 3000D0WN。將AAVSI 750UP和AAVSl 3000D0WN通過DNA凝膠電泳回收，分別與pGEM_T Easy載體連接，連接條件是:2 μ I PCR純化片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，I μ I酶切載體，0.5μ I Τ4連接酶，5.5μ I三蒸水，14.5°C連接過夜。然后用同樣的方法轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定并測序獲得陽性克隆，分別命名為 pGEMT/AAVSl 750UP 和 pGEMT/AAVSl 3000D0WN。將 pGEMT/AAVSl 750UP用Kpn I和Sal I酶切處理，通過瓊脂糖凝膠電泳回收AAVSl 750UP片段，與經(jīng)過Kpn I和Sal I酶切處理的腺病毒El區(qū)穿梭載體pEl shuttle連接,連接條件:ρΕ1shuttle 載體 0.5 μ 1，AAVSl 750UP 4 μ 1，10 X Τ4 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4 連接酶 0.5 μ 1，三蒸水4 μ 1，16°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl/AAVSl750UP。將pGEMT/AAVSl 3000D0WN用Sal I和Bgl II酶切處理，通過瓊脂糖凝膠電泳回收AAVSl 3000D0WN片段，與經(jīng)過Sal I和Bgl II酶切處理的pEl/AAVSl 750UP連接，連接條件:pEl/AAVSl 750UP 載體 0.5μ 1，AAVSl 3000D0WN 4 μ 1，10ΧΤ4 連接酶緩沖液 I μ 1，Τ4連接酶0.5 μ 1，三蒸水4 μ 1，16°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pEl/AAVSl donor4。至此獲得了攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體，該供體DNA由750bp的上游同源臂和3000bp的下游同源臂組成，在上游和下游同源比之間引入了Sal I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。其它步驟與實(shí)施例1相同，可獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體。實(shí)施例5以攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶和供體DNA，同時(shí)Fiber經(jīng)過RGD小肽修飾的腺病毒載體為例，該載體的結(jié)構(gòu)如下:在該腺病毒載體的缺失E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的TRE(rtTA2S-M2結(jié)合位點(diǎn))，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tight miniCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA，也可以是ΤΚρΑ。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入鋅指核酸酶基因AAVS1ZFN。靶向AAVSl位點(diǎn)的一對(左側(cè)AAVSl ZFNL和右側(cè)AAVSl ZFNR)鋅指核酸酶之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體的El區(qū)插入了靶向AAVSl位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離AAVS1ZFN識別位點(diǎn)Ibp長度為500bp的上游同源臂和距離AAVSl位點(diǎn)3bp長度為500bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間插入了 Sal I酶切位點(diǎn)。該腺病毒載體的纖維蛋白Fiber經(jīng)過了 RGD小肽修飾。該腺病毒載體的構(gòu)建方法如下:1.攜帶供體DNA的El區(qū)穿梭載體的構(gòu)建
該步驟與實(shí)施例1相同。2.構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體在上海生工合 成引物，序列如下:P39:E3 DOWN Swa I forCGCTACAGCCATAGCCATTtaAATGCAGGAGATGGGCTTGAA;P40:E3 DOWN Swa I reverseTTCAAGCCCATCTCCTGCATTtaAATGGCTATGGCTGTAGCG;以pGEMT/E3 DOWN為模板，以P39/P40為引物，采用Stratagene定點(diǎn)突變試劑盒(貨號:200518)進(jìn)行定點(diǎn)突變，在E3 DOWN片段中產(chǎn)生一個(gè)Swa I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，經(jīng)過測序獲得陽性克隆命名為PGEMT/E3 DOWN Swa I，該質(zhì)粒在E3 DOWN中引入了Swa I酶切位點(diǎn)。將pGEMT/E3 DOWN Swa I用Not I和Sfu I酶切處理，與經(jīng)過同樣酶切處理的pUC19/EMSHL/E3 UP連接，連接條件如下:2 μ I酶切純化片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，I μ I酶切載體，0.5μ1 Τ4連接酶，5.5μ I三蒸水，14.5°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pE3 shuttle Swa I (如圖9)。將pE3/Tet on/AAVSl ZFN 用 BamH I 和 Not I 酶切處理獲得 Tet on-AAVSl ZFN,與經(jīng)過同樣酶切處理的pE3 shuttle Swa I載體連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取及酶切鑒定獲得陽性克隆命名為 pE3 Swa I /Tet on/AAVSl ZFN。3.經(jīng)R⑶修飾的Fiber區(qū)穿梭載體的構(gòu)建在上海生工合成引物，序列如下:P41:HSNEL for:AGCTAAGTACTCTCGAGAAGAATTCTTGCGGCCGCA;P42: HSNEL reverse:AATTTGCGGCCGCAAGAATTCTTCTCGAGAGTACTT;
將HSNEL for 和 HSNEL reverse 在室溫退火得到 HSNE Linker 片段(Hind III M-Sca 1-Xho 1-EcoR 1-Not 1-EcoR I Μ)。將HSNE Linker 片段與經(jīng)過HindIII和EcoR I 酶切處理的pUC19 (購買自clontech公司)載體連接,連接條件是:2 μ I HSNE Linker片段，I μ I10 X Τ4連接酶緩沖液，1μ I酶切載體，0.5μ I Τ4連接酶，5.5μ I三蒸水，14.5°C連接過夜。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得PUC19/HSNEL。在上海生工合成以下引物:P43: Fiber UP Xho I for ACTCGAGtctagttacctccaatggcatgP44:Fiber UP EcoR I reverseAGAATTCGTCTCCGCGagttgtgtctcctgtttcctgtgP45:Fiber DOWN EcoR I for AGAATTCccaagtgcatactctatgtcatP46:Fiber DOWN Not I reverse AGCGGCCGCcggttccctgcagtgtatag以pAdeasy-1為模板，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增腺病毒Fiber區(qū)穿梭載體上、下游同源臂，用P43/P44擴(kuò)增上游同源臂Fiber UP ;用P45/P46擴(kuò)增下游同源臂Fiber DOWN。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的條件為:94°C、5分鐘，94°C、30秒，55 °C >30秒，72°C、2分鐘，28個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得Fiber UP和FiberDOWN片段，將這兩個(gè)片段分別與pGEM-T Easy載體連接。連接條件是:2 μ I PCR純化片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，0.5μ I pGEM-T Easy載體，0.5μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌 落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆分別命名為 pGEMT/Fiber UP 和 pGEMT/Fiber DOWN。將 pGEMT/Fiber UP 用 Xho I 和 EcoR I 酶切處理與經(jīng)過同樣酶切處理的PUC19/HSNEL連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為 pUC19/HSNEL/Fiber UP。將 pGEMT/Fiber DOWN 用 EcoR I 和 Not I 酶切處理，與經(jīng)過同樣酶切處理的PUC19/HSNEL / Fiber UP連接，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆命名為pFiber-RGD。至此獲得了 RGD修飾的腺病毒Fiber區(qū)穿梭載體。4.攜帶靶向AAVSl的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA，且Fiber經(jīng)過RGD修飾的腺病毒載體的構(gòu)建I)攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體的構(gòu)建將腺病毒骨架載體pAd5 backbone用Swa I線性化,與經(jīng)過Sfu I線性化的腺病毒E3區(qū)穿梭載體pE3 Swa I /Tet on/AAVS ZFN共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3)Tet on AAVSl ZFN Swa I。2)攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件同時(shí)Fiber經(jīng)RGD修飾的腺病毒載體的構(gòu)建將Ad5(E3)Tet on AAVSl ZFN Swa I 用 Swa I 線性化與經(jīng)過 Sca I 線性化的pFiber-RGD共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為 pAd5(E3)Tet on AAVSl ZFN RGD03)攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA，且Fiber經(jīng)過RGD修飾的腺病毒載體的構(gòu)建將pEl/AAVSl Donor 載體用 Pme I 線性化，與 pAd5 (E3) Tet on AAVSl ZFN-RGD共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)過質(zhì)粒提取、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pAd5(E3)Tet on AAVSl ZFN-RGD/(El)AAVSl donor。至此就獲得了攜帶靶向AAVSl位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA，且Fiber經(jīng)過RGD修飾的腺病毒載體。采用與實(shí)施例1相同的方法可以包裝、擴(kuò)增、純化獲得Ad5(E3)Tet on AAVSlZFN-RGD/(El) AAVSI donor 腺病毒。實(shí)施例6以構(gòu)建攜帶靶向B型血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒的構(gòu)建為例。該載體的結(jié)構(gòu)如下:在該腺病毒載體的缺失E3區(qū)插入了有Tet-on誘導(dǎo)性啟動子調(diào)控的鋅指核酸酶表達(dá)元件。其中Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的TRE(rtTA2S-M2結(jié)合位點(diǎn))，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tight miniCMV,在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA。在右側(cè)tight miniCMV的下游連接有轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA，也可以是ΤΚρΑ。在tight miniCMV和其下游的SV40pA之間攜帶有多克隆位點(diǎn)，在該多克隆位點(diǎn)間插入鋅指核酸酶基因FIX ZFN。靶向Factor IX位點(diǎn)的一對(左側(cè)FIX ZFNL和右側(cè)FIX ZFNR)鋅指核酸酶之間通過自剪切多肽(T2A)連接。在該腺病毒載體的El區(qū) 插入了靶向Factor IX位點(diǎn)的供體DNA。該供體DNA由距離FIX ZFN識別位點(diǎn)Ibp長度為500bp的上游同源臂和距離FIX ZFN識別位點(diǎn)3bp長度為500bp的下游同源臂組成，在上游同源臂和下游同源臂之間依次插入了 Factor IX基因和轉(zhuǎn)錄終止信號SV40pA。該載體的構(gòu)建過程如下:在該實(shí)施例的步驟2 (2)攜帶祀向Factor IX位點(diǎn)的鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體的構(gòu)建中，在上海生工合成革巴向Factor IX的一對鋅指蛋白Factor IX ZFL和Factor IXZFR，序列如下:Factor IX ZFL:AAGCTTAtggcggaacgcccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatgtgctgagcgcgcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcggatcgcagcaaccgcattaaacataccaaaattcataccggcagccagaaaccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatcatctgagcgaacatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcgcagagcgcgagccgcaaaaaccataccaaaattcatGTCGACFactor IX ZFR:GGTACCatggcggaacgcccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatctgagectggtgcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcgaccagcggccatctgagccgccataccaaaattcataccggcagccagaaaccgtttcagtgccgcatttgcatgcgcaactttagccgcagcgatcatctgagccagcatattcgcacccataccggcgaaaaaccgtttgcgtgcgatatttgcggccgcaaatttgcggcgagcagcacccgcattacccataccaaaattcatAGATCT將Factor IX ZFL和Factor IX ZFR按照實(shí)施例1中相同的方法克隆到pUC19/EHL/Fok I DD-T2A-Fok I RR 載體中，獲得 pUC19/EHL/Factor IX ZFN。
在步驟3攜帶靶向Factor IX的供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體的構(gòu)建中，在上海生工合成如下引物:P47 Factor IX up Kpn I for: agactggattaagaaaatgtggcacP48 Factor IX up BamH I reverse: aacctttgctagcagattgtgaaaP49 Factor IX down Sal I for: gggataaaccagactccctcttP50 Factor IX down Bgl II reverse:atctatctcacaggtgttggcag人基因組DNA為模板，以P47/P48為引物，擴(kuò)增Factor IX UP ;以P49/P50為引物擴(kuò)增 Factor IX DOWN。將 Factor IX UP 和 Factor IX DOWN 分別克隆入 pEl shuttle 載體，獲得 pEl/FIX UP-D0WN。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取Factor IX基因序列(NM_000133)，在上海生工合成該基因。并在兩端分別加入酶切位點(diǎn)BamH I和Spe I。將Factor IX基因和TKpA片段分別通過BamH I /Spe I和Spe I /Not I酶切位點(diǎn)依次克隆入pEl/FIX UP-D0WN載體，獲得陽性克隆命名為 pEl/FIX UP-Fac tor IX -TKpA-DOWN。其它步驟與實(shí)施例1相同，可獲得攜帶靶向B型血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒Ad5(E3) Tet on FIX ZFN/ (El)FIX donor。將pEl/FIX UP-Factor IX-TKpA-DOWN 與腺病毒骨架載體 pAd5 backbone 同源重組獲得攜帶靶向Factor IX的供體DNA的腺病毒載體pAd5 (El)FIX donor,經(jīng)過包裝、擴(kuò)增、純化獲得pAd5 (El) FIX donor腺病毒，作為對照腺病毒。實(shí)施例7以攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒在制備治療B型血友病的藥物中的應(yīng)用為例。制備治療B型血友病的藥物以注射劑來使用，制備該藥物1000支用原料及其配比如下:攜帶靶向B型血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶和供體DNA的腺病毒5 X IO17Vp注射用水加至
500ml制備方法按藥劑學(xué)注射劑的常規(guī)方法進(jìn)行。每支500 μ 1，每mL含活性成分?jǐn)y帶靶向B型血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶和供體DNA的腺病毒I X IO15vp。使用是只需要通過靜脈注射一次，按照每公斤體重注射I X IO13Vp的劑量使用。靜脈注射藥物后按照2mg/ml的劑量口服強(qiáng)力霉素。為了驗(yàn)證本發(fā)明應(yīng)用于B型血友病治療的效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例6中純化好的攜帶靶向血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶和供體DNA的腺病毒來進(jìn)行B型血友病小鼠模型治療實(shí)驗(yàn)，B型血友病小鼠模型購于美國杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Jacksonlaboratory)。實(shí)驗(yàn)情況如下:準(zhǔn)備15只4-6周齡的人源化的Balb/c血友病小鼠模型，分成A、B、C3組，每組5只待用。將純化好的腺病毒用PBS稀釋至2.5X IO8Vp/μ I待用。將實(shí)施例6中純化好的攜帶靶向血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶和供體DNA的腺病毒Ad5(E3) Tet on FIXZFN/(El)FIX donor以5X IOicVp/只的劑量通過尾靜脈注射A組小鼠。注射完病毒后立即通過飲水給小鼠提供強(qiáng)力霉素藥物(DoX2mg/ml)，持續(xù)給藥I周。在注射完病毒兩周后，檢測小鼠部分活化凝血酶原激酶時(shí)間。同時(shí)用Ad5 (El)FIX donor以相同劑量通過尾靜脈注射B組小鼠為陰性對照。用200μ1 PBS通過尾靜脈注射C組小鼠作為空白對照。B組、C組小鼠在尾靜脈注射后用和A組同樣的劑量和方法提供強(qiáng)力霉素。準(zhǔn)備5只正常的4-6周齡的Balb/c小鼠作為陽性對照D組。用結(jié)果如圖10，在圖10中，WT代表陽性對照組、Ad5 (E3)Tet on FIX ZFN/ (El)FIX donor 代表實(shí)驗(yàn)組、Ad5 (El) FIX donor 代表陰性對照組、Mock 代表空白對照組，同對空白對照組和陰性對照組相比經(jīng)攜帶靶向血友病致病基因Factor IX的鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒治療的B型血友病小鼠模型的凝血能力得到恢復(fù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果:圖中相同相同字母代表無顯著性差異，不同字母代表有顯著性差異，Ρ〈0.0 5。
權(quán)利要求
1.一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:缺失El和E3區(qū)，在缺失區(qū)插入了鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:在缺失的El區(qū)插入供體DNA、在缺失的E3區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件，或在缺失的El區(qū)插入鋅指核酸酶表達(dá)元件、在缺失的E3區(qū)插入供體DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:所述的鋅指核酸酶表達(dá)元件是由真核啟動子與其下游的鋅指核酸酶基因和轉(zhuǎn)錄終止信號組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:所述的真核啟動子是Tet-on誘導(dǎo)性啟動子，該Tet-on誘導(dǎo)性啟動子由以下結(jié)構(gòu)組成:7個(gè)重復(fù)的四環(huán)素反應(yīng)元件，在該重復(fù)序列兩端連接有啟動子核心元件，包括左側(cè)的miniCMV和右側(cè)的tightminiCMV，在左側(cè)miniCMV的下游連接有rtTA2S_M2轉(zhuǎn)錄因子和SV40pA，在右側(cè)tight miniCMV的下游插入一對鋅指核酸酶基因，在鋅指核酸酶基因的端連接有轉(zhuǎn)錄終止信號；所述的兩個(gè)鋅指核酸酶基因間通過自剪切多肽相連；所說的轉(zhuǎn)錄終止信號是 SV40pA、TKpA 中的一種； miniCMV的序列如下:GGTACCCGGGTCGAGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCCCGAATTC tight miniCMV的序列如下:GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCGAATTCC0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:所述的供體DNA是靶向該腺病毒所攜帶的鋅指核酸酶的識別位點(diǎn)，它由上、下游同源臂組成，上、下游同源臂分別是由距離該腺病毒載體攜帶的鋅指核酸酶的識別位點(diǎn)Ibp到5000bp堿基數(shù)的DNA序列組成，每條同源臂的長度為50bp到3000bp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，其特征在于:所述的供體DNA在上、下游同源臂之間插入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、報(bào)告基因表達(dá)元件、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種。
7.一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒的構(gòu)建方法，其特征在于由以下步驟組成: (1)構(gòu)建腺病毒骨架載體 以商業(yè)化的pAdEasy-Ι載體為基礎(chǔ)進(jìn)行改造。構(gòu)建腺病毒E3區(qū)穿梭載體，在E3區(qū)穿梭載體中插入IacZa篩選基因和Swa I酶切位點(diǎn)，通過同源重組和藍(lán)白斑篩選將Swa I酶切位點(diǎn)引入到腺病毒缺失的E3區(qū)，獲得可以在缺失的E3區(qū)插入外源基因的腺病毒骨架載體； (2)構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體 將真核啟動子、鋅指核酸酶基因、轉(zhuǎn)錄終止信號依次插入到腺病毒E3區(qū)穿梭載體中； (3)構(gòu)建攜帶供體DNA的 腺病毒El區(qū)穿梭載體將供體DNA的上、下游同源臂依次插入到腺病毒El區(qū)穿梭載體，在上、下游同源臂之間插入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、篩選基因表達(dá)元件、功能基因表達(dá)元件中的任意一種； (4)將攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體與SwaI線性化的腺病毒骨架載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體，將攜帶供體DNA的腺病毒El區(qū)穿梭載體與攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒載體同源重組獲得攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體； (5)將構(gòu)建好的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體通過磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化獲得純化的攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒。
8.攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。
全文摘要
一種攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒，缺失E1區(qū)和E3區(qū)，在缺失區(qū)插入了鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA。構(gòu)建方法由構(gòu)建腺病毒骨架載體、構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件的腺病毒E3區(qū)穿梭載體、構(gòu)建攜帶供體DNA的腺病毒E1區(qū)穿梭載體、構(gòu)建攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒載體、包裝和擴(kuò)增以及純化步驟組成，攜帶鋅指核酸酶表達(dá)元件和供體DNA的腺病毒在制備治療遺傳性疾病藥物中的用途。
文檔編號A61P43/00GK103215234SQ201310076298
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月9日
發(fā)明者夏海濱, 張偉鋒, 劉思也 申請人:陜西師范大學(xué)