專利名稱：具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中藥重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.或七葉一枝花 Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根莖,具有清熱解毒，消腫止痛、涼肝定驚之功效，用于治療疔瘡癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌打傷痛、涼風(fēng)抽搐等癥，是云南白藥、宮血寧膠囊、季德勝蛇藥片等中成藥的主要組成藥物?，F(xiàn)代藥理研究表明，重樓具有細(xì)胞毒活性、抑菌抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、鎮(zhèn)靜、抗早孕、殺精、對呼吸系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)作用等生理活性，在臨床上用于治療肺系、功能性子宮出血、淋巴結(jié)結(jié)核潰瘍、神經(jīng)性皮炎、外科炎癥以及腫瘤等疾病療效顯著。目前有重樓入藥的上市中成藥復(fù)方有金復(fù)康口服液、軟堅口服液、樓蓮膠囊、肝復(fù)樂片等。近年來，重樓及其抗腫瘤有效成分重樓總皂苷的文獻(xiàn)報道日益增多。中國中藥雜志，2008，33 (16) =2057-2060中公開了滇重樓皂苷對10種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒譜及構(gòu)效關(guān)系研究；黃賢校等在中草藥雜志2009，40 (3) =483-489發(fā)表了重樓屬藥用植物皂苷類化學(xué)成分及其生源途徑的研究進(jìn)展；陳志紅等考察了重樓總皂苷對人肺癌細(xì)胞A549的增殖抑制作用及對細(xì)胞周期的影響；朱麗麗等對重樓皂苷抑制SGC-7901細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行了研究；林云華研究發(fā)現(xiàn)重樓和奧沙利鉬在體外、體內(nèi)實驗中可能具有一定抗血管生成的作用，兩者聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同增效作用。賈科等發(fā)現(xiàn)重樓總皂苷可顯著抑制MGC-803細(xì)胞的生長并呈時間-劑量依賴關(guān)系，可阻滯細(xì)胞于S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的升高；可顯著抑制EphA2、survivin蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)Caspase_3蛋白的表達(dá),進(jìn)而得出結(jié)論其作用機(jī)制可能與下調(diào)EphA2和survivin 的表達(dá)以及促進(jìn)Caspase_3的表達(dá)有關(guān)。中國專利第200610052223.8號中公開了一種重樓總皂苷的制備方法，第200810052092.2號中也公開了一種以重樓總皂苷為有效成分的藥物制劑及其制備方法。姜黃始載于《唐本草》,為姜科植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖,其性味辛、苦、溫，歸脾、肝經(jīng)，具有破血行氣，通經(jīng)止痛之功效，可用于胸脅刺痛，胸痹心痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，癥瘕，風(fēng)濕肩臂疼痛，跌撲腫痛等病癥的治療。姜黃含有多種化學(xué)成分，主要成分為姜黃素類化合物:姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素等；倍半萜類化合物:姜黃新酮、姜黃酮醇A、B等；揮發(fā)油(4.2%):姜黃酮、姜黃烯、莪術(shù)醇等，此外還含有姜黃多糖類成分。其中姜黃素類有效成分的藥理作用廣泛，其抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗抑郁、抗腫瘤等作用已被普遍認(rèn)可，其中抗腫瘤作用自1985年首次提出后，已有大量的實驗研究證實，作用機(jī)制主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制血管生成，有阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等方面。黃東生等研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠增強(qiáng)caspase-8的表達(dá),從而啟動外源性凋亡途徑，誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞凋亡。方悅等報道姜黃素具有抗食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)腫瘤的作用。中國專利CN1931353A公開了一種姜黃素提取及其中藥組合物制備方法。
白芍是毛茛科植物芍藥屬的去皮干燥根，性微寒，味苦、酸，有養(yǎng)血柔肝、緩中止痛、斂陰收汗之功效。白芍的藥效成分包括芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷，苯甲酰茍藥苷等，統(tǒng)稱為白茍總苷(total glucosides of peony,TGP)。研究發(fā)現(xiàn),其可以在多個環(huán)節(jié)影響自身免疫疾病的細(xì)胞免疫、體液免疫以及炎癥過程，并有鎮(zhèn)痛、保肝的作用。芍藥苷作為占TGP90%以上的化合物，近年來發(fā)現(xiàn)亦有抗腫瘤活性。其作用機(jī)制除了增強(qiáng)機(jī)體的免疫力外，還具有體內(nèi)外引起腫瘤細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、對化療藥物減毒增效等作用。楊加域等發(fā)現(xiàn)白芍醇提液超濾膜分離藥效部位在體外具有抗腫瘤活性；詹可順等報道TGP聯(lián)合化療治療非小細(xì)胞肺癌優(yōu)于單純化療，并能提高患者生存質(zhì)量、改善患者細(xì)胞免疫功能和升高外周血象。中國專利第200510045840.0號中公開了一種具有升高白細(xì)胞作用的芍藥苷與芍藥內(nèi)酯苷的組合物，適用于制備治療因各種原因引起的白細(xì)胞減少、血小板和血紅球蛋白降低等病癥的藥物。高小蓉等采用水提醇沉、膜分離、DEAE-纖維素柱層析分離純化等方法得到白芍多糖Lewis肺癌和S180肉瘤模型均有較好的抑制率。目前，重樓皂苷與黃芪多糖的中藥組合物(CN101152408A)的專利已見諸報道，而尚未發(fā)現(xiàn)同時具有抗肺癌和肝癌作用且由重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物組成的中藥組合物。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種活性更強(qiáng)且作用明確的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物由重樓提取物、姜黃多糖和白芍提取物以1: 0.1-5: 1-10的重量比組成；其中重樓提取物為市售商品，規(guī)格為5: UlO:1 或20:1 ;所述的姜黃多糖的制備方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟:1)將姜黃藥材或飲片粉碎成小塊，然后加入到無水乙醇中浸泡I小時，藥材與無水乙醇的用量比為Ig: 9.5mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取I小時，棄去提取液，保留回流物殘渣；2)將上述回流物殘渣加入到水中，回流物殘渣與水的用量比為Ig: 9-10mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取2次，每次2.5小時，合并2次提取液；3)將上述提取液加入到95%濃度的乙醇溶液中至醇度達(dá)75%，靜置過夜，然后在7500r.HiirT1的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集沉淀物并冷凍干燥，之后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，即得姜黃多糖粗提物；4)將上述姜黃多糖粗提物用水溶解而制成樣品溶液，然后加入用量為樣品溶液體積1/4的氯仿和正丁醇混合溶劑進(jìn)行萃取，劇烈振搖20-30min，離心分離，再在濾液中加入1/4濾液體積的氯仿和正丁醇混合溶劑并劇烈振搖，重復(fù)上述操作，直至水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)不再出現(xiàn)，將萃取液減壓濃縮至原體積的1/4 ；5)將上述濃縮后的萃取液置于透析袋中流水透析3天，濾去透析袋內(nèi)不溶物，然后在澄清液中加入95 %濃度的乙醇溶液至醇度達(dá)85 %，靜置過夜，將沉淀物用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到精制后的姜黃多糖；
所述的白芍提取物的制備方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟:I)將白芍藥材或飲片粉碎成粗粉，然后加入到65%濃度的乙醇溶液中浸泡I小時，白芍和65%濃度的乙醇用量比為Ig: 8-10mL，然后在95°C的溫度下加熱回流提取3次，第I次2小時，第2、3次各I小時，合并3次提取液；2)將上述提取液過濾后減壓濃縮至原體積的1/2，然后加入1.5倍體積的水，加熱至微沸后于陰涼處靜置12小時后過濾，將沉淀物在85°C的溫度下蒸發(fā)干燥而得到白芍提取物。在上述姜黃多糖的制備方法中，所述的步驟2}和步驟3}之間還包括一個脫色步驟，方法是將步驟2)得到的提取液過濾后減壓濃縮至25°C下相對密度為1.0，然后采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301-G在35°C，pH = 5.5的條件下進(jìn)行脫色。在上述姜黃多糖的制備方法中，所述的步驟4)中氯仿和正丁醇混合溶劑中氯仿和正丁醇的體積比為4.5: I。所述重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物的用量比為1: 2.5: 5。本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物是由市售重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物混合制成。經(jīng)體外MTT法活性試驗證明，此中藥組合物可顯著抑制LA795等肺癌細(xì)胞株以及Hep-B3等肝癌細(xì)胞株的生長；對肺腺癌和肝癌荷瘤小鼠模型試驗顯示，抑瘤率分別均在50 %以上，提高小鼠脾指數(shù)與肝指數(shù)，抗肺癌和肝癌的活性更高且作用明確，對肺癌、肝癌具有很好的抑制作用。另外，所述的中藥組合物制備過程簡單，并可制備成各種不同劑型。
具體實施例方式實施例一:
(I)取Ig過80目篩后規(guī)格為10: I的市售重樓提取物(寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司生產(chǎn))粉末。(2)姜黃多糖的制備I)將300g姜黃藥材粉碎成小塊，然后加入到無水乙醇中浸泡I小時，藥材與無水乙醇的用量比為Ig: 9.5mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取I小時，棄去提取液，保留回流物殘渣；2)將上述回流物殘渣加入到水中，回流物殘渣與水的用量比為Ig: 9mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取2次，每次2.5小時，合并2次提取液；3)將上述得到的提取液過濾后減壓濃縮至25°C下相對密度為1.0，然后采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301-G在35°C，pH = 5.5的條件下進(jìn)行脫色；4)將上述脫色后的提取液加入到95%濃度的乙醇溶液中至醇度達(dá)75%，靜置過夜，然后在7500r.HiirT1的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集沉淀物并冷凍干燥，之后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，即得姜黃多糖粗提物；5)將上述姜黃多糖粗提物用水溶解而制成樣品溶液，然后加入用量為樣品溶液體積1/4的氯仿和正丁醇混合溶劑(V/V = 4.5: I)進(jìn)行萃取，劇烈振搖20-30min，離心分離，再在濾液中加入1/4濾液體積的氯仿和正丁醇混合溶劑并劇烈振搖，重復(fù)上述操作，直至水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)不再出現(xiàn)，將萃取液減壓濃縮至原體積的1/4 ；
6)將上述濃縮后的萃取液置于透析袋中流水透析3天，濾去透析袋內(nèi)不溶物，然后在澄清液中加入95 %濃度的乙醇溶液至醇度達(dá)85 %，靜置過夜，將沉淀物用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到精制后的姜黃多糖20.lg。(3)白芍提取物的制備I)將IOOg白芍藥材粉碎成粗粉，然后加入到65%濃度的乙醇溶液中浸泡I小時，白芍和65%濃度的乙醇用量比為Ig: 9mL，然后在95°C的溫度下加熱回流提取3次，第I次2小時，第2、3次各I小時，合并3次提取液；2)將上述提取液過濾后減壓濃縮至原體積的1/2，然后加入1.5倍體積的水，加熱至微沸后于陰涼處靜置12小時后過濾，將沉淀物在85°C的溫度下蒸發(fā)干燥而得到白芍提取物13.5g。(4)中藥組合物的制備將上述重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物按1: 2.5: 5的重量比混合后即可制成本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物。實施例二:(I)取IOg過80目篩后規(guī)格為5: I的市售重樓提取物粉末。(2)姜黃多糖的制備I)將300g姜黃藥材粉碎成小塊，然后加入到無水乙醇中浸泡I小時，藥材與無水乙醇的用量比為Ig: 9.5mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取I小時，棄去提取液，保留回流物殘渣；2)將上述回流物殘渣加入到水中，回流物殘渣與水的用量比為Ig: 10mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取2次，每次2.5小時，合并2次提取液；3)將上述得到的提取液過濾后減壓濃縮至25°C下相對密度為1.0，然后采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301-G在35°C，pH = 5.5的條件下進(jìn)行脫色；4)將上述脫色后的提取液加入到95%濃度的乙醇溶液中至醇度達(dá)75%，靜置過夜，然后在7500r.HiirT1的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集沉淀物并冷凍干燥，之后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，即得姜黃多糖粗提物；5)將上述姜黃多糖粗提物用水溶解而制成樣品溶液，然后加入用量為樣品溶液體積1/4的氯仿和正丁醇混合溶劑(V/V = 4.5: I)進(jìn)行萃取，劇烈振搖20-30min，離心分離，再在濾液中加入1/4濾液體積的氯仿和正丁醇混合溶劑并劇烈振搖，重復(fù)上述操作，直至水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)不再出現(xiàn)，將萃取液減壓濃縮至原體積的1/4 ；6)將上述濃縮后的萃取液置于透析袋中流水透析3天，濾去透析袋內(nèi)不溶物，然后在澄清液中加入95 %濃度的乙醇溶液至醇度達(dá)85 %，靜置過夜，將沉淀物用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到精制后的姜黃多糖20.6g。(3)白芍提取物的制備I)將IOOg白 芍藥材粉碎成粗粉，然后加入到65%濃度的乙醇溶液中浸泡I小時，白芍和65%濃度的乙醇用量比為Ig: 8mL，然后在95°C的溫度下加熱回流提取3次，第I次2小時，第2、3次各I小時，合并3次提取液；2)將上述提取液過濾后減壓濃縮至原體積的1/2，然后加入1.5倍體積的水，加熱至微沸后于陰涼處靜置12小時后過濾，將沉淀物在85°C的溫度下蒸發(fā)干燥而得到白芍提取物13.5g。(4)中藥組合物的制備將上述重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物按1: 0.1:1的重量比混合后即可制成本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物。實施例三:(I)取IOg過80目篩后規(guī)格為20: I的市售重樓提取物粉末。(2)姜黃多糖的制備I)將300g姜黃藥材粉碎成小塊，然后加入到無水乙醇中浸泡I小時，藥材與無水乙醇的用量比為Ig: 9.5mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取I小時，棄去提取液，保留回流物殘渣；2)將上述回流物殘渣加入到水中，回流物殘渣與水的用量比為Ig: 10mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取2次，每次2.5小時，合并2次提取液；3)將上述 得到的提取液過濾后減壓濃縮至25°C下相對密度為1.0，然后采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301-G在35°C，pH = 5.5的條件下進(jìn)行脫色；4)將上述脫色后的提取液加入到95%濃度的乙醇溶液中至醇度達(dá)75%，靜置過夜，然后在7500r.HiirT1的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集沉淀物并冷凍干燥，之后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，即得姜黃多糖粗提物；5)將上述姜黃多糖粗提物用水溶解而制成樣品溶液，然后加入用量為樣品溶液體積1/4的氯仿和正丁醇混合溶劑(V/V = 4.5: I)進(jìn)行萃取，劇烈振搖20-30min，離心分離，再在濾液中加入1/4濾液體積的氯仿和正丁醇混合溶劑并劇烈振搖，重復(fù)上述操作，直至水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)不再出現(xiàn)，將萃取液減壓濃縮；6)將上述濃縮后的萃取液置于透析袋中流水透析3天，濾去透析袋內(nèi)不溶物，然后在澄清液中加入95 %濃度的乙醇溶液至醇度達(dá)85 %，靜置過夜，將沉淀物用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到精制后的姜黃多糖20.6g。(3)所述白芍提取物的提取方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟:I)將粉碎成粗粉的白芍藥材100g，采用IL白芍粗粉干重的(W/W) 65%乙醇，浸泡I小時后于溫度95°C下回流提取2小時，并且按第I次回流提取操作條件再進(jìn)行回流提取2次，每次I小時,合并3次提取液；2)提取液過濾后經(jīng)減壓濃縮至原體積的1/2，加入1.5倍體積的水，加熱至微沸后于陰涼處靜置12小時后過濾，沉淀物在85°C下蒸發(fā)干燥，得到白芍提取物。(4)中藥組合物的制備將上述重樓提取物、姜黃多糖以及白芍提取物按1: 5: 10的重量比混合后即可制成本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物。為了驗證本發(fā)明提供的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物的藥效，本發(fā)明人進(jìn)行了如下試驗:一.抗腫瘤活性試驗1.體外抗腫瘤活性試驗1.1細(xì)胞株及培養(yǎng)小鼠肺腺癌LA795細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10 %滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMn640培養(yǎng)基中，于37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3-4天傳代一次。人肺腺癌A549細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10 %滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3 4天傳代一次。BEL-7402肝癌細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMn640培養(yǎng)基中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3_4天傳代一次。!fep-B3肝癌細(xì)胞株，培養(yǎng)于含10%滅活胎牛血清、100U/mL青霉素和100μ g/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱及飽和濕度條件下培養(yǎng)，3 4天傳代一次。1.2藥物抗腫瘤活性測定MTT法:將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后配制成濃度為3X IO4個/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔酶標(biāo)板，每孔加200 μ L0 24h后換不含血清培養(yǎng)液，使細(xì)胞同步化生長,每孔200 μ L。第三天向孔中加入受試藥，即分別加入重樓提取物水溶液，姜黃多糖水溶液，白芍提取物水溶液以及本中藥組合物水溶液；另設(shè)對照組:0.1%二甲基亞砜(DMSO)，每孔加200 μ L0受試藥每組分別設(shè)0.01,0 .1,1,10,100,1000 μ g/mL六個濃度，每個濃度設(shè)8個平行孔，于37°C下培養(yǎng)24h后，每孔加無血清無酚紅培養(yǎng)液新鮮配制的0.5mg/mL MTT100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后，每孔加IOOyL DMSO溶解MTT甲臜顆粒，用微型振蕩器振蕩混勻后，于酶標(biāo)儀上測定光密度值(OD)，實驗重復(fù)三次，取平均值。以溶劑對照處理腫瘤細(xì)胞為對照組，由OD值計算抑制率，公式為:細(xì)胞生長抑制率=(對照組OD值一實驗組OD值)/對照組OD X 100%，并以藥物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，并求得IC5tl (半數(shù)抑制率)，IC5tl =細(xì)胞生長抑制率為50%的藥物濃度。結(jié)果見表I。2.體內(nèi)抗腫瘤活性試驗分別將100只T739小鼠(雌性，18_20g)給予上述實施例制備的中藥組合物進(jìn)行小鼠LA795肺腺癌轉(zhuǎn)移模型體內(nèi)藥效試驗。分別將100只昆明小鼠(雌性，18_20g)給予上述實施例制備的中藥組合物進(jìn)行小鼠HepA肝癌模型和H22肝癌模型體內(nèi)藥效試驗。2.1動物造模2.1.1HepA肝癌模型取接種H印A肝癌細(xì)胞后腹水飽滿的荷瘤小鼠，用生理鹽水洗滌腹部以進(jìn)行消毒，于超凈工作臺中抽取5mL乳白色腹水作為瘤源，然后加入5mL生理鹽水而配制成1:1比例的細(xì)胞懸液，用無菌注射器抽取0.1mL并接種于一只小鼠腋下，共接種100只。整個操作在無菌條件下進(jìn)行。2.1.2H22肝癌模型取接種H22肝癌細(xì)胞后腹水飽滿的荷瘤小鼠，用生理鹽水洗滌腹部以進(jìn)行消毒，于超凈工作臺中抽取5mL乳白色腹水作為瘤源，然后加入5mL生理鹽水而配制成1:1比例的細(xì)胞懸液，用無菌注射器抽取0.1mL并接種于一只小鼠腋下，共接種100只。整個操作在無菌條件下進(jìn)行。2.1.3LA795肺腺癌轉(zhuǎn)移模型取接種LA795肺腺癌細(xì)胞后第6_8天腫瘤生長良好的T739荷瘤鼠，拉斷頸椎處死小鼠，在無菌條件下剝離腫瘤，選擇新鮮無壞死的瘤組織剪碎并置于玻璃研磨器中，加適量生理鹽水輕輕研磨制備成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞篩過濾后加生理鹽水稀釋、計數(shù)，調(diào)配成細(xì)胞濃度為1000萬/毫升的細(xì)胞懸液，接種于健康小鼠右前肢腋窩皮下，每只0.2ml。2.2動物分組及給藥2.2.HfepA肝癌模型于接種次日開始給藥，每日I次:(I)模型組，灌服生理鹽水，每只0.2mL ； (2)化療組:按20mg/kg -bw腹腔注射環(huán)磷酰胺；(3)重樓高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；⑷重樓低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(5)姜黃多糖高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(6)姜黃多糖低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(7)白茍高劑量組:按400mg/kg *bw灌服；⑶白茍低劑量組:按200mg/kg *bw灌服；(9)中藥組合物高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(10)中藥組合物低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；給藥兩周，于給藥結(jié)束后次日頸部脫白處死小鼠，解剖取其瘤組織并稱重，按下式計算抑瘤率；同時摘取脾，胸腺并稱重，按下式計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果見表2、表3。抑瘤率(％ ) = (1-給藥組平均瘤重/生理鹽水組平均瘤重)X 100%脾指數(shù)=(脾臟重量/體重)*1000胸腺指數(shù)=(胸腺重量/體重)*10002.2.2H22肝癌模型于接種次日開始給藥，每日I次:(I)模型組，灌服生理鹽水，每只0.2mL ； (2)化療組:按20mg/kg -bw腹腔注射環(huán)磷酰胺；(3)重樓高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(4)重樓低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(5)姜黃多糖高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(6)姜黃多糖低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(7)白茍高劑量組:按400mg/kg *bw灌服；⑶白茍低劑量組:按200mg/kg *bw灌服；(9)中藥組合物高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(10)中藥組合物低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；給藥兩周，于給藥結(jié)束后次日頸部脫白處死小鼠，解剖取其瘤組織并稱重，按上面的公式計算抑瘤率；同時摘取脾，胸腺并稱重，按上面的公式計算脾指數(shù)`和胸腺指數(shù)。結(jié)果見表4、表5。2.2.3LA795肺腺癌轉(zhuǎn)移模型于接種次日開始給藥，每日I次:(I)模型組，灌服生理鹽水，每只0.2mL ； (2)化療組:按20mg/kg -bw腹腔注射環(huán)磷酰胺；(3)重樓高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(4)重樓低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(5)姜黃多糖高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(6)姜黃多糖低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(7)白茍高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(8)白茍低劑量組:按200mg/kg.bw灌服；(9)中藥組合物高劑量組:按400mg/kg.bw灌服；(10)中藥組合物低劑量組:按200mg/kg.bw灌服。給藥兩周，于給藥結(jié)束后次日頸部脫白處死小鼠，解剖取其瘤組織并稱重，按上面的公式計算抑瘤率；摘取肝，脾，胸腺、腎、心、腦、肺、胃、回腸、結(jié)腸，其中肝，脾分別稱重，按上面的公式計算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。將取下的組織保存于10%中性福爾馬林中，并做石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色，其中瘤組織亦做TUNEL染色，觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果見表6-表8。二、抗腫瘤活性試驗結(jié)果表I本中藥組合物體外抗癌活性試驗結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物，其特征在于:所述的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物由重樓提取物、姜黃多糖和白芍提取物以1: 0.1-5: 1-10的重量比組成；其中重樓提取物為市售商品，規(guī)格為5: UlO: I或20: I ； 所述的姜黃多糖的制備方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟: 1)將姜黃藥材或飲片粉碎成小塊，然后加入到無水乙醇中浸泡I小時，藥材與無水乙醇的用量比為Ig: 9.5mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取I小時，棄去提取液，保留回流物殘渣； 2)將上述回流物殘渣加入到水中，回流物殘渣與水的用量比為Ig: 9-10mL，然后在90°C的溫度下加熱回流提取2次，每次2.5小時，合并2次提取液； 3)將上述提取液加入到95%濃度的乙醇溶液中至醇度達(dá)75%，靜置過夜，然后在7500r.HiirT1的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集沉淀物并冷凍干燥，之后依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀，即得姜黃多糖粗提物； 4)將上述姜黃多糖粗提物用水溶解而制成樣品溶液，然后加入用量為樣品溶液體積1/4的氯仿和正丁醇混合溶劑進(jìn)行萃取，劇烈振搖20-30min，離心分離，再在濾液中加入1/4濾液體積的氯仿和正丁醇混合溶劑并劇烈振搖，重復(fù)上述操作，直至水層和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)不再出現(xiàn)，將萃取液減壓濃縮至原體積的1/4 ； 5)將上述濃縮后的萃取液置于透析袋中流水透析3天，濾去透析袋內(nèi)不溶物，然后在澄清液中加入95%濃度的乙醇溶液至醇度達(dá)85%，靜置過夜，將沉淀物用無水乙醇和丙酮洗滌，干燥后即可得到精制后的姜黃多糖； 所述的白芍提取物的制備方法包括按順序進(jìn)行的下列步驟: 1)將白芍藥材或飲片粉碎成粗粉，然后加入到65%濃度的乙醇溶液中浸泡I小時，白芍和65%濃度的乙醇用量比為Ig: 8-10mL，然后在95°C的溫度下加熱回流提取3次，第I次2小時，第2、3次各I小時，合并3次提取液； 2)將上述提取液過濾后減壓濃縮至原體積的1/2，然后加入1.5倍體積的水，加熱至微沸后于陰涼處靜置12小時后過濾，將沉淀物在85°C的溫度下蒸發(fā)干燥而得到白芍提取物。
在上述姜黃多糖的制備方法中，所述的步驟2)和步驟3)之間還包括一個脫色步驟，方法是將步驟2)得到的提取液過濾后減壓濃縮至25°C下相對密度為1.0，然后采用大孔弱堿性陰離子交換樹脂D301-G在35°C，pH = 5.5的條件下進(jìn)行脫色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物，其特征在于:在上述姜黃多糖的制備方法中，所述的步驟4)中氯仿和正丁醇混合溶劑中氯仿和正丁醇的體積比為4.5: I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物，其特征在于:所述重樓提取物、姜黃多糖以 及白芍提取物的用量比為1: 2.5: 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗肺癌和肝癌作用的中藥組合物，其由重樓提取物、姜黃多糖和白芍提取物以1∶0.1-5∶1-10的重量比組成。本發(fā)明提供的中藥組合物經(jīng)體外MTT法活性試驗證明，可顯著抑制LA795等肺癌細(xì)胞株以及Hep-B3等肝癌細(xì)胞株的生長；肺腺癌和肝癌荷瘤小鼠模型試驗顯示，抑瘤率分別均在50％以上，可提高小鼠脾指數(shù)與肝指數(shù)，明顯抑制小鼠皮下移植腫瘤的肺轉(zhuǎn)移和引起腫瘤細(xì)胞的凋亡且無明顯毒副作用。與單獨應(yīng)用原藥材相比，該藥物組合物抗肺癌和肝癌的活性更高且作用明確，對肺癌、肝癌具有很好的抑制作用。
文檔編號A61P35/00GK103169844SQ20131007930
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月13日
發(fā)明者高文遠(yuǎn), 張瑤, 劉振, 滿淑麗, 李紅法 申請人:天津大學(xué)