專利名稱：芒果苷-順鉑組合物和它們在癌癥治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領域，涉及一種在水中穩(wěn)定性明顯增加、抗癌細胞增殖作用明顯增強的芒果苷-順鉬組合物、組合物的制備方法及其作為藥物的應用。
背景技術：
目前，臨床應用最為廣泛的絡合鉬類化療藥物是順鉬，順鉬主要作用部位在DNA的嘌呤和嘧啶堿基，具有抗癌譜廣、作用強、與多種抗腫瘤藥有協(xié)同作用、且無交叉耐藥等特點，為當前聯(lián)合化療中最常用的藥物之一。然而，順鉬遇光降解，在光下，順鉬溶液會發(fā)生光水合反應和光氧化還原反應，最終析出金屬鉬，降低藥物有效濃度，影響化療療效，甚至造成化療耐藥。芒果苷(mangiferin)又名知母寧，是一種天然黃酮碳苷類化合物，來源于芒果樹、知母等植物中，具有一定的抗氧化、抗炎與防癌抗癌作用。近年研究發(fā)現(xiàn)其能預防癌癥的發(fā)生，并可抑制癌細胞生長增殖，誘導其凋亡。彭志剛等研究發(fā)現(xiàn)芒果苷可誘導白血病K562與HL-60細胞G2/M期阻滯，從而抑制癌細胞增殖。黃華藝等研究發(fā)現(xiàn)芒果甙對肝癌細胞株BEL-7404有明顯的毒性作用，能誘導肝癌細胞凋亡和阻滯細胞周期于G2/M期。農少云等研究發(fā)現(xiàn)肝癌細胞經EGF刺激后，P120ctn發(fā)生酪氨酸磷酸化，細胞黏附能力降低而遷移能力增強，而經芒果甙處理后，在一定程度上能使這些惡性表現(xiàn)得到逆轉，表現(xiàn)為P120ctn酪氨酸磷酸化程度較輕，提示芒果甙對P120ctn酪氨酸磷酸化有抑制作用。Plessis-Stoman等研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)用芒果苷(10.0 μ g/ml)降低了奧沙利鉬對HeLa與HT29兩種腫瘤細胞的IC50值，分別為1.7倍與3.4倍，同時發(fā)現(xiàn)芒果苷可以延緩腫瘤細胞對奧沙利鉬的耐藥性。本發(fā)明通過制備芒果苷一順鉬組合物，可使順鉬水溶液穩(wěn)定性明顯增加，抗腫瘤作用明顯增強，因此可相 應減少順鉬用量，從而降低副作用，減少患者痛苦，改善病人預后?？捎糜谥苽淇垢伟┑雀鞣N腫瘤治療藥物。

發(fā)明內容
本發(fā)明人的研究結果表明，芒果苷呈酸性，具有抗氧化作用，而順鉬呈堿性，二者可在一定條件下反應生成芒果苷-順鉬組合物，明顯增加了順鉬在水溶液中的穩(wěn)定性。定位為組合物，是因為兩者的結合并不十分牢固，只是分子間范德華力作用的結果。這種組合物在濃度較大，或進入體內時，又互相分開而獨立存在，進而發(fā)揮各自的藥理作用。本發(fā)明的技術方案述及了芒果苷-順鉬組合物的制備方法及其作為藥物的應用。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，芒果苷和順鉬混合比例(質量)彡4: I時，順鉬在生理鹽水中才穩(wěn)定。在實際操作中，芒果苷和順鉬的質量比可有一定幅度的浮動，一般為±10%。也就是說，在實際操作中，芒果苷和順鉬的重量百分比為:芒果苷 70 90%順鉬10 30%
芒果苷-順鉬組合物的制備方法如下:避光條件下，將芒果苷與順鉬按比例溶于藥學可接受溶劑中，除雜，按劑量灌裝于耐壓藥用玻璃瓶內，滅菌，冷凍干燥，封蓋，即得。臨用時用生理鹽水溶解即可。試驗結果表明，芒果苷和順鉬混合比例(質量)彡4: I時，在室溫與普通光照條件下，芒果苷-順鉬組合物生理鹽水溶液十分穩(wěn)定，4小時內順鉬含量無降低。且芒果苷-順鉬組合物0.5-1%的溶液，在4°C環(huán)境中保存，8個小時內不會析出結晶；如是1-2%的溶液，即配即用，在3個小時內不會析出結晶。
具體實施例方式下列實施例子用于舉例說明本發(fā)明，并不是對本發(fā)明保護范圍的任何限制。實施例一芒果苷-順鉬組合物的制備:避光條件下，將芒果苷與順鉬按質量比4: I溶于雙蒸水中，除雜，按劑量灌裝于耐壓藥用IOml玻璃瓶內，滅菌，冷凍干燥，封蓋，即得。臨用時用適量生理鹽水溶解即可。實施例二芒果苷-順鉬組合物的制備:避光條件下，將芒果苷與順鉬按質量比5: I溶于雙蒸水中，除雜，按劑量灌裝于耐壓藥用IOml玻璃瓶內，滅菌，冷凍干燥，封蓋，即得。臨用時用適量生理鹽水溶解即可。附藥理實驗研究資料I材料與方法

1.1腫瘤細胞株人肝癌細胞!fepG2，由廣西中醫(yī)藥大學分子生物學實驗中心惠贈。1.2藥物與試劑芒果苷，廣西邦爾植物制品有限公司(純度為98.6% )，批號20100801 ;注射用順鉬，山東齊魯制藥廠，批號1050141DB ;DMEM，美國Gibco公司，批號1397535 ;胎牛血清，杭州四季青公司產品，批號101102 ；MTT (噻唑蘭)，美國Amresco公司，批號0793 ;胰蛋白酶，美國Amresco公司，批號3518B039。1.3 儀器 Thermo Forma381 型 C2 培養(yǎng)箱，THERMO Electron Corporation ；Leica-DMR倒置顯微鏡，德國Leica公司；ELX_800型酶標儀，美國BIO-Tek ；Simplicity UV超純水儀，美國MILLIPORE ;EL204萬分之一克電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；Allegra X-22R Centrifuge 離心機，美國 BECKMAN COULTER 公司。1.4細胞培養(yǎng)HepG2細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM中，用接種傳代第3天的細胞作實驗。實驗分組:分為A組:單純加芒果苷，終濃度為5.0，10.0，20.0 μ g/ml3個濃度出組:單純加順鉬，終濃度為0.25,0.5，1.0，2.0μ g/ml4個濃度；(:組:A組各濃度芒果苷加B組各濃度順鉬；D組:對照組，只有肝癌IfepG2細胞，不加藥物。1.5MTT法測定藥物對肝癌HepG2細胞生長增殖的抑制率收集處于對數(shù)生長期的人肝癌H印G2細胞，配制成IxlO4個/ml細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μ I。孵育待細胞貼壁后分別加入A組、B組及C組藥物各100 μ 1，每組設4個復孔及空白對照孔，空白對照孔只加等體積培養(yǎng)液，重復相同3個96孔板。置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱內分別培養(yǎng)24，48，72h后，每孔加入用生理鹽水新鮮配制的MTT (5mg/ml) 10 μ 1，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMS0150l.! 1，振蕩lOmin，以酶標儀在490nm處測各孔吸光度值(OD)，按照下列公式計算細胞生長抑制率:抑制率(％ ) = (1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)X 100%。采用兩藥相互作用系數(shù)(coefficient of drug in interaction, 0)1)來評價兩藥相互作用性質。CDI按下列公式進行計算:CDI = AB/AXB，根據(jù)活細胞數(shù)(吸光度值)進行計算，AB是聯(lián)合組與對照組的比值，A或B是各藥單獨使用組與對照組的比值。⑶I < 1，兩藥相互作用的性質為協(xié)同KDI < 0.7，兩藥相互之間的協(xié)同作用非常顯著KDI = 1，兩藥的相互作用性質為相加；CDI > 1，兩藥的相互作用性質為拮抗。1.6ELISA法檢測藥物對PTK的抑制率取對數(shù)生長期的H印G2細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，按1.5方法分別加入不同濃度的芒果苷與順鉬，置于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時間(24h，48h，72h)后，洗凈細胞培養(yǎng)液后，再加入細胞裂解緩沖液充分重懸并冰浴裂解，12000g離心lOmin，得到藥物作用后的含蛋白酪氨酸激酶的細胞裂解液，取上清液按ELISA法檢測其PTK活性(用酶標儀于450nm波長檢測)。抑制率(％ )=(對照孔OD值-樣品孔OD值)/對照孔OD值X 100 %。1.7統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)以i±S表示，組間比較采用t檢驗，P< 0.05為有統(tǒng)計意義。2 結果2.1芒果苷和順鉬各用藥濃度對肝癌細胞IfepG2生長抑制率的影響不同濃度的芒果苷和順鉬單獨用藥或聯(lián)合用藥分別對HepG2細胞作用24，48，72h,均可抑制人肝癌H印G2細胞株的生長，并且具有較明顯的劑量-時效關系，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時間的延長而增強；同時從實驗結果中能夠觀測到各濃度芒果苷與順鉬聯(lián)合用藥對肝癌細胞的生長抑制率均比各相應的單獨用藥組顯著增強(P<0.05);用藥72h后，順鉬(2.0yg/ml)、芒果苷(20.0 μ g/ml)、順鉬+芒果苷(2.0+20.0 μ g/ml)對H印G2細胞生長的最大抑制率分別為72.49%,36.49%與88.67% ;且芒果苷與順鉬單獨用藥時，隨著各自藥物濃度的提高，順鉬對H印G2生長抑 制率的影響明顯大于芒果苷。見表I。表I芒果苷與順鉬聯(lián)用對人肝癌細胞H印G2的生長抑制率(％ ) ( i±s, η = 4)
權利要求
1.一種芒果苷-順鉬組合物，其特征在于:按質量比計算，由70 90 %的芒果苷和10 30%的順鉬組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的芒果苷-順鉬組合物，其特征在于:制備方法如下:避光條件下，將芒果苷與順鉬按比例溶于藥學可接受溶劑中，除雜，按劑量灌裝于耐壓藥用玻璃瓶內，滅菌，冷凍干燥，封蓋，即得。臨用時用生理鹽水溶解即可。
3.根據(jù)權利要求1所述的芒果苷-順鉬組合物，其特征在于:芒果苷-順鉬組合物在生理鹽水溶液中，順鉬的穩(wěn)定性明顯增加。
4.根據(jù)權利要求1所述的芒果苷-順鉬組合物，其特征在于:芒果苷-順鉬組合物抗腫瘤作用明顯優(yōu)于單用順鉬， 可用于制備抗肝癌等各種腫瘤治療藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芒果苷-順鉑組合物、組合物的制備方法及其作為藥物的應用。順鉑水溶液不穩(wěn)定，通過制備芒果苷-順鉑組合物，可使順鉑在生理鹽水溶液中穩(wěn)定性明顯增加。體外藥理試驗結果表明，芒果苷-順鉑組合物抑制肝癌等腫瘤細胞增殖的作用明顯優(yōu)于單用順鉑，因此可相應減少順鉑用量，從而降低副作用，減少患者痛苦，改善病人預后?？捎糜谥苽涓伟┑雀鞣N腫瘤治療藥物。
文檔編號A61K31/352GK103110660SQ20131008266
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月15日 優(yōu)先權日2013年3月15日
發(fā)明者杜正彩, 鄧家剛 申請人:廣西中醫(yī)藥大學