專利名稱：一種融合基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子生物學和免疫學領域。具體地，本發(fā)明涉及一種融合基因，尤其涉及一種含有信號肽的融合基因及其應用。
背景技術：
1.核酸疫苗核酸疫苗或DNA疫苗，是指將編碼外源性抗原的基因插入到真核表達載體上，然后直接導入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，該抗原蛋白可直接誘導機體產(chǎn)生免疫應答?？乖蛟谝欢〞r限內(nèi)的持續(xù)表達，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應答反應，從而達到預防疾病的目的。DNA疫苗可分別活化機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性的抗體和細胞免疫應答。與傳統(tǒng)疫苗相比，DNA疫苗具有如下優(yōu)點:1、質(zhì)粒DNA非常穩(wěn)定，易于貯存和運輸，使用方便。而且制備簡單，容易大量生產(chǎn)，成本低。2、質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)可較長時間存在，抗原基因在體內(nèi)持續(xù)表達產(chǎn)生抗原蛋白，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長程免疫，免疫效果可靠。3、基因疫苗不僅可以產(chǎn)生體液免疫應答，而且可以導致細胞毒素T淋巴細胞激活而誘導細胞免疫，而傳統(tǒng)的疫苗只有活苗可誘導細胞免疫，但存在活疫苗的毒力回升的危險。4、用核心蛋白保守DNA序列制備的基因疫苗對病原體(細菌或病毒)的各變異亞型都可產(chǎn)生免疫應答，從而避免因病原體變異而造成的免疫逃避問題。5、一個質(zhì)粒載體可克隆多個抗原基因組成多價苗，從而一種基因疫苗可預防多種疾病。6、質(zhì)粒DNA無免疫原性，不會像重組疫苗那樣誘發(fā)針對載體的自身免疫反應。盡管有上述優(yōu)點，但整體而言，DNA疫苗免疫原性較常規(guī)疫苗制品(如蛋白疫苗、滅活疫苗)弱，需要新型載體或佐劑輔助，以提高免疫應答。2.信號肽 另外，某些病原體抗原(比如腸道病毒71型VPl)不具有信號肽，不能分泌性表達，因而直接表達此類抗原基因的核酸疫苗限于細胞內(nèi)表達，未能充分與MHC II類分子結合，影響Th2型特異性細胞免疫，從而影響了針對此類抗原的抗體應答。因此，開發(fā)能高效分泌性表達的信號肽有助于提高活化抗體應答。另一方面，基因治療有時也會涉及分泌型表達，某些細胞因子自身攜帶的信號肽序列可能基于天然的原因，并非能高效分泌表達產(chǎn)物，但涉及該細胞因子的基因治療卻需要高效分泌形式的表達，因而，將該細胞因子信號肽序列替換為高效分泌的信號肽序列，也有助于提聞基因治療的效果。關于信號肽基因用于核酸疫苗的研究也廣泛記載于已有文獻中。早在核酸免疫研究開始時，就有研究人員探討了信號肽融合抗原的核酸免疫效果。Wagener等將異源信號肽基因與猴免疫缺陷病毒(SIV)抗原融合，并活化產(chǎn)生了針對SIV抗原的抗體應答(J.Biotechnol.44，59-65.1996)。Letvin 等將纖溶酶原激活物(tissue plasminogenactivator, tPA)信號肽與人免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白gpl20和gpl60分別融合，形成嵌合基因疫苗載體，該疫苗載體能活化產(chǎn)生較好的細胞免疫應答和體液免疫應答(PNAS.94，9378-9383.1997)。但是tPa信號肽融合對抗體應答的效果是不穩(wěn)定的，有時tPA無法達到提高抗體應答的效果。Li等研究tPA信號肽對結核抗原免疫原性的影響，發(fā)現(xiàn)對tPA信號肽對部分抗原有效果，能顯著提高體液免疫應答(INFECTION AND IMMUNITY.67，4780-4786.1999)。Haddad等對比了 tPA信號肽融合與否對抗體應答的效果，然而其結果表明，tPA信號肽與目的抗原融合并未增強抗體的應答水平(FEMS Immunology and MedicalMicrobiology.18，193-202.1997)。同時，信號肽對核酸疫苗免疫原的影響多數(shù)集中在tPA的研究上，其他的信號肽應用較少，目前還很少有高效的其他信號肽用于核酸疫苗的研究。方艷輝等(中華微生物學和免疫學雜志，第3期，2004)記載了人IL-2信號肽基因增強了柯薩奇病毒B3型VPlDNA疫苗誘導的中和抗體應答。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種含有信號肽的融合基因、其表達載體、以及所述融合基因及表達載體的應用。本發(fā)明的融合基因能在細胞或生物體內(nèi)能分泌性表達目的基因，從而較為穩(wěn)定地提高抗體應答水平，因而可用于旨在提高抗體保護效果的預防性或治療性疫苗產(chǎn)品，比如DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗。此外，本領域普通技術人員可以根據(jù)本發(fā)明，將含所述信號肽的融合基因及其表達載體通過基因治療的方式導入生物體內(nèi)，以產(chǎn)生分泌性表達的目的基因，從而具有某種治療效果，比如高效分泌性表達細胞因子，以用于治療癌癥等疾病。除非另外地指出，本申請說明書中的“融合基因”指信號肽編碼序列與除天然相連的自身編碼序列外的目標基因融合得到的基因。比如融合基因可以是纖連蛋白信號肽編碼序列與除纖連蛋白外的目標基因融合得到的基因，也可以是層粘連蛋白信號肽編碼序列與除層粘連蛋白外的目標基因融合得到的基因，還可以是膠原蛋白信號肽編碼序列與除膠原蛋白外的目標基因融合得到的基因。本發(fā)明總地來說涉及一種包含信號肽編碼序列和目標基因序列的融合基因，包含其的表達載體，上述融合基因和表達載體表達產(chǎn)生的融合蛋白，包含上述融合基因和表達載體的宿主有機體，和包含上述融合基因和表達載體的用于引起免疫反應或基因治療的產(chǎn)品(如DNA疫苗、重組病毒載體疫苗、重組細菌載體疫苗)，上述的融合基因、表達載體、融合蛋白、產(chǎn)品在制備用于引發(fā)免疫反應或用于基因治療的藥物中的用途。所述表達載體包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體和細菌載體。所述宿主細胞包括但不限于真核生物細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，更優(yōu)選的是源于人的細胞。具體地，本發(fā)明提供了以下的技術方案:在本發(fā)明的一個方面，提供了一種融合基因，該融合基因包含信號肽編碼序列和目標基因序列，并且所述的 信號肽編碼序列編碼的信號肽與人纖連蛋白信號肽、人層粘連蛋白信號肽或人膠原蛋白信號肽具有至少90%的同源性；優(yōu)選地，所述的人纖連蛋白信號肽的序列是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，人層粘連蛋白信號肽的序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，并且人膠原蛋白信號肽的序列是SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列；優(yōu)選地，所述的信號肽編碼序列編碼的信號肽選自人纖連蛋白信號肽、人層粘連蛋白信號肽和人膠原蛋白信號肽；進一步優(yōu)選地，所述的信號肽編碼序列為:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列，或者SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列經(jīng)簡并密碼子替換的核酸序列。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述的目標基因是腸道病毒71型VPl ;優(yōu)選地，所述的融合基因選自:融合基因FNs-VPl (其序列為SEQ ID NO:7所示的核酸序列)、融合基因LNs-VPl (其序列為SEQ ID NO:8所示的核酸序列)和融合基因CNs-VPl (其序列為SEQ IDN0:9所示的核酸序列)。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種表達載體，其包含前文所述的融合基因；優(yōu)選地，所述的表達載體是由PVAXl制成的。在本發(fā)明一個優(yōu)選的方面，所述的表達載體的核酸序列選自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的核酸序列；進一步優(yōu)選地，所述的表達載體選自質(zhì)粒載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體和細菌載體。在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由前文所述的融合基因或表達載體表達得到的；優(yōu)選地，所述的融合蛋白的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 和 SEQ IDN0:15 所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的還一個方面，提供了一種用于引起免疫反應或基因治療的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括前文所述的表達載體；優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物、試劑或試劑盒；再優(yōu)選地，所述產(chǎn)品是DNA疫苗。在本發(fā)明的又一個方面，提供了一種制備所述產(chǎn)品的方法，該方法包括將前述的融合基因插入到已知的載體中的步驟；優(yōu)選地，所述的載體選自真核表達質(zhì)粒載體和病毒載體，所述真核表達質(zhì)粒載體優(yōu)選選自pVAXl、pcDNA和pVAXl，所述病毒載體優(yōu)選選自腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒和流感病毒載體；進一步優(yōu)選地，所述的載體是PVAXI ο在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種宿主有機體，其特征在于含有前文所述的融合基因或前文所述的表達載體；優(yōu)選地，所述宿主有機體包括但不限于真核生物細胞；再所述宿主有機體是哺乳動物 細胞，例如是源于人的細胞；再更優(yōu)選地，所述的宿主有機體為Hela細胞。在本發(fā)明的另一個方面，提供了前文所述的融合基因、前文所述的表達載體、前文所述的融合蛋白或前文所述的產(chǎn)品在制備用于引發(fā)免疫反應的藥物中的用途。在本發(fā)明的另一個方面，提供了前文所述的融合基因、前文所述的表達載體、前文所述的融合蛋白或前文所述的產(chǎn)品在制備基因治療的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了如下的技術方案:本發(fā)明提供了一種新的融合基因，其特征在于包含:(I)選自由以下信號肽編碼序列組成的組:纖連蛋白(fibronectin, FN)信號肽、層粘連蛋白(laminin, LN)信號肽、膠原蛋白(collagen, CN)信號肽；(2)目的基因編碼序列，優(yōu)選不含信號肽編碼序列的目的基因。本發(fā)明還提供了包含上述融合基因的載體，其特征在于通過分子克隆方法將上述融合基因插入載體相應區(qū)域。本發(fā)明還提供了用于引起免疫反應或基因治療的產(chǎn)品，其特征在于包含上述融合基因。本發(fā)明還提供了本發(fā)明融合基因或融合基因表達載體在引起免疫反應或基因治療上的應用。因而，本發(fā)明提供了上述3種信號肽與目的抗原的融合基因，并利用融合基因構建了相應的DNA疫苗，并描述了實施融合基因DNA疫苗的有益效果?？傊景l(fā)明的信號肽融合基因在保持活化產(chǎn)生同等的T細胞免疫應答的同時，能活化產(chǎn)生較高水平的抗體應答，從而提高基因治療或疫苗的效果，從而在蛋白制備以及引發(fā)更高水平的免疫反應方面具有廣泛的用途。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中:圖1顯示了所述載體在真核細胞系中的表達VPl蛋白的免疫雜交印跡圖；圖2 顯示了注射了 pVAXl-VPl，pVAXl-FNs-VPl 和 pVAXl-LNs-VPl 載體的小鼠的活化T細胞免疫應答結果；圖3 顯示了注射了 pVAXl-VPl，pVAXl-FNs-VPl，pVAXl-LNs-VPl 載體的小鼠的血清中活化產(chǎn)生的抗體滴度結果。
具體實施例方式實施例1:VP1表汰載體構律人密碼子優(yōu)化的腸道病毒71型(EV71)的VPl基因片段由上海捷瑞全基因合成，序列為SEQ ID NO: 16所示的核酸序列。將該基因片段通過分子生物學方法插入pVAXl疫苗載體(貨號V260-20，invitrogen)中，構建成pVAXl-VPl載體(其序列為SEQ ID N0:25所示的核酸序列)，切位點為KpnI (Takara, 50U/ μ L)和EcoR I (Takara, 15U/ μ L),具體方法與步驟可參考《分子克隆(第三版)》(〔美〕J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)，并為本領域普通技術人員熟知。將鑒定正確的克隆送英駿生物技術有限公司測序，序列正確。用Endo-free質(zhì)粒大量抽提試劑盒(購自QIAGEN，GE)按照試劑盒生產(chǎn)商的說明書所述的方法批量制備pVAXl-VPl供后續(xù)試驗。實施例2 =FNs-YPl融合基因及其表達載體構建根據(jù)人纖連蛋白信號肽氨基酸序列MLRGPGPGLLLLAVQCLGTAVP(SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列)進行真核密碼子優(yōu)化，設計引物。該信號肽的編碼核酸的真核密碼子優(yōu)化序列為SEQ ID NO:1所示的核酸序列。使用的引物包括了 pVAXIFNs-Fl (其序列為SEQ ID NO: 18所示的核酸序列)、pVAXlFNs-F2 (其序列為SEQ ID NO: 19所示的核酸序列)和pVAXIPrimer R (其序列為SEQID NO:20所示的核酸序列)，引物由英駿生物技術有限公司合成?？偣策M行兩輪PCR，體系分別如下。表1:FNs-VP I融合基因及其表達載體構建第一輪PCR體系
權利要求
1.一種融合基因，其包含信號肽編碼序列和目標基因序列，并且所述的信號肽編碼序列編碼的信號肽與人纖連蛋白信號肽、人層粘連蛋白信號肽或人膠原蛋白信號肽具有至少90%的同源性； 優(yōu)選地，所述的人纖連蛋白信號肽的序列是SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，人層粘連蛋白信號肽的序列是SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，并且人膠原蛋白信號肽的序列是SEQID NO:6所示的氨基酸序列； 再優(yōu)選地，所述的信號肽編碼序列編碼的信號肽選自人纖連蛋白信號肽、人層粘連蛋白信號肽和人膠原蛋白信號肽。
2.權利要求1所述的融合基因，其中: 所述的信號肽編碼序列為SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列，或者SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核酸序列經(jīng)簡并密碼子替換的核酸序列。
3.權利要求1或2所述的融合基因，其中所述目標基因是腸道病毒71型VPl; 優(yōu)選地，所述的融合基因的核酸序列選自:SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的核酸序列。
4.一種表達載體,其包含權利要求1-3中任一項所述的融合基因； 優(yōu)選地，所述的表達載體是由PVAXl制成的； 再優(yōu)選地，所述的表達載體的核酸序列選自SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和SEQ IDNO: 12所示的核酸序列； 進一步優(yōu)選地，所述的表達載體選自質(zhì)粒載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體和細菌載體。
5.一種融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白是由權利要求1-3中任一項所述的融合基因或權利要求4所述的表達載體表達得到的； 優(yōu)選地，所述的融合蛋白的氨基酸序列選自SEQ ID NO: 13, SEQ IDN0:14和SEQ IDNO: 15所示的氨基酸序列。
6.一種用于引起免疫反應或基因治療的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括權利要求4所述的表達載體，優(yōu)選地，所述產(chǎn)品為藥物、試劑或試劑盒；再優(yōu)選地，所述的產(chǎn)品是DNA疫苗。
7.一種制備權利要求6所述的產(chǎn)品的方法,該方法包括將權利要求1-3中任一項所述的融合基因插入到已知的載體中的步驟；優(yōu)選地，所述的載體選自真核表達質(zhì)粒載體和病毒載體，所述真核表達質(zhì)粒載體優(yōu)選選自PVAX1、pcDNA和pVAXl，所述病毒載體優(yōu)選選自腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄病毒、痘苗病毒和流感病毒載體；進一步優(yōu)選地，所述的載體是PVAXI ο
8.—種宿主有機體，其特征在于，該宿主有機體含有權利要求1-3中任一項所述的融合基因或權利要求4所述的表達載體； 優(yōu)選地，所述宿主有機體包括真核生物細胞； 進一步優(yōu)選地，所述宿主有機體是哺乳動物細胞，例如是源于人的細胞； 再進一步優(yōu)選地，所述的宿主有機體為Hela細胞。
9.權利要求1-3中任一項所述的融合基因、權利要求4所述的表達載體、權利要求5所述的融合蛋白或權利要求6所述的產(chǎn)品在制備用于引發(fā)免疫反應的藥物中的用途。
10.權利要求1-3中任一項所述的融合基因、權利要求4所述的表達載體、權利要求5所述的融合蛋白或權利要求6 所述的產(chǎn)品在制備基因治療的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合基因及其應用，具體為包含信號肽編碼序列和目標基因序列的融合基因，包含其的表達載體，該融合基因或其表達載體表達得到的融合蛋白，用于引起免疫反應或基因治療的產(chǎn)品，包含該融合基因的細菌，以及上述的融合基因、表達載體、融合蛋白和產(chǎn)品在制備用于引發(fā)免疫反應或用于基因治療的藥物中的用途。同時本發(fā)明還提供了制備上述產(chǎn)品的方法。本發(fā)明的信號肽融合基因在保持活化產(chǎn)生同等的T細胞免疫應答的同時，能活化產(chǎn)生較高水平的抗體應答，從而提高基因治療或疫苗的效果，從而在蛋白制備以及引發(fā)更高水平的免疫反應方面具有廣泛的用途。
文檔編號A61K48/00GK103160530SQ20131008836
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月19日 優(yōu)先權日2013年3月19日
發(fā)明者徐建青, 黃楊 申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)唯可達生物科技有限公司