專利名稱：Ngr-vegi融合蛋白及其編碼基因與表達(dá)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種NGR-VEGI融合蛋白及其編碼基因與表達(dá)純化方法。
背景技術(shù)：
眾所周知血管形成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的限速步驟，腫瘤生物治療是近年來(lái)發(fā)展的繼手術(shù)、放療、化療之后腫瘤治療方法學(xué)中的又一重要手段。由于腫瘤的生長(zhǎng)、局部浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移均依賴于腫瘤新血管的形成，使得抗血管生成治療成為了腫瘤生物治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。新生血管常高表達(dá)一些在正常血管低表達(dá)甚至無(wú)表達(dá)的分子標(biāo)志，包括av3 3和a 5整合素、氨肽酶N、血管生長(zhǎng)因子受體、基質(zhì)金屬蛋白酶(氨肽酶N屬于基質(zhì)金屬蛋白酶)等。靶向分子的單克隆抗體具有高特異性，但其生產(chǎn)成本較高、長(zhǎng)期使用有誘發(fā)產(chǎn)生抗抗體的風(fēng)險(xiǎn)。其它非抗體類制劑由于靶向性較差，使用劑量偏高，容易誘發(fā)毒副作用。雖然腫瘤血管祀向基序，包括RGD基序和NGR基序等，可以大幅度提聞非抗體類生物制劑的腫瘤靶向性和腫瘤控制率并可在一定程度上減少使用劑量，但其仍存在使用周期長(zhǎng)、不具備直接腫瘤細(xì)胞殺傷作用等缺點(diǎn)。VEGI又稱TNFSF-15，是腫瘤壞死因子家族成員，作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因，重組VEGI能有效抑制內(nèi)皮細(xì)胞增生、血管形成和腫瘤生長(zhǎng)。VEGI對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用表現(xiàn)為可使生長(zhǎng)刺激作用下的G0/G1細(xì)胞阻滯在Gl期，另外可以誘導(dǎo)增生的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。人VEGI基因長(zhǎng)約17kb，由4個(gè)外顯子構(gòu)成，可產(chǎn)生3個(gè)剪接變異體，分別為VEG1-174、VEG1-192和VEG1-251。資料表明VEGI可以通過(guò)高效抑制腫瘤血管形成，達(dá)到有效控制腫瘤演進(jìn)并誘發(fā)腫瘤消退，因此VEGI可以作為一種新的抗血管生成制劑用于惡性腫瘤治療，但是單純VEGI在腫瘤部位富集性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種NGR-VEGI融合蛋白基因。該基因?qū)GR基序的腫瘤血管靶向性和VEGI較強(qiáng)的抗腫瘤血管生成作用結(jié)合在一起，利用柔性接頭連接腫瘤血管靶向基序NGR和VEGI，避免因空間阻礙影響兩個(gè)功能域同時(shí)發(fā)揮作用，提高了 VEGI在腫瘤組織的富集濃度。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種NGR-VEGI融合蛋白基因，其特征在于，其序列(SEQ ID N0.1)如下:
權(quán)利要求
1.一種NGR-VEGI融合蛋白基因，其特征在于，其序列如下:
2.—種NGR-VEGI融合蛋白，其特征在于，其由權(quán)利要求1所述NGR-VEGI融合蛋白基因編碼。
3.—種表達(dá)純化如權(quán)利要求2所述NGR-VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: 步驟一、采用人工方法合成NGR-VEGI融合蛋白基因； 步驟二、構(gòu)建融合蛋白原核表達(dá)載體:將步驟一中所述NGR-VEGI融合蛋白基因克隆至原核表達(dá)載體，構(gòu)建得到融合蛋白原核表達(dá)載體； 步驟三、融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將步驟二中所述融合蛋白原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)； 步驟四、融合蛋白的分離純化:將步驟三中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌裂解后離心，然后將離心后收集的上清液采用鎳柱親和層析進(jìn)行分離純化，得到NGR-VEGI融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟二中所述構(gòu)建融合蛋白原核表達(dá)載體的方法為^fNGR-VEGI融合蛋白基因的5’端融合NdeI酶切位點(diǎn)，3’端融合XhoI酶切位點(diǎn)，進(jìn)行雙酶切，然后裝入PET-28a載體，利用載體上的序列，N端融合His-Tag，構(gòu)建得到融合蛋白原核表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟三中所述融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)采用異丙基-P -D-硫代半乳糖苷作為誘導(dǎo)劑。
6.一種如權(quán)利要求2所述NGR-VEGI融合蛋白作為NGR靶向血管診療用藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種NGR-VEGI融合蛋白基因，其序列見(jiàn)SEQ ID NO.1，還公開了采用該基因編碼的NGR-VEGI融合蛋白以及表達(dá)純化NGR-VEGI融合蛋白的方法，該方法為一、合成NGR-VEGI融合蛋白基因；二、構(gòu)建得到融合蛋白原核表達(dá)載體；三、將融合蛋白原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；四、采用鎳柱親和層析進(jìn)行分離純化，得到NGR-VEGI融合蛋白。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)NGR-VEGI融合蛋白基因，將NGR基序的腫瘤血管靶向性和VEGI較強(qiáng)的抗腫瘤血管生成作用結(jié)合在一起，采用高濃度的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在腫瘤組織的富集濃度。
文檔編號(hào)A61K47/48GK103160531SQ20131009314
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月20日
發(fā)明者汪靜, 楊衛(wèi)東, 馬溫惠, 邵亞輝, 王喆, 康飛, 馬曉偉, 張英起, 薛曉暢 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)