專利名稱：調(diào)節(jié)SIRPα-CD47相互作用以增加造血干細(xì)胞植入和用于此的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)SIRPa -⑶47相互作用以增加造血干細(xì)胞植入以及用于此的化合物。在某些實施方式中，提供分離的SIRPa和⑶47多肽、片段及融合蛋白，用于增強(qiáng)造血干細(xì)胞植入。此外，還提供通過給予上述多肽而增加造血干細(xì)胞植入的方法。
背景技術(shù)：
從骨髓(BM)或G-CSF動員的外周血(PB)中移植人造血干細(xì)胞(HSC)已經(jīng)成為干細(xì)胞生物中最重要的臨床應(yīng)用之一。在患腫瘤性疾病的個體內(nèi)進(jìn)行HSC移植使得可能應(yīng)用高劑量化療方案及隨后的HSC復(fù)蘇來克服由于化療導(dǎo)致的造血失敗，提高血液和非血液腫瘤的治愈率。此外，遺傳疾病如地中海貧血和某些免疫缺陷可通過基因修正HSC的自體移植或通過同種異體HSC移植而治療。一個使HSC移植成功的關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)是將人白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)確定為人主要組織相容性復(fù)合物。盡管供者與宿主之間的HLA不匹配在移植排斥中起主要作用，但移植失敗甚至常常發(fā)生在接受未經(jīng)處理但HLA—致的移植物的患者身上(Thomas, E.D.et al.(1997)Blood 49,511-33 ；Storb, R.et al.(1977)N Engl J Med296,61-6)。該情形中，移植排斥部分與次要組織相容性抗原的不匹配相關(guān)(Gale，R.P.etal.(1981) Blood 57，9-12)。除HLA單倍體之外，尚未表征其他調(diào)節(jié)HSC移植的基因。HSC定位于由成纖維細(xì)胞間質(zhì)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的支持性微環(huán)境壁龕中(Suda，T.et al.(2005)Trends Immunol 26,426-33) 去除 HSC與這種壁龕的相互作用，例如 通過封閉特異性粘附蛋白或趨化因子受體，則阻止HSC植入(Lapidot, T.et al.(2005)Blood 106，1901-10)。此夕卜，自然殺傷(NK)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，為免疫系統(tǒng)的兩種固有組分，已證實可分別在鼠類HSC移植(Murphy，ff.J.et al.(1987) JExp Med 165，1212-7)和人造血干細(xì)胞異種移植(McKenzie，J.L.et al.(2005)Blood 106，1259-61)中發(fā)揮作用。對移植后造血干細(xì)胞植入機(jī)制的深入理解，包括控制調(diào)節(jié)性通路的基因，可最終轉(zhuǎn)化成較好的臨床結(jié)局。非肥胖性糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷NOD.Prdcksc7sc (NOD.SCID)小鼠中的異種移植已經(jīng)成為人HSC移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”試驗。該檢測基于人HSC在靜脈內(nèi)注射后再植這些動物的免疫系統(tǒng)的能力(Hematopoiesis-A Development Approach (ed.Zon,L.1.) 99-118(Oxford University Press, New York, USA,2001)中的 Wang, J.C.Y.etal.“Normal and leukemic human stem cells assayed in immune-deficient mice，，)。啟動人異種移植的細(xì)胞可操作性定義為SCID小鼠再植細(xì)胞(SRC)，擁有屬于HSC的屬性，且不同于體外分析的較成熟的祖細(xì)胞。該系統(tǒng)已使在人HSC區(qū)室內(nèi)進(jìn)行增殖、分化和自我更新屬性的分析成為可能。
信號調(diào)節(jié)蛋白(SIRP)包括細(xì)胞表面糖蛋白家族，其在骨髓(包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、髓系樹突狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞)和神經(jīng)細(xì)胞(在Barclay, A.N.& Brown, M.H.，Nat RevImmunol 6，457-64 (2006)總結(jié)了 ;另參見WO 97/48723)上表達(dá)。SIRP構(gòu)成一個種類多樣的多基因免疫受體家族，涵蓋抑制性(SIRPa)、激動性(SIRP3)、非信號性(SIRPy)和可溶性(SIRPS)成員。⑶47是一種廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白，作為SIRP a的細(xì)胞配體發(fā)揮作用，結(jié)合SIRP a的胞外NH2末端。關(guān)于SIRP a在宿主細(xì)胞被巨噬細(xì)胞所吞噬過程中的抑制性作用，已有清楚的記載。然而，較近期的研究結(jié)果還證實了通過SIRP a結(jié)合介導(dǎo)的其他正向信號傳導(dǎo)作用(Shultz, L.D.et al.(1995) J Immunol 154，180-91)。為了達(dá)到生物學(xué)效果，人們已提出多種途徑來破壞⑶47-SIRP a相互作用。這些途徑涵蓋采用片段型/截短型SIRP a和/或CD47蛋白以及針對二者的抗體(見例如國際專利申請公開號WO 99/40940 ;美國專利申請公開號2003/0026803和2006/0135749 ；以及美國專利號6，913，894)，用于改善免疫功能(見例如，國際專利申請公開案號WO99/40940 ;以及美國專利申請公開案號2003/0026803和2007/0113297)，以及用于異種移植(見例如美國專利申請公開案號2005/0255550和2007/0157328)。目前仍然需要鑒定能夠支持HSC植入以及移植后造血作用的分子。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)SEQ IDNO:1的氨基酸序列；b) —種由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段組成的多肽，其中該片段包含 SEQ ID NO:1 的殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一個；以及c) a)和b)中多肽的一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一個且結(jié)合人 CD47。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成的多肽；b) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段組成的多肽；以及c) a)和b)中多肽的其中一種，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代；其中:i)該多肽中SEQ ID NO:2位點(diǎn)31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一個被 SEQ ID NO:1 的對應(yīng)殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代;或者 ii)該多肽中，SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；以及c) a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長 中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結(jié)合人CD47。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種能夠結(jié)合人Sirp a的多肽以及針對人Sirp a的抗體。優(yōu)選地，該多肽是融合于IgG的Fe部分的人CD47的胞外區(qū)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包含本文所述多肽以及一種藥用載體。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的方法，包括給予該哺乳動物治療有效量的本文所述多肽。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種應(yīng)用本文所述多肽來增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入或者制備用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的藥物的用途。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種本文所述多肽，用于增加哺乳動物體內(nèi)的造血干細(xì)胞植入。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種包含編碼本文所述多肽的序列的分離核酸。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種包含本文所述核酸的表達(dá)載體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供包含本文所述載體的培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種生成多肽的方法，包括在允許該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本文所述細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的方法，包括調(diào)節(jié)人Sirp a與人⑶4之間的相互作用。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirpa胞外區(qū)和人CD47胞外區(qū)中至少一種與至少一種待測化合物相接觸；b)確定所述至少一種待測化合物可結(jié)合于該人Sirp a和人CD47中的至少一種；c)使該待測化合物與間質(zhì)環(huán)境中的人造血細(xì)胞相接觸；以及d)確定在待測化合物存在的情況下，造血干細(xì)胞植入是否增加。根據(jù)另一方面 ，本發(fā)明提供一種測定人體內(nèi)影響造血干細(xì)胞植入的遺傳多態(tài)性的方法，包括a)對來自多個進(jìn)行造血細(xì)胞移植的患者的Sirp a基因進(jìn)行測序；b)測定多個患者Sirp a基因中的核苷酸差異；以及c)將該核苷酸差異與造血干細(xì)胞植入進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以確定相關(guān)多態(tài)性。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種確定受體體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的可能性的方法，包括a)對來自受體的Sirpa基因進(jìn)行測序；以及b)確定該相關(guān)多態(tài)性是否存在。


在下列具體說明中，本發(fā)明優(yōu)選實施方式的這些以及其他特征將變得更加明顯，其中參照了下列附圖，其中:圖1示出了 NOD品系背景中，體內(nèi)及體外的人造血支持。(a)用人BM(上圖；細(xì)胞劑量:RAG-2敲除品系40xl06單核細(xì)胞，SCID和N0D/SCID小鼠20xl06個細(xì)胞)或CB (下圖，每個受體15xl06個細(xì)胞)細(xì)胞移植后4周，從小鼠BM提取的DNA的DNA印跡分析。通過比較樣品泳道與對照人/小鼠DNA混合物中2.7kb a衛(wèi)星條帶(箭頭)的強(qiáng)度，來測定人細(xì)胞植入的水平。(b、c)人Lin-CB細(xì)胞在受照小鼠BM間質(zhì)上的嵌合LTC中產(chǎn)生的CFC數(shù)量。如所指明的，照射后，將來自NOD、NOR、B6、ICR、C3H和BALB/c雄性小鼠的BM細(xì)胞培養(yǎng)5周，隨后以1.1xlO5(b)或0.6-6.0xlO5 (c)個Lin-CB細(xì)胞進(jìn)行接種。培養(yǎng)5周后，收集細(xì)胞并在標(biāo)準(zhǔn)的克隆原細(xì)胞的甲基纖維素試驗中測定CFC總數(shù)。數(shù)據(jù)以3-6次獨(dú)立實驗的平均值示出。圖2示出了 Iddl3基因座的品系特異性差異對體外和體內(nèi)人造血細(xì)胞移植的支持的影響。(a)人 Lin-CB 細(xì)胞在來自 NOD 同類系(NOR.N0D_Idd4、NOR.NOD-1 dd5 NOR.N0D-1dd9、N0R.N0D_Iddl3、)NOR 同類系(NOR.NOD_Iddl3)和 B6.NOD_Iddl3 小鼠的間質(zhì)上的嵌合LTC中CFC的生成情況。如圖1b中所述建立鼠BM間質(zhì)層，并接種0.36-2.0xlO5(C)個人Lin-CB細(xì)胞。培養(yǎng)5周后，收集細(xì)胞，并通過在甲基纖維素試驗中鋪種來測定CFC的數(shù)量。在每一個實驗中，NOD間質(zhì)均用做陽性對照，B6和NOR細(xì)胞均用做陰性對照。將數(shù)據(jù)針對NOD培養(yǎng)中生成的CFC數(shù)量(=100% )進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并以至少3次獨(dú)立培養(yǎng)的均值而示出。BB、Iddl3純合性B6的BM間質(zhì)；NN，Iddl3基因純合性NOD的BM間質(zhì)。(b)用350cGy 照射 8-9 周齡的 NOD.SCID (n = 11)或 NOD.N0R-1ddl3.SCID (n = 8)，并靜脈內(nèi)注射0.37-1.5x10s個Lin-⑶34+細(xì)胞。移植后6_7周，處死小鼠并通過流式細(xì)胞檢測評估受體BM中人⑶45+細(xì)胞的植入情況。圖3示出的是鑒定Iddl3中與支持人造血作用相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域。(a)圖示了 NOD和NOR背景上多種同類系品系中染色體2。候選間隔的基因定位用指向右側(cè)染色體示意圖的條紋線表示。同類系品系的正式命名如下:l.N0D.N0R-D2Jyh443-D2Mit452，2.NOR.N0D-D2Jyh443-D2Jyhl493,3.NOR.BN_D2Jyh443_D2Jyh 1493，4.NOR.N0D_DlNgul46-Rampl/D2Jyh443-D2Jyhll92,5.NOD.N0R-D2Jyh443-D2Gul482,6.NOD.N0R-D2Jyh443-D2Jyh3941,7.NOR.N0D-DlNgul46-Rampl/D2Gull88-D2Jyhl493,8.NOR.BN_D2Jyh767_Flizl。(b)人Lin-CB細(xì)胞在a中所述NOD或NOR Iddl3亞同類系小鼠間質(zhì)上的嵌合LTC中的CFC生成情況。如圖2a進(jìn)行培養(yǎng)及表示數(shù)據(jù)。品系命名如a中所述。圖4示出了 SIRP a的蛋白序列比對。從BM源巨噬細(xì)胞制備的cDNA用做PCR擴(kuò)增NOD和NOR小鼠Sirp a轉(zhuǎn)錄本的模板。B6小鼠序列來自EnsEMBL數(shù)據(jù)庫。蛋白結(jié)構(gòu)域以開放的框表示。圖5示出了來自NOD、NOR和同類系NOR.N0D_Iddl3小鼠品系的BM源性巨噬細(xì)胞中SIRPa的免疫印跡分析。(a)將制 備自BM源性巨噬細(xì)胞(用或不用LPS(100ng/ml)和IFN-gamma(10ng/ml)進(jìn)行處理)的裂解物利用針對SIRP a胞漿結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為上樣對照。(b)將BM源性巨噬細(xì)胞的裂解物在N-糖苷酶F存在或不存在的情況下，于37°C孵育12小時，隨后針對SIRP a胞漿結(jié)構(gòu)域的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析。將N-糖苷酶F處理和未處理的樣品進(jìn)行共電泳。分子量標(biāo)準(zhǔn)以千道爾頓表示(kD)。圖6示出了 Sirpa對鼠巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的人造血作用抑制的調(diào)節(jié)。(a)巨噬細(xì)胞在LTC中介導(dǎo)的人造血作用抑制。將MS-5細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板中(2000個細(xì)胞/孔)。將從NOD、NOR和NOR.N0D_Iddl3雜合小鼠收集的腹腔巨噬細(xì)胞以200-20，000個細(xì)胞/孔的量進(jìn)行接種(每個量重復(fù)5次)，第二天每個孔均加入2000個人Lin-CB細(xì)胞。培養(yǎng)3-4周后，收集細(xì)胞并通過在甲基纖維素試驗中鋪種而測定人CFC數(shù)量。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。(b)示出的是用對照病毒(CEP)或表達(dá)NOD源性Sirp a的病毒(SIRP)感染前后，Jurkat細(xì)胞和NOR BM源性巨噬細(xì)胞中SIRP a表達(dá)的蛋白印跡分析。蛋白裂解物用針對SIRP a的多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡。泳道I Jurkat細(xì)胞；泳道2:感染CEP的Jurkat細(xì)胞；泳道3:感染SIRP的Jurkat細(xì)胞；泳道4:N0R巨噬細(xì)胞；泳道5:感染SIRP的NOR巨噬細(xì)胞；泳道6:N0D巨噬細(xì)胞。感染SIRP慢病毒引起NOD巨噬細(xì)胞中NOD SIRP a的高水平表達(dá)(泳道5)。(c)Sirpa對巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的人造血作用抑制的影響。NOR BM源性巨噬細(xì)胞用對照(NOR-CEP)慢病毒或表達(dá)NOD源性Sirp a基因的慢病毒(N0R-N0D SIRP)感染，然后以20-20，000個細(xì)胞/孔的量接種于已建立的MS-5間質(zhì)培養(yǎng)基上(每個量重復(fù)5次)。如上所述，第二天每個孔加入2000個Lin-CB細(xì)胞，3.5周后，測定培養(yǎng)物中得到的人CFC0 NOR-NOD SIRP孔中人造血作用的支持顯著優(yōu)于NOR-CEP孔(20個細(xì)胞/孔時，P =
0.032 ;2000-20，000個細(xì)胞/孔時，P = 0.008)。誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。圖7示出了 NOD SIRP a使與人⑶47的種屬交叉反應(yīng)性增加。(a_d)人CD47(hCD47)與來自NOD和NOD.N0R_Iddl3同類系小鼠的BM源性巨噬細(xì)胞上的鼠SIRPa結(jié)合的流式細(xì)胞分析。(a)⑶Ilb表達(dá)的直方圖；水平棒表示⑶Ilb+門。圖b至d中的圖均以⑶Ilb進(jìn)行門控。(b) 二維等高線圖，示出了 SIRPa和h⑶47-Fc染色。(c)相比于同型對照(黑色)，SIRP a表達(dá)的直方圖(灰色)。(d)h⑶47-Fc染色(灰色)與人IgG-Fc對照(黑色)疊加的直方圖。(e)鼠SIRP a與h⑶47-Fc的免疫沉淀。將來自N0D、N0R和NOD.N0R-1ddl3同類系小鼠的BM源性巨噬細(xì)胞的蛋白提取物在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，并用多克隆抗SIRPa抗體進(jìn)行免疫印跡。每一個圖均展示了總裂解物、與對照人IgG-Fc蛋白的免疫沉淀物(IP hFc)以及與h⑶47-Fc融合蛋白的免疫沉淀物(IP h⑶47-Fc)。上圖比較的是NOD和NOR提取物，下圖比較的是NOD和NOD.N0R-1ddl3 (Iddl3cg)提取物。圖8示出了鼠和人SIRPa IgV結(jié)構(gòu)域的蛋白序列比對。(a)從BM巨噬細(xì)胞制備的cDNA 用做 PCR 擴(kuò)增 NOD 和 NOR 小鼠 Sirp a 轉(zhuǎn)錄本的模板。C57BL/6 (B6) ,BALB/c 和 129/Sv序列從EnsEMBL和NCBI數(shù)據(jù)庫獲得。開放框代表SIRP a的X線結(jié)晶結(jié)構(gòu)中鑒定的b_折疊片層，對應(yīng)Ig重鏈可變區(qū)中的類似區(qū)域。小鼠品系之間不同的氨基酸以陰影表示。B6用做母本序列。(b)包含IgV結(jié)構(gòu)域的SIRP a的外顯子3從人HapMap第一階段發(fā)布的37個個體基因組DNA擴(kuò)增而來。開放框區(qū)域和陰影氨基酸表示與(a)中相同的特征，Vl用做母本序列。種屬之間正向同源位置標(biāo)記*的殘基在NOD與其他品系以及與人之間呈多態(tài)性。標(biāo)記+的殘基在人類呈多態(tài)性，且定位于該蛋白“頂端”暴露于溶劑的表面上，預(yù)測CD47在該位置結(jié)合。圖9示出了通過對從所示出人HapMap樣品中每一個(表格的左側(cè))PCR擴(kuò)增而來的SIRP a IgV結(jié)構(gòu)域進(jìn)·行獨(dú)立測序來驗證三種SNP分析的區(qū)分能力。圖10示出了⑶47蛋白，包含胞外IgV樣環(huán)、5個跨膜區(qū)和較短的胞漿尾巴。圖11示出了(a) —個直方圖，描繪通過用不同質(zhì)粒骨架(paDNA和pIAP369)制備的mCD47-Fc和兩個h⑶47_Fc構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞上清中蛋白生成情況，以及(b) —個SDS-PAGE免疫印跡，描繪的是從培養(yǎng)上清中純化后的融合蛋白。圖12示出了(a)將Kozak序列引入包含mCD47_Fc的pIAP369質(zhì)粒構(gòu)建體中以及(b)插入pIAP369質(zhì)粒中的序列hCD47-Fc，展示了 Kozak共有序列、hCD47片段、連接段和Fe。圖13示出了(a)用含Kozak的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中測定的小鼠和人⑶47_Fc生成情況以及(b)展示抗人Fe抗體與蛋白G純化的⑶47-Fc蛋白發(fā)生反應(yīng)的免疫印跡。圖14示出了一個試驗，設(shè)計用來量化h⑶47-Fc和mCD47_Fc (未示出)與NOD和NOR小鼠SIRP a的親和性。圖15 示出了(a)mCD47 與 NOD 和 NOR SIRP a 結(jié)合的結(jié)果，以及(b)hCD47 與 NOD和NOR SIRPa結(jié)合的結(jié)果。圖16是一個展不SIRPa -CD47介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的不意圖。
圖17示出了制備人HSC“容許”的截短型NOD SIRPa (“NOD-A-Cyto”)(左側(cè))。圖18示出了利用感染了“空”慢病毒的NOR巨噬細(xì)胞(N0R-CEP“菱形”)、未感染病毒的NOD巨噬細(xì)胞(NOD uninf ;填充三角形)、感染“空”慢病毒的NOD巨噬細(xì)胞(N0D-CEP ；圓圈)、感染含全長NOD SIRP a的慢病毒的NOR巨噬細(xì)胞(N0R-SIRP ;方形)以及感染含截短型NOD SIRP a的慢病毒的NOR巨噬細(xì)胞(NOD- A -cyto ;開放三角形)的人HSC存活情況。圖19示出了一個研究的示意圖，用來評估體內(nèi)CD47融合蛋白對HSC植入的影響。圖20示出了一個研究的示意圖，其中，用SIRPa的蛋白或小分子激動劑處理可促進(jìn)臨床移植情形中人HSC植入。
具體實施例方式以下說明書中列出了許多具體細(xì)節(jié)，以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，應(yīng)該理解，無需這些具體細(xì)節(jié)即可實施本發(fā)明。如本文中使用的，“保守性氨基酸取代”指根據(jù)某些共同屬性對氨基酸進(jìn)行分組。一種確定單個氨基酸之間共同屬性的功能性途徑是分析同源生物的對應(yīng)蛋白之間氨基酸變化的歸一化頻率(Schulz, G.E.and R.H.Schirmer., Principles and Structure,Springer-Verlag)。根據(jù)這些分析,可確定氨基酸分組,其中同一組內(nèi)氨基酸可彼此優(yōu)先互換，且因此在對整體蛋白結(jié)構(gòu)的影響方面彼此最為相似(Schulz,G.E.and R.H.Schirmer.,Principles and Structure, Springer-Verlag)。以該方式進(jìn)行氨基酸分組的實例包括:(i)帶電組，由 Glu 和 Asp、Lys、Arg 和 His 組成,(ii)帶正電 組，由Lys、Arg和His組成，(iii)帶負(fù)電組，由Glu和Asp組成，(iv)芳香組，由 Phe、Tyr 和 Trp 組成，(V)氮環(huán)組，由His和Trp組成，(vi)較大的脂肪族非極性組，由Val、Leu和Ile組成。(vii)輕微極性組，由Met和Cys組成，(viii)小殘基組，由 Ser、Thr、Asp、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 組成，(ix)脂肪族組，由Val、Leu、lie、Met和Cys組成，以及(X)小輕基組，由Ser和Thr組成。除了上面展示的組，每一種氨基酸殘基還可形成其自己的組，由單個氨基酸形成的組可簡單地由該氨基酸在本領(lǐng)域中通常使用的一個和/或三個字母縮略詞表示。如本文中使用的，“培養(yǎng)細(xì)胞”表示一種已在體外維持和/或繁殖的細(xì)胞。培養(yǎng)細(xì)胞包括原代培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞系。如本文中使用的，“培養(yǎng)所述細(xì)胞”表示提供有助于多肽表達(dá)的培養(yǎng)條件。這些培養(yǎng)條件在本領(lǐng)域中為人熟知。如本文中使用的，“植入”干細(xì)胞特別是已擴(kuò)增的造血干細(xì)胞，表示將該干細(xì)胞置入動物體內(nèi)，例如通過注射，其中該干細(xì)胞在體內(nèi)持續(xù)存在。這一點(diǎn)可通過造血干細(xì)胞如促進(jìn)正在進(jìn)行的血細(xì)胞形成的能力而簡單測定。如本文中使用的，提到多肽或多核苷酸時，“片段”表示僅由該參照序列的完整多肽序列和結(jié)構(gòu)(或核苷酸序列和結(jié)構(gòu))的一部分構(gòu)成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括該天然多肽的C末端缺失和/或N末端缺失，或者可由該分子的一個內(nèi)在部分衍生而來。類似的，多核苷酸片段可包括該天然多核苷酸的3’和/或5’缺失，或者可由該分子的一個內(nèi)在部分衍生而來。如本文中使用的，“融合蛋白”指一種復(fù)合多肽，即一種單一的連續(xù)性氨基酸序列，由兩個(或多個)獨(dú)立的異源性多肽構(gòu)成，而這兩個多肽在平常情況下并非融合于一個單一的氨基酸序列內(nèi)。因此，融合蛋白包括的單一氨基酸序列可包含兩個完全不同的氨基酸序列或兩個相似或相同的多肽序列，只要這些序列并非存在于天然的單一氨基酸序列的同一構(gòu)象中。融合蛋白通?？衫弥亟M核酸法即通過重組基因融合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄和翻譯而制備，該融合包括一個編碼本發(fā)明所述多肽的節(jié)段以及一個編碼異源性多肽的節(jié)段，或者通過本領(lǐng)域中熟知的化學(xué)合成法而制備。在融合蛋白的組成多肽之間，可包含一個連接多肽。術(shù)語“融合構(gòu)建體”或“融合蛋白構(gòu)建體”通常表示編碼融合蛋白的多核苷酸。在一個實施方式中，融合蛋白是本文所述多肽融合于Ig分子的一部分。融合蛋白的Ig部分可包括免疫球蛋白的恒定區(qū)，例如人c y I結(jié)構(gòu)域或C Y 4結(jié)構(gòu)域(例如人Ig C Y I或Ig Cy4的鉸鏈區(qū)、CH2 和 CH3 區(qū))(見例如，Capon et al.，U.S.Pat.N0.5，116，964 ；5, 580，756 ；5, 844，095等)。在一個優(yōu)選實施方式中，Ig融合蛋白包括本文所述與免疫球蛋白的恒定區(qū)(例如，F(xiàn)e部分)結(jié)合的多肽。如本文中使用的，“造血干細(xì)胞”指骨髓、肝、脾或臍血來源能夠發(fā)育成任何成熟骨髓和/或淋巴細(xì)胞的細(xì)胞。如本文中使用的，提到核酸分子、多肽或其他生物分子時，“分離的”表示該核酸或多肽已從獲得該多肽或核酸的遺傳環(huán)境中分離出來，還可以表示與天然狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生改變。例如，天然存在于活體 動物內(nèi)的多核苷酸或多肽不是“分離的”，但從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)中分離出來的相同多核苷酸或多肽則是“分離的”，如該術(shù)語在本文中所應(yīng)用的。因此，重組宿主細(xì)胞內(nèi)生成和/或包含的多肽或多核苷酸可認(rèn)為是分離的。還可認(rèn)為“分離的多肽”或“分離的核酸分子”是已從重組宿主細(xì)胞或天然來源部分或幾乎全部純化的多肽或核酸分子。還可認(rèn)為本發(fā)明所述肽可表現(xiàn)出調(diào)節(jié)生物學(xué)如細(xì)胞內(nèi)事件的能力。如本文中使用的，“調(diào)節(jié)”指對感興趣生物學(xué)過程的刺激性或抑制性效應(yīng)，相對于本發(fā)明所述肽不存在時該過程的水平或活性。如本文中使用的，術(shù)語“巨噬細(xì)胞抑制”或“抑制巨噬細(xì)胞”指減小或阻止巨噬細(xì)胞作用、活性和/或效應(yīng)。如本文中使用的，“核酸分子”表不DNA分子(例如，cDNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及例如通過采用核苷酸類似物生成的DNA或RNA類似物。核酸分子可以為寡核苷酸或多核苷酸，可為單鏈或雙鏈。如本文中使用的，“可操作性連接”指元件的排布，其中如此描述的元件經(jīng)配置可發(fā)揮其通常功能。因此，可操作性連接于編碼序列的控制元件能夠?qū)崿F(xiàn)該編碼序列的表達(dá)。該控制元件無需與編碼序列相鄰，只要其能夠發(fā)揮作用指導(dǎo)其表達(dá)即可。因此，例如，可在啟動子和編碼序列之間干擾未翻譯但已轉(zhuǎn)錄的序列，啟動子仍然可以認(rèn)為是“可操作性連接于”編碼序列。類似地，“與患者體內(nèi)表達(dá)相容的控制元件”是那些能夠?qū)崿F(xiàn)該患者體內(nèi)編碼序列表達(dá)的元件。如本文中使用的，“藥用載體”表示任何以及所有溶劑、分散媒介、涂層、抗細(xì)菌和抗真菌試劑、等張和吸收延緩試劑以及可生理性相容的試劑等。藥用載體的實例包括水、鹽、磷酸緩沖鹽、葡聚糖、甘油、乙醇等中的一種或多種及其組合。在多種情況下，優(yōu)選該組合物中包括等張試劑例如糖類、多醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥用載體可進(jìn)一步包括輔料如濕化或乳化劑、防腐劑或緩沖液，這將增強(qiáng)該藥學(xué)試劑的保存期或有效性。如本文中使用的，“多肽”和“蛋白”可互換使用，表示蛋白、蛋白片段、修飾的蛋白、氨基酸序列及合成的氨基酸序列。所述多肽可為糖基化或非糖基化。如本文中使用的，“間質(zhì)”指器官的支持組織或基質(zhì)，可與該器官或?qū)嵸|(zhì)的功能元件區(qū)分開。如本文中使用的，“治療有效量”指在某些劑量和必需的特定時間段時對獲得預(yù)期治療結(jié)局有效的量。藥理學(xué)試劑的治療有效量可隨諸如疾病狀態(tài)、年齡、性別和患者體重以及該藥理學(xué)試劑消除個體內(nèi)預(yù)期反應(yīng)的能力等因素而不同。治療有效量還可指一個量，其中該藥理學(xué)試劑的治療的有益效果超過任何毒性或有害效應(yīng)。根據(jù)一個方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)SEQ IDNO:1的氨基酸序列；b) —種由SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段組成的多肽，其中該片段包含 SEQ ID NO:1 的殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126中的至少一個；以及c) a)和b)中多肽的其中一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽包含SEQ ID N0:1的殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 中的至少一個且結(jié)合人CD47。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成的多肽；b) —種由SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段組成的多肽；以及c)a)和 b)中多肽的其中一種，其中，在該多肽全長中，每7個氨基酸中包含至多一個氨基酸插入、缺失或取代；其中:i)該多肽中SEQ ID NO:2的位點(diǎn)31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一個被 SEQ ID NO:I 的對應(yīng)殘基31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 取代；或者ii)該多肽中，SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組:a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO:4-13組成的組；以及c) a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結(jié)合人CD47。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種能夠結(jié)合人Sirp a的多肽以及針對人Sirp a的抗體。優(yōu)選地，該多肽是融合于IgG的Fe部分的人CD47的胞外區(qū)。在某些實施方式中，該多肽是所述片段，且在SEQ ID NO:1內(nèi)的殘基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 之間，SEQ ID NO:2 內(nèi)的殘基50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143之間，在 SEQ ID NO:4、7、
8、9 和 12 中任何一種的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 之間；或者 SEQ ID NO:5、6、10、11 和 13 中的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77_83、88-99或102-115之間的區(qū)域內(nèi)包含至少3個連續(xù)的氨基酸。在某些實施方式中，所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。在一個優(yōu)選實施方式中，該多肽結(jié)合人⑶47。在一個優(yōu)選實施方式中，該多肽結(jié)合人Sirp a。在某些實施方式中，該多肽是所述片段，且按照優(yōu)先度逐漸增加的順序，長度在6-30個氨基酸之間、在8-28個氨基酸之間、在10-26個氨基酸之間、在12-24個氨基酸之間以及在14-22個氨基酸之間。本文所述多肽可融合于第二種多肽，其優(yōu)選為IgG的Fe部分。根據(jù)一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明提供一種多肽，其包含的⑶47胞外區(qū)融合于IgG的Fe部分，優(yōu)選用于增加人體內(nèi)的造血干細(xì)胞植入。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種藥學(xué)組合物，包含本文所述多肽以及一種藥學(xué)可接受的載體。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的方法，包括給予該哺乳動物治療有效量的本文所述多肽。優(yōu)選地，造血干細(xì)胞植入的增加是由于巨噬細(xì)胞的抑制。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供本文所述多肽在用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入或用于制備用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的藥物中的應(yīng)用。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種本文所述多肽，用于增加哺乳動物體內(nèi)的造血干細(xì)胞植入。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種分離的核酸，包含一個編碼本文所述多肽的序列。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種包含本文所述核酸優(yōu)選包含Kozak共有序列的表達(dá)載體。 根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種包含本文所述載體的培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種生成多肽的方法，包括在適于該多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)本文所述細(xì)胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種用于增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的方法，包括調(diào)節(jié)人Sirp a與人⑶47之間的相互作用。優(yōu)選地，其中人Sirpa與人⑶47之間的相互作用通過給予至少一種治療有效量的下列物質(zhì)加以調(diào)節(jié):a) —種能夠結(jié)合于人Sirp a胞外區(qū)的多肽；b)針對人Sirp a的抗體c) 一種能夠結(jié)合于人CD47胞外區(qū)的多肽；以及d)針對人⑶47的抗體。因此，本發(fā)明還提供了前述多肽或方法用于增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入或用于制備增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的藥物的應(yīng)用。優(yōu)選地，造血干細(xì)胞植入的增加是由于巨噬細(xì)胞的抑制。在一個實施方式中，能夠結(jié)合于人Sirp a胞外區(qū)的多肽包括可溶性人⑶47或其片段，優(yōu)選CD47的胞外區(qū)。優(yōu)選地，該可溶性人CD47或其片段融合于第二種蛋白。在另一個實施方式中，能夠結(jié)合于人CD47胞外區(qū)的多肽包括可溶性人Sirp a或其片段，優(yōu)選Sirpa的胞外區(qū)。優(yōu)選地，該可溶性人Sirp a或其片段融合于第二種蛋白。在優(yōu)選實施方式中，所述第二種蛋白是IgG的Fe部分。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種鑒定可增加人體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的化合物的方法，包括a)使人Sirp a和人CD47胞外區(qū)中至少一種與至少一種待測化合物接觸；b)確定所述至少一種待測化合物可結(jié)合于人Sirp a和人CD47中至少一種；c)使該待測化合物與間質(zhì)環(huán)境中的人造血細(xì)胞相接觸；以及d)確定在待測化合物存在的情況下，造血干細(xì)胞植入是否增加。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種測定人體內(nèi)影響造血干細(xì)胞植入的遺傳多態(tài)性的方法，包括a)對來自多個進(jìn)行造血細(xì)胞移植的患者的Sirp a基因進(jìn)行測序；b)測定來自多個患者的Sirpa基因中的核苷酸差異；以及c)將該核苷酸差異與造血干細(xì)胞植入進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以確定相關(guān)多態(tài)性。優(yōu)選地，該核苷酸差異引起氨基酸差異。根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種確定受體體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的可能性的方法，包括a)對來自受體的Sirpa基因進(jìn)行測序；以及b)確定該相關(guān)多態(tài)性是否存在。優(yōu)選地，該相關(guān)多態(tài)性引起的氨基酸差異優(yōu)選為下列其中至少一個:(a) SEQ IDNO:2 位點(diǎn) 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 處殘基的至少一種被 SEQ ID NO:1 的對應(yīng)殘基 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126取代；或者ii)SEQ ID NO:2的殘基129和130中的至少一個缺失。本發(fā)明的優(yōu)勢將進(jìn)一步通過下列實施例加以闡述。本文中列出的這些實施例以及其特殊細(xì)節(jié)僅為了說明而不應(yīng)理解為對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。實施例材料&方法小鼠將CB17-scid/scid (SCID)、N0D/LtSz-Prdkcsc/sc (NOD.SCID) (Shultz, L.D.etal.(1995) J Immunol 154，180-91)、C57BL/6 (B6)、C3H、ICR 和 BALB/C 小鼠在無菌條件下飼養(yǎng)并保管于Ontario腫瘤中心(多倫多，加拿大)。Ragf^(RAGj)、RAG_2.Prf+和RAG-2.3碑+小鼠，均為 B6 背景，從 GenPharm International (Mountain View，CA)獲得。NOD、NOD.SCID,NOD.N0R_Iddl3、N0D.N0R_Idd4、N0D.N0R_Idd5、N0D.N0R_Idd9、N0R.N0D_Iddl3 和B6.N0D-1ddl3小鼠在病童醫(yī)院(多倫多,加拿大)于無特異性病原體或屏障條件下供養(yǎng)。所有的同類系小鼠均通過育種者的標(biāo)記物指導(dǎo)性選擇從NOD/Jsd與N0R/Lt祖先原始雜交而生成。按照家系，NOD與NOR基因組約88%—致，其基因組中的差異位點(diǎn)分布在染色體1、2、4、5、7、10、11、12、14和18上。育種者用微衛(wèi)星標(biāo)志物篩查所有可區(qū)分NOD與NOR的遺傳基因座，因此所有同類系的親本的背景等位基因均是純合性的。本研究中用來定義同類系小鼠的微衛(wèi)星標(biāo)志物列于表I中。表1.用來定位同類系小鼠的微衛(wèi)星標(biāo)志物。

權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組: a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQID NO:4-13組成的組； b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQID NO:4-13組成的組；以及 c)a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結(jié)合人CD47。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且在SEQID NO:4,7,8,9 和 12 的任何一個內(nèi)的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116之間區(qū)域或者在 SEQ ID NO:5、6、10、11 和 13 內(nèi)的殘基 24-31、37-45、48-54、62-66、69_74、77-83,88-99或102-115之間區(qū)域中至少一個內(nèi)包含至少3個連續(xù)的氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的多肽，其中所述氨基酸插入、缺失或取代是保守性氨基酸取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的多肽，沒有氨基酸的插入、缺失或取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的多肽，其中所述多肽結(jié)合人CD47。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的多肽，其中所述多肽是所述片段，并且長度在6到30個氨基酸之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述片段的長度在8到28個氨基酸之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述片段的長度在10到26個氨基酸之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述片段的長度在12到24個氨基酸之間。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽，其中所述片段的長度在14到22個氨基酸之間。
11.一種多肽，包含權(quán)利要求1-10中任一項所述的多肽融合于第二種多肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述第二種蛋白是IgG的Fe部分。
13.一種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽以及一種藥用載體。
14.權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽在制備用于增加哺乳動物體內(nèi)造血干細(xì)胞植入的藥物中的應(yīng)用。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的多肽，用于增加哺乳動物體內(nèi)的造血干細(xì)胞植入。
16.—種分離的核酸,包含編碼權(quán)利要求1-12中任一項所述多肽的序列。
17.—種表達(dá)載體，包含可操作性地連接于表達(dá)控制序列的權(quán)利要求16所述的核酸。
18.—種培養(yǎng)細(xì)胞，包含權(quán)利要求17所述的載體。
19.一種生產(chǎn)多肽的方法,包括在適于所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)SIRPα-CD47相互作用以增加造血干細(xì)胞植入和用于此的化合物。在某些實施方式中，提供分離的SIRPα和CD47多肽、片段及融合蛋白，用于增強(qiáng)造血干細(xì)胞植入。此外，還提供通過給予上述多肽而增加造血干細(xì)胞植入的方法。本發(fā)明的一種分離的多肽，選自由下列多肽組成的組a)由一種氨基酸序列組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO4-13組成的組；b)由一種氨基酸序列的片段組成的多肽，所述氨基酸序列選自由SEQ ID NO4-13組成的組；以及c)a)和b)中所述多肽的一種，其中，在所述多肽的全長中，每7個氨基酸中有至多一個氨基酸插入、缺失或取代，其中所述多肽結(jié)合人CD47。
文檔編號A61P7/00GK103242444SQ20131010295
公開日2013年8月14日 申請日期2008年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月11日
發(fā)明者杰恩·丹斯卡, 約翰·E·迪克, 塔蒂亞娜·普拉索拉瓦, 竹中克人 申請人:大學(xué)健康網(wǎng)絡(luò), 多倫多兒童醫(yī)院