三元納米復(fù)合藥物、其制備方法和其用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種三元納米復(fù)合藥物、其制備方法和其用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。該三元納米復(fù)合藥物包含核心載體、藥物活性成分和用于包裹所述核心載體與藥物活性成分的穩(wěn)定劑。該核心載體包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于第一納米粒子的復(fù)合納米粒子或其組合；該藥物活性成分負(fù)載于所述核心載體上；該穩(wěn)定劑包括親水性聚合物、表面含有羥基或羧基的脂質(zhì)體、牛血清白蛋白納米球、人血清白蛋白納米球，或其組合。本發(fā)明還涉及不含穩(wěn)定劑的二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。本發(fā)明可實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療。
【專利說明】三元納米復(fù)合藥物、其制備方法和其用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種納米復(fù)合藥物，特別是涉及一種三元納米復(fù)合藥物、其制備方法、其于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。本發(fā)明還涉及該三元納米復(fù)合藥物與二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。本發(fā)明可實現(xiàn)化學(xué)藥物與超聲波協(xié)同治療惡性腫瘤，特別是多藥耐藥腫瘤的治療。
【背景技術(shù)】
[0002]化療是臨床治療惡性腫瘤的主要方法。然而，化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有不同程度的損傷，破壞人體的免疫系統(tǒng)，影響患者的生存質(zhì)量。嚴(yán)重的化療副作用會導(dǎo)致腫瘤患者免疫力低下、身體衰弱，是化療無法繼續(xù)進行的主要原因之一。困擾化療治療腫瘤的另一瓶頸是腫瘤細胞的多藥耐藥性。耐藥腫瘤細胞是由化療藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的、能耐受多種化療藥物的一種突變惡性腫瘤細胞。統(tǒng)計表明，在腫瘤化療中，超過90%的患者死亡與腫瘤多藥耐藥相關(guān)。因此，在降低化療藥物副作用的同時，克服腫瘤的多藥耐藥性，對癌癥的治療具有重要意義。
[0003]T12是一種寬禁帶η型半導(dǎo)體材料，其銳態(tài)礦型帶隙能為3.2eV，相當(dāng)于波長為387nm的光子能量。當(dāng)T12受到能量大于或等于帶隙能的光線或福射激發(fā)后,會在價帶和導(dǎo)帶上分別產(chǎn)生強氧化性的光生空穴(h+)和強還原性的光生電子(e_)。當(dāng)處于水溶液中的T12受到激發(fā)后，會產(chǎn)生反應(yīng)活性很高的氫氧自由基和活性氧類分子等自由基。上述自由基能夠破壞生物組織，導(dǎo)致細胞的死亡。因此，納米T12已被廣泛應(yīng)用于腫瘤細胞的光動力治療研究領(lǐng)域。然而，通常T12需要紫外線或更短波長的射線來激發(fā)，這極大地限制了T12光動力治療腫瘤的實際應(yīng)用。為了克服激發(fā)源的困擾，日本學(xué)者金平幸輝等人提出采用超聲波激發(fā)納米T12治療腫瘤。其機理在于，超聲波穿透能力強，可引起組織機械振動和溫?zé)嵝?yīng)，從而引發(fā)組織產(chǎn)生OH1、OH、H2O2、O等活性自由基(ROS )，破壞腫瘤細胞結(jié)構(gòu)(授權(quán)國家:中國，公布日期:2009年I月14日，專利號:200680049369.5.專利名稱:超聲波癌治療促進劑和殺細胞劑)。
[0004]在腫瘤化療藥物輸送方面的研究顯示，以納米粒子為載體的藥物輸送體系與腫瘤細胞接觸后，細胞膜發(fā)生內(nèi)陷并將納米粒子載藥體系包裹形成內(nèi)涵體，從而進入細胞內(nèi)。這個過程能夠避免細胞膜表面的P-糖蛋白所介導(dǎo)的藥物外排作用，從而克服腫瘤細胞的多藥耐藥。基于以上機理，一些生物相容性好、毒性低、比表面積大的無機納米材料，如Fe304、Si02、Ti02、Zn0等已被廣泛地用于耐藥腫瘤細胞的藥物輸送，并取得了良好的研究進展。以納米粒子為載體的藥物輸送體系雖然利用細胞膜內(nèi)吞作用巧妙地避免了 P-糖蛋白對藥物的外排，但是耐藥腫瘤細胞的耐藥分子機制依然存在，藥物在內(nèi)涵體內(nèi)被釋放后，P-糖蛋白依然可將與其臨近的藥物排到細胞外。因此，絕大多數(shù)基于納米粒子的藥物輸送體系只能在一定程度上逆轉(zhuǎn)多藥耐藥現(xiàn)象，但不能完全克服腫瘤細胞的多藥耐藥性。由于半導(dǎo)體材料良好的光電效應(yīng)，以低毒納米半導(dǎo)體材料為載體的藥物輸送與載體材料本身具備的光動力治療能力相結(jié)合，發(fā)展出了耐藥腫瘤細胞的多模式治療。東南大學(xué)王雪梅教授課題組在多模式治療耐藥腫瘤細胞方面取得了重要的研究進展。他們將阿霉素(Doxorubicin，簡稱DOX)裝載于ZnO納米粒子上構(gòu)建藥物輸送體系，利用紫外線激發(fā)ZnO產(chǎn)生R0S，實現(xiàn)了光動力治療與化療相結(jié)合的耐藥腫瘤細胞的雙模式治療(H.Zhang, B.Chen, H.Jiang, C.L.Wang, H.Wang, X.M.Wang.B1materials, 2011，32:1906-1914.)。然而，如前所述，以紫外線為激發(fā)源將限制半導(dǎo)體材料光動力治療的應(yīng)用。
[0005]因此，存在需求來解決腫瘤治療過程中化療藥物的副作用以及腫瘤細胞的多藥耐藥現(xiàn)象，以及解決半導(dǎo)體材料光動力治療的激發(fā)源受限的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是解決半導(dǎo)體材料光動力治療的激發(fā)源受限的問題，并解決腫瘤治療過程中化療藥物副作用與腫瘤細胞多藥耐藥現(xiàn)象。
[0007]本發(fā)明的第一方面提供一種三元納米復(fù)合藥物，其包含:
[0008]核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合；
[0009]藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上；和
[0010]用于包裹所述核心載體與藥物活性成分的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括親水性聚合物、表面含有羥基或羧基的脂質(zhì)體、牛血清白蛋白納米球(簡稱BSA)、人血清白蛋白納米球，或其組合。
[0011]另一優(yōu)選例中，所述第一納米粒子包含T12和/或ZrO2。
[0012]另一優(yōu)選例中，以重量為基準(zhǔn)，所述核心載體、藥物活性成分和穩(wěn)定劑的含量比為1:0.01:0.4至1:0.5:1。較佳地，該核心載體、藥物和穩(wěn)定劑的含量比為1:0.01:0.5至I:0.5:lo 更佳地為 I:0.01:0.5 至 I:0.1:0.8。
[0013]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合藥物的粒徑為10至200納米。更佳地為50至150納米。
[0014]另一優(yōu)選例中，該醫(yī)學(xué)成像信號包括T1加權(quán)的磁共振成像信號、T2加權(quán)的磁共振成像信號、電子計算機X射線斷層掃描信號、近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號，或其組合。
[0015]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合納米粒子包含所述第一納米粒子，與選自Gd203、Fe304、ZnFe2O4, NiFe2O4, Au、NaYF4:Er3+/Yb3\ NaYF4: Yb3+/Tm3\ NaYF4: Tm3+/Er3+ 和 NaYF4: Yb3+/Tm37Er3+中的一種或多種。
[0016]另一優(yōu)選例中，該親水性聚合物包括非離子型聚合物、陽離子型聚合物、含羧基聚合物，或其組合。
[0017]另一優(yōu)選例中，該親水性聚合物包含聚乙二醇(簡稱PEG)、葡聚糖、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酸，或其組合。
[0018]另一優(yōu)選例中，該藥物活性成分包含抗腫瘤藥物。
[0019]另一優(yōu)選例中，該抗腫瘤藥物包含蒽環(huán)類抗腫瘤藥物和/或紫杉醇。
[0020]另一優(yōu)選例中，該抗腫瘤藥物包含阿霉素和/或紫杉醇。
[0021 ] 另一優(yōu)選例中，該復(fù)合藥物還包括用于靶向腫瘤的含有配體分子的表面修飾層。
[0022]另一優(yōu)選例中，該配體分子是通過酰胺鍵(-C0-NH-)連接到該穩(wěn)定劑的表面。
[0023]另一優(yōu)選例中，該配體分子為葉酸、葉酸衍生物、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、腫瘤特異性抗體，或其組合。優(yōu)選為葉酸。
[0024]本發(fā)明的第二方面提供一種制備上述本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物的方法，其包含以下步驟:
[0025](a)將所述核心載體分散于水中，從而形成核心載體分散液；
[0026](b)混合所述核心載體分散液與所述藥物活性成分，從而形成二元水溶膠；和
[0027](C)混合所述二元水溶膠與含所述穩(wěn)定劑的溶液，從而形成所述三元納米復(fù)合藥物。
[0028]另一優(yōu)選例中，該方法還包含步驟(d)，其用于先活化步驟(C)得到的三元納米復(fù)合藥物，和使用含有配體分子的溶液對所述活化后的三元納米復(fù)合藥物進行表面修飾，從而獲得包括表面修飾層的三元納米復(fù)合藥物，所述表面修飾層含有配體分子。
[0029]本發(fā)明的第三方面提供一種如前述的三元納米復(fù)合藥物用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
[0030]另一優(yōu)選例中，該三元納米復(fù)合藥物是用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
[0031]本發(fā)明的第四方面提供一種超聲波治療系統(tǒng)，其包含用于發(fā)射超聲波的裝置，和如前述的三元納米復(fù)合藥物。
[0032]本發(fā)明的第五方面提供一種二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途，所述二元納米復(fù)合藥物包含:
[0033]核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合；和
[0034]藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上。
[0035]另一優(yōu)選例中，該第一納米粒子包含T12和/或ZrO2。
[0036]另一優(yōu)選例中，以重量為基準(zhǔn)，所述核心載體與藥物活性成分的含量比為1:0.01至1:0.5。更佳地為1:0.01至1:0.1。
[0037]另一優(yōu)選例中，該醫(yī)學(xué)成像信號包括T1加權(quán)的磁共振成像信號、T2加權(quán)的磁共振成像信號、電子計算機X射線斷層掃描信號、近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號，或其組合。
[0038]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合納米粒子包含所述第一納米粒子，與選自Gd203、Fe304、ZnFe2O4, NiFe2O4, Au、NaYF4:Er3+/Yb3\ NaYF4: Yb3+/Tm3\ NaYF4: Tm3+/Er3+ 和 NaYF4: Yb3+/Tm37Er3+中的一種或多種。
[0039]另一優(yōu)選例中，該藥物活性成分包含抗腫瘤藥物。
[0040]另一優(yōu)選例中，該抗腫瘤藥物包含阿霉素和/紫杉醇。
[0041]本發(fā)明的第六方面提供一種超聲波治療系統(tǒng)，其包含用于發(fā)射超聲波的裝置，和前述的二元納米復(fù)合藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1是說明實施例1中T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物表征的紅外光譜吸收(a圖)、Zeta電位(b圖)。
[0043]圖2是說明實施例1中PEG4000_Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物表征的粒徑分布。
[0044]圖3是說明實施例1中使用MTT法檢測阿霉素和三種PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物對人乳腺癌多藥耐藥細胞的殺傷能力。
[0045]圖4是說明實施例1中通過激光共聚焦顯微鏡研究PEG4000-Ti02_阿霉素三元納米復(fù)合藥物在人乳腺癌多藥耐藥細胞內(nèi)的分布規(guī)律。
[0046]圖5是說明實施例10中使用MTT法檢測T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物抗人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)的效果。
[0047]圖6是說明實施例10中T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)分布的X射線同步輻射結(jié)果O
[0048]圖7是說明實施例10中T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)分布的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果。
【具體實施方式】
[0049]本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次發(fā)現(xiàn)以具有超聲激活性質(zhì)的納米粒子或復(fù)合納米粒子為核心載體，將藥物裝載于核心載體上，并且為保持納米復(fù)合藥物的穩(wěn)定性，延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間，再用穩(wěn)定劑(例如親水性聚合物等)包裹于外面，從而獲得三元納米復(fù)合藥物。通過控制核心載體的粒徑、藥物搭載量、穩(wěn)定劑用量等控制復(fù)合藥物的粒徑，使其對腫瘤組織具有較好的透過性及滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng)，即被動靶向腫瘤作用);或者可進一步通過對納米復(fù)合藥物表面修飾靶向腫瘤的配體分子使其具有主動靶向腫瘤作用。使用本發(fā)明的三元納米復(fù)合藥物或 申請人:已提交的專利申請案(申請?zhí)枮?0111039712.7)中記載的二元納米復(fù)合藥物，加上通過一定劑量超聲波輻射腫瘤部位，可實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療，使用醫(yī)學(xué)成像儀器可對腫瘤部位成像或者對兩種治療模式的協(xié)同效果進行實時療效評價。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0050]三元納米復(fù)合藥物
[0051]本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物包含:
[0052]核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合；
[0053]藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上；和
[0054]用于包裹所述核心載體與藥物活性成分的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括親水性聚合物、表面含有羥基或羧基的脂質(zhì)體、牛血清白蛋白納米球(簡稱BSA)、人血清白蛋白納米球，或其組合。
[0055]術(shù)語“活性自由基”是指能破壞腫瘤細胞結(jié)構(gòu)的自由基，例如ΟΗ^ΟΗ、Η202、0等。
[0056]另一優(yōu)選例中，所述第一納米粒子包含T12和/或Zr02。另一優(yōu)選例中，該第一納米粒子是T12納米粒子。
[0057]另一優(yōu)選例中，該第一納米粒子的粒徑范圍優(yōu)選為1-150納米。
[0058]另一優(yōu)選例中，該醫(yī)學(xué)成像信號包括T1加權(quán)的磁共振成像信號、T2加權(quán)的磁共振成像信號、電子計算機X射線斷層掃描信號、近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號，或其組合。
[0059]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合納米粒子包含所述第一納米粒子，與選自Gd203、Fe304、ZnFe2O4, NiFe2O4, Au、NaYF4:Er3+/Yb3\ NaYF4: Yb3+/Tm3\ NaYF4: Tm3+/Er3+ 和 NaYF4: Yb3+/Tm37Er3+中的一種或多種。
[0060]另一優(yōu)選例中，該核心載體是具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，例如具有T1加權(quán)MRI信號的Gd2O3與Ti02、ZrO2其中一種或兩種的復(fù)合納米粒子，優(yōu)選為Gd2O3-T12復(fù)合納米粒子，其制備方法可參考下面實施例5 ;或具有T2加權(quán)MRI信號的Fe304、ZnFe2O4, NiFe2O4其中的一種或多種與Ti02、ZrO2其中的一種或兩種的復(fù)合納米粒子，優(yōu)選為Fe3O4-T12復(fù)合納米粒子,其制備方法可以參照 申請人:已申請的中國發(fā)明專利CN102125699A ;或具有CT信號的Au與Ti02、ZrO2其中一種或兩種的復(fù)合納米粒子，優(yōu)選為Au-T12復(fù)合納米粒子，其制備方法參考文獻:Z.ff.Seh, S.Liu, M.Low, S.Y.Zhang, Z.Liu, A.Mlayah, Μ.Y.Han.Janus Au-T12 photocatalysts with strong localizat1nof plasmonic near-fields for efficient visible-light hydrogen generat1n.Advanced Materials2012, 24:2310-2314.;或者具有近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號性質(zhì)的納米材料與Ti02、ZrO2其中一種或兩種的復(fù)合納米粒子，優(yōu)選為NaYF4:Er3+/Yb3+、NaYF4:Yb3+/Tm3+、NaYF4: Tm3VEr3+, NaYF4: Yb3+/Tm37Er3+其中的一種與T12的復(fù)合納米粒子，更優(yōu)選為NaYF4: Yb3VTm3+-T12復(fù)合納米粒子,其制備方法可以參照 申請人:已申請的中國發(fā)明專利CN102743752A。
[0061]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合納米粒子的粒徑范圍優(yōu)選5-150納米,更佳為50-150納米。
[0062]另一優(yōu)選例中，該親水性聚合物包括非離子型聚合物、陽離子型聚合物、含羧基聚合物，或其組合。
[0063]另一優(yōu)選例中，該親水性聚合物包含聚乙二醇(簡稱PEG)、葡聚糖、聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、羧甲基葡聚糖、聚丙烯酸，或其組合。
[0064]另一優(yōu)選例中 ，該藥物活性成分包含抗腫瘤藥物。
[0065]另一優(yōu)選例中，該抗腫瘤藥物包含蒽環(huán)類抗腫瘤藥物和/或紫杉醇。
[0066]另一優(yōu)選例中，該抗腫瘤藥物包含阿霉素和/或紫杉醇。
[0067]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合藥物還包括用于靶向腫瘤的含有配體分子的表面修飾層。
[0068]另一優(yōu)選例中，該配體分子是通過酰胺鍵(-C0-NH-)連接到該穩(wěn)定劑的表面。
[0069]另一優(yōu)選例中，該配體分子為葉酸、葉酸衍生物、RGD肽(精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸)、腫瘤特異性抗體，或其組合。優(yōu)選為葉酸。
[0070]另一優(yōu)選例中，該藥物活性成分是以非共價連接方式負(fù)載于所述核心載體上。所述非共價連接方式可以是通過物理吸附、靜電作用力、分子間作用力其中的一種或幾種方式連接。
[0071]另一優(yōu)選例中，用于包裹所述核心載體與藥物活性成分的穩(wěn)定劑為PEG修飾的脂質(zhì)體納米球，其制備方法參考文獻:王向濤，李沙，張小濱，侯新樸.PEG修飾脂質(zhì)體對阿霉素載藥量的影響.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2002，34 (3):286-289 ;或者優(yōu)選BSA納米球，其制備方法參考 申請人:發(fā)表的論文:Z.Shen, ff.Wei, H.Tanaka, K.Kohama, G.Ma, T.Dobashi, Y.Maki, H.Wang, J.Bi, S.Da1.“A galactosamine-mediated drug delivery carrier fortargeted liver cancer therapy.Pharmacological Research，，，2011，64:410-419。
[0072]另一優(yōu)選例中，該穩(wěn)定劑經(jīng)冷凍干燥后，可以具有增強超聲造影成像信號的功能。該穩(wěn)定劑的粒徑優(yōu)選為30-250納米，更佳為50-200納米。
[0073]另一優(yōu)選例中，以重量為基準(zhǔn)，所述核心載體、藥物活性成分和穩(wěn)定劑的含量比為1:0.01:0.4至1:0.5:1。較佳地，該核心載體、藥物和穩(wěn)定劑的含量比為1:0.01:0.5至I:0.5:lo 更佳地為 I:0.01:0.5 至 I:0.1:0.8。
[0074]另一優(yōu)選例中，該復(fù)合藥物的粒徑為10至200納米。更佳地為50至150納米。
[0075]另一優(yōu)選例中，該三元納米復(fù)合藥物為具有前述的超聲激活性質(zhì)且含有抗腫瘤藥物的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選T12-阿霉素，更優(yōu)選PEG包裹的T12-阿霉素；或者是同時具有前述的超聲激活性質(zhì)與T1加權(quán)MRI信號且含有抗腫瘤藥物的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選PEG包裹的Gd2O3-T12-阿霉素；或者是同時具有前述的超聲激活性質(zhì)與Τ2加權(quán)MRI信號且含有抗腫瘤藥物的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選PEG包裹的Fe3O4-T12-阿霉素；或者是同時具有前述的超聲激活性質(zhì)與CT信號且含有抗腫瘤藥物的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選PEG包裹的Au-T12-阿霉素；或者是同時具有前述的超聲激活性質(zhì)與近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號且含有抗腫瘤藥物的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)選PEG包裹的NaYF4:YbW+-T12-阿霉素。
[0076]本發(fā)明的三元納米復(fù)合藥物具有超聲激活性質(zhì)，即該三元納米復(fù)合藥物經(jīng)頻率優(yōu)選為800-10000Κ Hz且能量為優(yōu)選為0.5_2W/cm2的超聲波輻射后，能夠在生物組織內(nèi)產(chǎn)生OH1、OH、H2O2、O 等活性自由基(ROS)。
[0077]制備三元納米復(fù)合藥物的方法
[0078]制備上述本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物的方法，其包含以下步驟:
[0079](a)將所述核心載體分散于水中，從而形成核心載體分散液；
[0080](b)混合所述核心載體分散液與所述藥物活性成分，從而形成二元水溶膠；和
[0081](C)混合所述二元水溶膠與含所述穩(wěn)定劑的溶液，從而形成所述三元納米復(fù)合藥物。
[0082]另一優(yōu)選例中，該方法還包含步驟(d)，其用于先活化步驟(C)得到的三元納米復(fù)合藥物，和使用含有配體分子的溶液對所述活化后的三元納米復(fù)合藥物進行表面修飾，從而獲得包括表面修飾層的三元納米復(fù)合藥物，所述表面修飾層含有配體分子。
[0083]三元納米復(fù)合藥物用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途
[0084]本發(fā)明還提供一種如前述的三元納米復(fù)合藥物用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
[0085]另一優(yōu)選例中，該三元納米復(fù)合藥物是用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
[0086]使用本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物作用于腫瘤，通過一定劑量超聲波輻射腫瘤部位，可實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療，使用醫(yī)學(xué)成像儀器可進行腫瘤部位成像或者對兩種治療模式的協(xié)同效果進行實時療效評價。
[0087]治療腫瘤時，可以通過靜脈滴注，或者通過腫瘤部位注射，或者通過腫瘤部位涂抹的方式，將該三元納米復(fù)合藥物投藥于腫瘤部位。
[0088]另一優(yōu)選例中，實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的治療可以使用頻率為800-10000KHZ，最高能量為2W/cm2的超聲波輻射瘤部位。更佳地頻率為ΙΟΟΟΚΗζ，能量為0.5W/cm2。
[0089]適用于該三元納米復(fù)合藥物治療的腫瘤可以是對化療藥物敏感的腫瘤,或者是多藥耐藥腫瘤。
[0090]該超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療的機理推測為:投藥后，該三元納米復(fù)合藥物靶向富集于腫瘤組織、腫瘤細胞將該三元納米復(fù)合藥物攝入，然后其中的藥物活性成分在細胞內(nèi)被釋放，其中的T12或者ZrO2經(jīng)超聲波輻射產(chǎn)生0Η\0Η、Η202、0等R0S，藥物活性成分與自由基共同對腫瘤細胞進行殺傷或破壞，從而實現(xiàn)兩種治療模式的協(xié)同；或者是投藥后，該三元納米復(fù)合藥物靶向富集于腫瘤組織后，由于腫瘤組織的酸性微環(huán)境，藥物活性成分被釋放，給予的超聲輻射增強了藥物活性成分對細胞的滲透，提高了藥物活性成分對腫瘤的殺傷；或者是前述兩種情況的綜合。
[0091 ] 所述醫(yī)學(xué)成像儀器可以是磁共振成像儀、電子計算機X射線斷層掃描儀，或者是能偵測材料在近紅外光激發(fā)后產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換熒光現(xiàn)象的儀器。
[0092]超聲波治療系統(tǒng)
[0093]本發(fā)明第一種超聲波治療系統(tǒng)包含用于發(fā)射超聲波的裝置和如前述的三元納米復(fù)合藥物。
[0094]適用于本發(fā)明的用于發(fā)射超聲波的裝置可為已知的醫(yī)療用的超聲波裝置，只要能發(fā)射出前述頻率與能量范圍即可。
[0095]二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途，與超聲波治療系統(tǒng)
[0096]本發(fā)明也提供將二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途，該二元納米復(fù)合藥物包含核心載體與負(fù)載于所述核心載體上的藥物活性成分，且核心載體與藥物活性成分的定義分別與前述三元納米復(fù)合藥物中所包含的核心載體與藥物活性成分相同。
[0097]另一優(yōu)選例中，以重量為基準(zhǔn)，所述核心載體與藥物活性成分的含量比為1:0.01至1:0.5。更佳的為1:0.01至1:0.1。
[0098]本發(fā)明第二種超聲波治療系統(tǒng)包含用于發(fā)射超聲波的裝置，和前述的二元納米復(fù)合藥物。該二元納米復(fù)合藥物的定義同上述。
[0099]本發(fā)明的主要有益效果包括:
[0100](1)本發(fā)明提供了一種腫瘤治療用三元納米復(fù)合藥物的制備方法，該方法簡單易行，成本低廉，利于工業(yè)化生產(chǎn)和市場推廣。
[0101](2)本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物可實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療，特別是多藥耐藥腫瘤的治療，有效降低化療藥物的副作用。
[0102](3)本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物中的核心載體是具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于該第一納米粒子的復(fù)合納米粒子時，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的成像診斷以及腫瘤治療過程中的實時療效評價。
[0103](4)由于超聲波的非侵入性、無創(chuàng)性、可控性和良好的組織穿透能力，本發(fā)明提供的三元納米復(fù)合藥物可實現(xiàn)腫瘤，尤其是多藥耐藥腫瘤的靶向無創(chuàng)治療與實時療效評價。
[0104](5)本發(fā)明還提供將二元納米復(fù)合藥物應(yīng)用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
[0105]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。。
[0106]〈材料來源〉
[0107]1.阿霉素:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:D107159。
[0108]2.PEG600:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:P103727。
[0109]3.PEG1500:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:P103721。
[0110]4.PEG4000:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:P103724。
[0111]5.牛血清白蛋白納米球:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:A104912。
[0112]6.葉酸:購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；型號:F103635。
[0113]實施例1:PEG-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0114](1.1)制備:
[0115](a) T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0116](a-1)制備T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0117]取粒徑為30_50nm納米、具有超聲激活性質(zhì)的T12粉體(制備方法參考 申請人:發(fā)表的論文:A Wu, T Paunesku, EMB Brown, A Babbo, C Cruz, M Aslam, etal.NAN02008, 3，27-36.)溶于超純水中，制得0.075mol/L的T12納米粒子水溶膠10mL,避光、通氮氣攪拌0.5小時；在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素水溶液8.25mL，避光、密閉空氣攪拌12小時，使阿霉素充分吸附到T12納米粒子表面；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次后；投入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01mol，pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。所獲得的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的粒徑范圍為50-70納米。
[0118](a-2) T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的表征:
[0119]采用傅立葉變換紅外光譜儀、動態(tài)光散射儀對(a-Ι)所制備的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物進行紅外吸收、Zeta電位表征。表征結(jié)果如圖1所示，圖1a與Ib中以T12/DOX曲線及柱狀圖表示T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的測量結(jié)果，而T12與DOX分別表示單獨的T12和阿霉素的測量結(jié)果(圖2至圖7中Ti02/D0X、T12與DOX定義相同，后面不再重復(fù)說明)，圖1中a圖顯示阿霉素(DOX)裝載到T12后，沒有出現(xiàn)新的紅外吸收峰，說明阿霉素通過比較弱的作用力與T12結(jié)合，b圖顯示在中性水溶液中T12表面為負(fù)電，阿霉素裝載到T12后，T12的Zeta電位降低，由于阿霉素分子中的氨基基團在中性水溶液中帶正電，說明阿霉素通過靜電吸附的方式裝載于T12納米粒子表面。
[0120](a-3)Ti02表面阿霉素裝載率的計算
[0121]將阿霉素溶于超純水中，配制成濃度梯度為3.00,1.50,0.75,0.38,0.19,0.09、0.04,0.01mg/mL溶液，分別取上述溶液0.5mL，使用紫外-可見光譜儀檢測不同濃度阿霉素的吸收，計算阿霉素濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0122]收集(a-Ι)中三次離心的上清液，使用紫外-可見光譜儀檢測三次上清液中阿霉素的吸收，根據(jù)前一步得到的阿霉素濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計算三次上清液中阿霉素的含量，即未裝載于T12表面的阿霉素量，根據(jù)投入的阿霉素總量，計算(a-ι)得到的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物中T12表面阿霉素的裝載率為1.1%。
[0123](a-4) T12-阿霉素的藥物體外釋放規(guī)律
[0124]取(a-Ι)制備的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物干粉60mg，分散于30mL超純水中，等分為三份，每份10mL，置于三個透析袋中，將透析袋分別置于pH5、6、7的90ml磷酸鹽緩沖液，將透析裝置放置于37°恒溫箱中透析48小時，每I小時，測量一次透析液中阿霉素的紫外-可見吸收光譜，根據(jù)(a-3)中的阿霉素濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藥物在不同酸性條件下的釋放曲線。
[0125](b) PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的制備:
[0126](b-l)PEG600-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:將(a-1)獲得的10mL T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠在避光條件下，通氮氣攪拌0.5小時；將0.05mol/L PEG (分子量600)溶液1mL逐滴加入到T12-阿霉素水溶膠中，避光、密閉空氣攪拌24小時；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液,再投入10mL超純水將沉淀重懸,重復(fù)離心操作兩次；投入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01mol, pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即PEG包裹的T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將三元納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。所獲得的三元納米復(fù)合藥物的平均粒徑為170納米。
[0127](b-2)PEG1500-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:同(b_l)，差異僅在于使用的PEG的分子量是1500。
[0128](b-3) PEG4000-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:同(b_l)，差異僅在于使用的PEG的分子量是4000。
[0129](1.2) PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的表征:
[0130]采用動態(tài)光散射粒徑分布儀對(1.1)所制備的PEG4000-Ti02_阿霉素三元納米復(fù)合藥物進行粒徑分布表征。表征結(jié)果如圖2所示，圖2中以Ti02-D0X-PEG4000表示PEG4000-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的測量結(jié)果，圖2顯示T12表面搭載藥物以及PEG后，粒徑明顯變大。
[0131](1.3)抗多藥耐藥腫瘤細胞的評價
[0132](I)取實施例1制備的(1.1)三種PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(PEG分子量各為600、1500、4000)以及相同藥物濃度的阿霉素?zé)o菌溶液待用。
[0133](2)取對數(shù)生長期的人乳腺癌多藥耐藥細胞MCF-7/ADM，調(diào)整細胞濃度為IXlO5個/mL，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μ L，或者接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2mL。細胞在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0134](3)24小時過后，棄掉培養(yǎng)孔板中的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板中分別加入新鮮培養(yǎng)液(對照組)、含有PEG600-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的培養(yǎng)基、含有PEG1500-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的培養(yǎng)基、含有PEG4000-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的培養(yǎng)基、含有阿霉素的培養(yǎng)基，在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時。
[0135](4)采用MTT法檢測該三種PEG-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物對人乳腺癌細胞的殺傷能力；通過激光共聚焦顯微鏡研究PEG4000-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物在腫瘤細胞內(nèi)的分布規(guī)律。結(jié)果分別如圖3與圖4所示，圖3中以Ti02-D0X-PEG600、T12-DOX-PEG1500、Ti02-D0X-PEG4000的柱狀圖分別表示PEG600_Ti02_阿霉素三元納米復(fù)合藥物、PEG1500-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物、PEG4000-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物的測量結(jié)果，圖3顯示與自由的阿霉素相比，不同分子量PEG包裹的納米復(fù)合藥物能夠顯著提高阿霉素抗耐藥腫瘤細胞的活性。圖4顯示(A是對照組；B是單獨阿霉素組；C是PEG4000-Ti02-阿霉素組；藍色熒光標(biāo)記細胞核，紅色熒光標(biāo)記阿霉素)，三元納米復(fù)合藥物能夠顯著提高阿霉素在耐藥腫瘤細胞內(nèi)的分布。
[0136]實施例2 =PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0137](2.1)制備:
[0138](a)制備Fe3O4-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0139]取粒徑為40_60nm納米、具有T2加權(quán)的磁共振信號與超聲激活性質(zhì)的Fe3O4-T12納米復(fù)合物粉體(其制備方法可以參照前述的 申請人:已申請的中國發(fā)明專利CN102125699A)溶于超純水中，制得0.lmol/L的Fe3O4-T12納米粒子水溶膠90mL，避光、通氮氣攪拌0.5小時；在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素溶液10mL，避光、密閉空氣攪拌24小時，使阿霉素充分吸附到Fe3O4-T12表面；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次后，投入10mL超純水并將沉淀重懸，獲得Fe3O4-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠。
[0140](b)制備PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:
[0141]將(a)獲得的10mL Fe3O4-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠在避光條件下，通氮氣攪拌0.5小時；將0.lmol/L PEG(分子量1500)溶液1mL逐滴加入到Fe3O4-T12-阿霉素水溶膠中，避光、密閉空氣攪拌24小時；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次；投入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01mol,pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即PEG包裹的Fe3O4-T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將三元納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。所獲得的三元納米復(fù)合藥物的粒徑范圍為50-80納米，由于EPR效應(yīng)，能夠被動靶向腫瘤組織。
[0142](2.2)PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物抗多藥耐藥腫瘤的評價(動物實驗)
[0143](I)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有多藥耐藥特性的肝癌細胞H印G2，穩(wěn)定傳代3-4代后，取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.02%的EDTA消化液消化，收集細胞，離心后以含10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，進行細胞計數(shù)并將細胞密度調(diào)整為lX107/mL。取4-6周齡BALB/C小鼠12只，于胸部皮下注射接種200 μ L的多藥耐藥肝癌細胞IfepG2，建立小鼠肝癌多藥耐藥腫瘤模型，飼養(yǎng)3天后，隨機分四組:對照組(3只)、阿霉素化療組(3只)、PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物化療組(3只)、PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物超聲協(xié)同化療組(3只)。
[0144](2)取(2.1)制備的PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物無菌水溶膠、阿霉素?zé)o菌溶液、無菌生理鹽水，將阿霉素濃度調(diào)整到5 μ g/mL。分別將PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物于胸部腫瘤部位注射100 μ L給藥于PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物化療組、PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物超聲協(xié)同化療組；將阿霉素?zé)o菌溶液于胸部腫瘤部位注射100 μ L給藥于阿霉素化療組；將無菌生理鹽水于胸部腫瘤部位注射100 μ L給藥于對照組。
[0145](3)上述實驗組給藥后，每隔I小時，使用磁共振成像儀實時觀察PEG-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物在腫瘤部位聚集，根據(jù)藥物聚集情況，在腫瘤部位給予適當(dāng)時間的超聲波輻射(頻率1000K Hz、能量0.5ff/cm2),并使用磁共振成像儀實時監(jiān)控治療效果，并每天觀察小鼠的皮膚、反應(yīng)、食欲及精神狀態(tài)。
[0146](4)作為驗證實驗，實驗結(jié)束后，采用心臟抽血處死小鼠，解剖檢查腫瘤體積，并采用免疫組化法觀察腫瘤組織切片中P-糖蛋白的表達，評價治療效果。
[0147]實施例3 =BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0148](a)制備Fe3O4-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:同(2.1)。
[0149](b)制備BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:
[0150]將(a)制備的Fe3O4-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥得到粉末，取50mg粉末，溶于1mL超純水中，配制成5mg/mL水溶膠。配制0.8mg/mL的氯化鈉溶液50mL，用氫氧化鈉將溶液PH值調(diào)至8-11。稱取50mg BSA,將其溶于氯化鈉溶液中，得到lmg/mL的BSA溶液。在室溫、避光磁力攪拌下，將Fe3O4-T12-阿霉素逐滴加入到BSA溶液中，并逐滴滴加6mL無水乙醇，之后再逐滴加入10%的戊二醛溶液50 μ L，繼續(xù)在室溫、避光磁力攪拌陳化處理24小時，再滴加40mg/mL的賴氨酸溶液lmL，避光磁力攪拌2小時后，將反應(yīng)體系置于超純水中，避光透析24小時，除去多余的反應(yīng)物，得到BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即包埋于BSA納米球的Fe3O4-T12-阿霉素納米復(fù)合物)，其粒徑為80_130nm。經(jīng)
0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物，并保存于4V待用；或者將BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。獲得的干燥粉末可以具有增強超聲造影信號的功能。
[0151]實施例4:葉酸-BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0152]取實施例3制備的BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物10mL，室溫、避光磁力攪拌下，加入4 μ L碳化二亞胺(簡稱EDAC) (50mmol/L)和6 μ L N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡稱NHS) (40mmol/L)對BSA表面的羧基活化，逐滴加入lOmmol/L的葉酸溶液1ml，室溫、避光磁力攪拌反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系置于超純水中，避光透析24小時，除去多余的反應(yīng)物，得到葉酸-BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即葉酸修飾的主動靶向腫瘤細胞的BSA-Fe3O4-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物)。此復(fù)合藥物經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，并保存于4°C待用；或者將復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。
[0153]實施例5 =PEG-Gd2O3-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0154](a)制備Gd2O3-T12納米復(fù)合物:
[0155]稱取六水硝酸釓(Gd(NO3) 3.6H20) 0.006mol，將其溶解到20mL —縮二乙二醇中，在140°C下磁力攪拌，得到A溶液待用。稱取0.01mmol氫氧化鈉(NaOH)，將其溶解40mL —縮二乙二醇中，磁力攪拌，得到B溶液待用。將A溶液加入B溶液中，在140°C下磁力攪拌I小時，180°C下磁力攪拌4小時。將反應(yīng)液進行透析:透析袋截留分子量3500，透析6次。將1.8mol/L的鈦酸四丁酯溶液1mL逐滴加入上述透析液，繼續(xù)攪拌；反應(yīng)8小時后，向生成物中加入0.0008mol/L的CTAB15mL，并繼續(xù)攪拌30min ;在室溫中進行陳化處理，陳化時間為18小時；將生成物進行離心，得到純凈的Gd2O3-T12納米復(fù)合物，經(jīng)冷凍干燥獲得固體粉末備用。
[0156](b)制備Gd2O3-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0157]取(a)中制備的Gd2O3-T12粉體2g，溶于90mL超純水中，制得Gd2O3-T12納米粒子水溶膠，避光、通氮氣攪拌0.5小時；在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入0.005mol/L阿霉素超純水溶液1mL,避光、密閉空氣攪拌12小時，使阿霉素充分吸附到Gd2O3-T12表面；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液,再投入10mL超純水將沉淀重懸,重復(fù)離心操作兩次后,投入10mL超純水并將沉淀重懸，獲得Gd2O3-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠。
[0158](c)制備PEG-Gd2O3-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:
[0159]將(a)獲得的10mL Gd2O3-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠在避光條件下，通氮氣攪拌0.5小時；將0.05mol/L PEG(分子量1500)溶液1mL逐滴加入到Gd2O3-T12-阿霉素水溶膠中，避光、密閉空氣攪拌12小時；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為20分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次；投入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01mol, pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的PEG-Gd2O3-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即PEG包裹的Gd2O3-T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用；所獲得的復(fù)合藥物的粒徑范圍為70納米左右，由于EPR效應(yīng)，能夠被動靶向腫瘤組織。
[0160]實施例6 =PEG-Au-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物[0161 ] (a)制備Au-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0162]取粒徑為20nm納米左右、具有CT信號與超聲激活性質(zhì)的Au-T12納米復(fù)合物粉體 Ig (此 Au-T12 粉體制備方法可參考文獻:Z.ff.Seh, S.Liu, M.Low, S.Y.Zhang, Z.Liuj A.Mlayah, Μ.Y.Han.Janus Au-T12 photocatalysts with strong localizat1n ofplasmonic near-fields for efficient visible-light hydrogen generat1n.AdvancedMaterials2012，24:2310-2314.)，溶于超純水中，制得90mL Au-T12納米粒子水溶膠，避光、通氮氣攪拌I小時；在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入0.01mol/L阿霉素溶液10mL，避光、密閉空氣攪拌24小時，使阿霉素充分吸附到Au-T12表面；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次后，投入10mL超純水并將沉淀重懸，獲得Au-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠。
[0163](b)制備PEG-Au-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:
[0164]將(a)獲得的10mL Au-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠在避光條件下，通氮氣攪拌I小時；將0.lmol/L PEG (分子量4000)溶液1mL逐滴加入到Au-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠中，避光、密閉空氣攪拌24小時；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為30分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次；加入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，
0.01mol,pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的PEG-Au-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即PEG包裹的Au-T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用；所獲得的納米復(fù)合藥物的粒徑范圍為50納米左右，由于EPR效應(yīng)，能夠被動靶向腫瘤組織。
[0165]實施例7 =PEG-NaYF4:Yb3+/Tm3+-Ti02-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0166](a)制備NaYF4: Yb3VTm3+-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物:
[0167]取粒徑為50-100納米、具有近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號與超聲激活性質(zhì)的NaYF4: Yb3VTm3+-T12納米復(fù)合物粉體Ig (此粉體制備方法可參照 申請人:已申請的中國發(fā)明專利CN102743752A)溶于超純水中，NaYF4: Yb3VTm3+T12納米粒子水溶膠90mL，避光、通氮氣攪拌I小時；在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入0.lmol/L阿霉素超純水溶液10mL，避光、密閉空氣攪拌24小時，使阿霉素充分吸附到NaYF4:Yb3+/Tm3+-Ti02表面；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為20分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸,重復(fù)離心操作兩次后,投入10mL超純水并將沉淀重懸，獲得NaYF4: Yb3+/Tm3+-T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物水溶膠。
[0168](b)制備PEG-NaYF4:Yb3+/Tm3+-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物:
[0169]將(a)獲得的10mL NaYF4:Yb3+/Tm3+-Ti02-阿霉素二元納米復(fù)合物水溶膠在避光條件下，通氮氣攪拌I小時；將0.05mol/L PEG (分子量1600)溶液20mL逐滴加入到NaYF4IYb3VTm3+-T12-阿霉素二元納米復(fù)合物水溶膠中，避光、密閉空氣攪拌24小時；攪拌結(jié)束后，將混合物溶液轉(zhuǎn)移到離心管中離心，離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為20分鐘；離心后棄去上清液，再投入10mL超純水將沉淀重懸，重復(fù)離心操作兩次；加入10mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.01mol, pH7.4)并將沉淀重懸，經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的PEG-NaYF4:Yb3+/Tm3+-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即PEG包裹的NaYF4 = Yb 3+/Tm3+-T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，并保存于4°C待用；或者重復(fù)離心操作兩次后，將納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用；所獲得的納米復(fù)合藥物的粒徑范圍為50納米左右，由于EPR效應(yīng)，能夠被動靶向腫瘤組織。
[0170]實施例8 =PEG/脂質(zhì)體-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物
[0171]稱取氫化大豆磷脂0.76g、膽固醇0.45g、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000單甲氧醚0.22g，各等分為兩份。其中一份用1mL氯仿-正己烷(1:1，體積比)溶解，加入實施例1的(1.D (a)制備的T12-阿霉素溶液2mL，超聲分散成乳后，經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約2mL濃乳。另一份溶于5mL氯仿-正己烷(1:1，體積比)，加入到含有T12-阿霉素的濃乳中，混勻后，加入1mL賴氨酸緩沖液(0.02mol/r1)，充分振蕩后，得到W/0/W乳劑，該乳劑經(jīng)減壓蒸發(fā)至不再產(chǎn)生氣泡，吹氮氣蒸發(fā)有機溶劑，室溫超聲2分鐘，即得PEG/脂質(zhì)體-T12-阿霉素三元納米復(fù)合藥物(即包埋于PEG與脂質(zhì)體的T12-阿霉素納米復(fù)合藥物)，其粒徑為60-100nm。經(jīng)0.2 μ m濾膜過濾后，獲得無菌的納米復(fù)合藥物，并保存于4°C待用；或者將納米復(fù)合藥物經(jīng)冷凍干燥，獲得干燥粉末備用。
[0172]實施例9:體外評價T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的超聲激發(fā)活性
[0173]配制濃度梯度為0.05,0.U0.2、0.4、0.6mg/mL的茜素紅溶液,使用紫外-可見光譜儀檢測吸收，繪制茜素紅濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。取實施例l(a-l)制得的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物50mg,分散于50mL超純水配制成lmg/mL的水溶膠并等分5份，在每份水溶膠中加入5mg茜素紅。使用1000KHz、0.5ff/cm2的超聲波分別對5份反應(yīng)液進行超聲輻射，輻射時間分別為0.5、1、2、4、8分鐘。輻射結(jié)束后檢測茜素紅的紫外-可見光譜吸收，根據(jù)前述茜素紅濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線計算分散液中殘留的茜素紅濃度，評價T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的超聲激發(fā)活性。
[0174]取T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物50mg，分散于50mL超純水配制成lmg/mL的水溶膠并等分5份。使用1000K Hz,0.5ff/cm2的超聲波分別對5份反應(yīng)液進行超聲輻射，輻射時間分別為0.5、1、2、4、8分鐘。輻射結(jié)束后使用ROS檢測試劑盒定量評價T12-阿霉素納米復(fù)合物的超聲激發(fā)活性。
[0175]實施例10 =T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物抗多藥耐藥腫瘤細胞的評價
[0176](I)取實施例1 (a-Ι)制得的T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物以及相同藥物濃度的阿霉素?zé)o菌溶液待用。
[0177](2)取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7、多藥耐藥細胞MCF-7/ADM，調(diào)整細胞濃度為I X 15個/mL，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 L，或者接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2mL。細胞在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0178](3)24小時過后，棄掉培養(yǎng)孔板中的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)板中分別加入新鮮培養(yǎng)液、含有T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的培養(yǎng)基、含有阿霉素的培養(yǎng)基，在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中分別孵育2、4、6、24、48、72小時。
[0179](4)采用MTT法檢測T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物對人乳腺癌細胞的殺傷能力；通過X射線同步輻射裝置研究T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的Ti元素在腫瘤細胞內(nèi)的分布規(guī)律；采用激光共聚焦顯微鏡研究T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在細胞內(nèi)的分布以及釋放規(guī)律。檢測結(jié)果如圖5、圖6和圖7所示。
[0180]圖5是說明實施例10中使用MTT法檢測T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物抗人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)的效果。圖5顯示T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物能夠顯著提高阿霉素抗耐藥腫瘤細胞的效果。
[0181]圖6是說明實施例10中T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)分布的X射線同步輻射結(jié)果。圖6顯示納米復(fù)合藥物中Ti元素在細胞內(nèi)的分布規(guī)律。
[0182]圖7是說明實施例10中T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在人乳腺癌細胞MCF-7 (藥物敏感細胞，a圖)、MCF-7/ADM(多藥耐藥細胞，b圖)分布的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果。圖7顯示納米復(fù)合藥物能夠顯著提高阿霉素在耐藥腫瘤細胞內(nèi)的攝入。(“疊加”圖表示“細胞膜/核”圖與“細胞膜/D0X”圖的疊加結(jié)果)
[0183]實施例11:超聲與化療雙模式協(xié)同治療多藥耐藥腫瘤細胞的評價
[0184](I)取實施例l(a-l)制備的無菌T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物以及相同藥物濃度的阿霉素?zé)o菌溶液待用。
[0185](2)取對數(shù)生長期的人乳腺癌細胞MCF-7、多藥耐藥細胞MCF-7/ADM，調(diào)整細胞濃度為I X 15個/mL，分別接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 L，或者接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔2mL。細胞在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
[0186](3)24小時后，棄掉培養(yǎng)孔板中的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)孔中分別加入新鮮培養(yǎng)液、含有T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物或者阿霉素的培養(yǎng)基，作用兩小時后，使用1000KHz、0.5W/cm2的超聲波分別對細胞輻射3分鐘，采用施藥但未被超聲波輻射的細胞作為對照，在5%C02、37°C、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、4、6、24、48、72小時。
[0187](4)采用MTT法檢測超聲與化療協(xié)同作用下T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物對人乳腺癌細胞的殺傷效果；通過X射線同步輻射裝置研究雙模式治療作用下T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物的Ti元素在細胞內(nèi)的分布規(guī)律；采用激光共聚焦顯微鏡研究雙模式治療作用下T12-阿霉素二元納米復(fù)合藥物在細胞內(nèi)的分布以及釋放規(guī)律；使用ROS試劑盒檢測超聲與化療雙模式治療下，腫瘤細胞中ROS的生成；通過Western-blot法檢測雙模式治療作用下，腫瘤細胞P-糖蛋白的表達量；用RT-PCR方法檢測雙模式治療下腫瘤細胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、多藥耐藥相關(guān)基因MDRl的表達。
[0188]綜上所述，以具有超聲激活性質(zhì)的納米粒子或復(fù)合納米粒子為核心載體，將藥物活性成分裝載于核心載體上，再用穩(wěn)定劑包裹于外面，從而可獲得可用于腫瘤治療的三元納米復(fù)合藥物，另外，也可進一步通過對納米復(fù)合藥物表面修飾靶向腫瘤的配體分子使其具有主動靶向腫瘤作用。再者，未包含穩(wěn)定劑的二元納米復(fù)合藥物與本發(fā)明三元納米復(fù)合藥物在被給藥后，通過一定劑量超聲波輻射腫瘤部位，可實現(xiàn)超聲波治療與化療協(xié)同的腫瘤靶向治療，可使用醫(yī)學(xué)成像儀器對腫瘤部位成像或者對兩種治療模式的協(xié)同效果進行實時療效評價。
[0189]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種三元納米復(fù)合藥物，其特征在于，所述三元納米復(fù)合藥物包含: 核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合； 藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上；和 用于包裹所述核心載體與藥物活性成分的穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑包括親水性聚合物、表面含有羥基或羧基的脂質(zhì)體、牛血清白蛋白納米球、人血清白蛋白納米球，或其組合。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合藥物，其特征在于，所述第一納米粒子包含T12和/或ZrO20
3.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合藥物，其特征在于，所述醫(yī)學(xué)成像信號包括T1加權(quán)的磁共振成像信號、T2加權(quán)的磁共振成像信號、電子計算機X射線斷層掃描信號、近紅外激發(fā)上轉(zhuǎn)換熒光信號，或其組合。
4.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合藥物，其特征在于，所述復(fù)合納米粒子包含所述第一納米粒子，與選自 Gd203、Fe3O4, ZnFe2O4, NiFe2O4、Au、NaYF4: Er3+/Yb3\ NaYF4: Yb3+/Tm3+、NaYF4: Tm3+/Er3+ 和 NaYF4:Yb3+/Tm37Er3+ 中的一種或多種。
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合藥物，其特征在于，所述親水性聚合物包括非離子型聚合物、陽離子型聚合物、含羧基聚合物，或其組合。
6.一種制備如權(quán)利要求1-5中任一所述的復(fù)合藥物的方法,其特征在于,所述方法包含以下步驟: (a)將所述核心載體分散于水中，從而形成核心載體分散液； (b)混合所述核心載體分散液與所述藥物活性成分，從而形成二元水溶膠；和 (C)混合所述二元水溶膠與含所述穩(wěn)定劑的溶液，從而形成所述三元納米復(fù)合藥物。
7.—種如權(quán)利要求1-5中任一所述的三元納米復(fù)合藥物用于制備治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途。
8.一種超聲波治療系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包含: 用于發(fā)射超聲波的裝置；和 如權(quán)利要求1-5中任一所述的三元納米復(fù)合藥物。
9.一種二元納米復(fù)合藥物用于制備利用超聲波激發(fā)從而治療腫瘤的藥學(xué)組合物的用途，所述二元納米復(fù)合藥物包含: 核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合；和 藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上。
10.一種超聲波治療系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包含: 用于發(fā)射超聲波的裝置；和 二元納米復(fù)合藥物； 所述二元納米復(fù)合藥物包含: 核心載體，其包含能夠被超聲波激發(fā)從而產(chǎn)生活性自由基的第一納米粒子、具有醫(yī)學(xué)成像信號的基于所述第一納米粒子的復(fù)合納米粒子，或其組合；和 藥物活性成分，其負(fù)載于所述核心載體上。
【文檔編號】A61K41/00GK104069491SQ201310103775
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月27日
【發(fā)明者】任文智, 吳愛國, 曾樂勇, 沈折玉, 馬雪華 申請人:中國科學(xué)院寧波材料技術(shù)與工程研究所