一種用于眼表修復的生物膜及其制備方法
【專利摘要】一種可用于眼表修復的生物膜及其制備方法，本發(fā)明的生物膜為一層致密的膠原膜結(jié)構，主要成分為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原及各類活性因子，厚度為0.01～0.05mm，拉伸強度為30～60MPa，縫合撕裂力為5～15N，具有抑制瘢痕和炎癥的作用。與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明生物膜能夠保留羊膜中各種天然成分及結(jié)構，以及相同治療效果，機械強度與新鮮羊膜相近，并確保生物膜無任何病毒隱患。本發(fā)明的生物膜適用于眼表燒傷及結(jié)膜損傷的修復，具有良好的促進上皮、抗炎癥、抑制瘢痕的功能，以及良好的治療效果。
【專利說明】一種用于眼表修復的生物膜及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程學醫(yī)用生物材料【技術領域】，具體涉及一種用于眼表修復的生 物膜及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 羊膜，從細胞滋養(yǎng)層衍化而來，是胚胎雙層膜的內(nèi)層，由上皮細胞層，基底膜和無 血管基質(zhì)組成，羊膜中包含多種膠原蛋白以及層粘連蛋白、纖連蛋白、糖胺聚糖、透明質(zhì)酸 等。正是這些活性物質(zhì)的存在，可以促進上皮細胞的黏附移行，誘導上皮分化，防止上皮 凋亡，使得羊膜充當一種"可移植的基底膜"來促進上皮化。此外，羊膜基質(zhì)中還包含有很 多生長因子，比如神經(jīng)生長因子（NGF)，肝細胞生長因子（HGF)，角質(zhì)細胞生長因子（KGF)， 轉(zhuǎn)化生長因子-α (TGF-α )，轉(zhuǎn)化生長因子-β UTGF-β 1)，表皮生長因子（EGF)，堿性成 纖維細胞生長因子（bFGF) (Koizumi, N.J, et al, Growth factor mRNA and protein in preserved human amniotic membrane. Curr Eye Res, 2000. 20(3): p. 173-7), 抑制血管生成、抗炎的蛋白(Hao, Y. et, al, Identification of antiangiogenic and antiinflammatory proteins in human amniotic membrane. Cornea, 2000. 19(3): p. 348-52)以及一些天然蛋白酶抑制因子（BK, N, et al, Analysis of human amniotic membrane components as proteinase inhibitors for development of therapeutic agent of recalcitrant keratitis. Trophoblast Res, 1999(13): p. 459-466·)，它們 能夠促進眼表上皮化、減輕炎性反應、抑制纖維組織增生和新生血管形成。因此，近年來羊 膜在眼表重建中的應用備受矚目。
[0003] 由于新鮮羊膜和冷藏羊膜能夠最大程度地保留各種天然膠原及活性因子成分，因 此臨床使用效果較好。但因這類羊膜未經(jīng)病毒滅活處理，無法確保其無菌狀態(tài)，存在病毒傳 播隱患。近年來國內(nèi)外也有一些羊膜產(chǎn)品，都是經(jīng)過凍干、脫細胞處理或常溫風干處理；雖 然，經(jīng)過凍干的羊膜可以達到理想含水率(一般1?10%)，但在凍結(jié)、凍融、干燥和儲存過程 中，存在多種誘導蛋白質(zhì)變性因素(如冷凍保護劑及凍干保護劑的選擇，冷凍速率的選擇 等)，使凍干過程不易控制、耗時長、成本高，容易造成蛋白質(zhì)變性、羊膜變脆，導致羊膜在手 術中容易撕裂，需要反復更換，延長手術時間；而常溫風干、晾干的方法使水分揮發(fā)過程較 長，且干燥脫水的效果不理想（一般含水率>13%)，；另外，羊膜經(jīng)脫細胞處理后損失大量天 然膠原，尤其是活性因子成分，影響了臨床使用效果。
[0004] 美國專利US006152142A和US006326019B1公開的羊膜產(chǎn)品是剖腹產(chǎn)胎盤經(jīng)清洗 干凈后鈍性分離去除絨毛膜，上皮向上平鋪在硝酸纖維濾紙上，之后按1 :1保存于DMEM :甘 油中，于-80°C冰箱中凍存，所制備的羊膜未經(jīng)脫細胞、干燥和滅菌處理，因此最大程度地保 留了羊膜成分與結(jié)構的完整性；但存在的問題有：①保存成本太高，且不方便運輸；②在 保存時經(jīng)過了低溫冷凍，使用時又需室溫解凍，這兩個過程都會造成羊膜膠原蛋白結(jié)構的 破壞，變得易碎；③制備中采用硝酸纖維素濾紙為襯底，在使用中需要將羊膜撕下來，使得 本來就易碎的羊膜更容易發(fā)生撕裂或卷曲，給臨床操作帶來諸多不便；④對羊膜未進行病 毒滅活處理，具有病毒傳播隱患。
[0005] 中國專利CN03150838. 3和中國專利CN200480023933. 7及中國專利申請 200410075361. 9公開了一種可常溫保存的生物羊膜的制備方法，是將胎盤的絨毛膜鈍性分 離，清洗后鋪在硝酸纖維素濾紙上，經(jīng)冷凍干燥后包裝，鈷60輻照滅菌。所制備的羊膜，與 上述美國專利類似，經(jīng)過了低溫冷凍，同樣在一定程度上對羊膜造成了破壞，使其變脆，在 臨床使用中容易撕裂；其也采用硝酸纖維素濾紙作為襯底，使用時羊膜不易取下，且容易發(fā) 生卷曲，給手術帶來不必要的麻煩，耗費手術時間，耽誤病情。
[0006] 中國專利申請201010113960. 0公開了 一種在低溫下（-20?4°C)使用基質(zhì)膠對 羊膜基質(zhì)進行重建及修復，采用有色染料染色，鋪膜、干燥后用鈷60消毒，從而較好地保存 了羊膜上皮及基底，但在低于零度條件下進行羊膜基質(zhì)重建，仍會造成羊膜變脆；鋪膜后將 羊膜從襯底上撕下會造成撕裂或卷曲，并難以辨識羊膜的上皮面和基底面，給臨床操作帶 來麻煩。
[0007] 美國專利 US 2003/0187515 A1 和 US 2004/0048796 A1 公開了一種脫細胞羊膜， 采用0. 1?1.0%脫氧膽酸鈉溶液浸泡羊膜，再利用細胞刮刀刮除羊膜上可見的細胞物質(zhì)。 該方法雖然可以有效地脫除細胞，同時也使許多細胞因子(血管內(nèi)皮生長因子，成纖維細 胞生長因子，TGF-1，血小板衍生的生長因子A和B，色素上皮衍生因子)的含量損失（Lim LS， Poh Rff, Riau AK, Beuerman Rff, Tan D, Mehta JS, Biological and ultrastructural properties of acelagraft, a freeze-dried y -irradiated human amniotic membrane, Arch Ophthalmol. 2010, 128(10):1303-10)。
[0008] 綜上所述，如何使羊膜材料既保留新鮮羊膜中的各類有效成分，又有利于臨床操 作和保存運輸，成為羊膜用于眼表重建亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種用于眼表修復的生物膜及其制備方法，所制備的生物膜 能保留新鮮羊膜的天然結(jié)構和成分，以及相同治療效果，機械強度與新鮮羊膜相近，并確保 生物膜無任何病毒隱患。
[0010] 本發(fā)明所提出的用于眼表修復的生物膜，為一層致密的膠原膜結(jié)構，主要成分為 I型膠原和III型膠原及各類活性因子，厚度為0. 01?0. 05mm，拉伸強度為30?60MPa，縫 合撕裂力為5?15N，具有抑制瘢痕和炎癥的作用；其中的各類活性因子包括堿性成纖維細 胞生長因子（bFGF)、表皮生長因子（EGF)、肝細胞生長因子（HGF)、角質(zhì)生長因子（KGF)、組 織金屬蛋白酶抑制因子（--ΜΡ)。
[0011] 本發(fā)明提出的用于眼表修復的生物膜的制備方法，是以羊膜為原料，經(jīng)原料消毒、 抑菌處理、保護處理、真空干燥、以及包裝與輻照滅菌步驟，最終得到生物膜產(chǎn)品；具體步驟 包括： 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜后，浸泡于消毒液中0. 5?5小時，再用純化 水清洗干凈；所述的消毒液為〇. 1?〇. 5M的NaOH水溶液、或是1?3g/L的過氧化氫水溶 液、或是〇. 1?〇. 5g/L的過氧乙酸水溶液、或是體積濃度為60%?90%的乙醇水溶液的任 一種； 其中，采用消毒液浸泡羊膜，可對羊膜進行有效消毒，將每張羊膜的微生物負載控制在 lcfu/cm2以下，避免所攜帶微生物的污染對后續(xù)處理過程和環(huán)境造成原料性污染；同時，這 些消毒液也具有滅活病毒的作用，以保證羊膜的生物安全性，并避免后續(xù)處理過程中的病 毒污染。
[0012] 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含有抗生素的生理鹽水或pH為7.0的 磷酸鹽緩沖液中〇. 2?lh ;所述的抗生素及其濃度為50 μ g/mL青霉素、50 μ g/mL鏈霉素、 4 μ g/mL慶大霉素、以及2. 5 μ g/mL兩性霉素B的任一種或是幾種的組合； 采用抗生素溶液處理，主要是抑制或殺滅羊膜中可能攜帶的各種細菌。
[0013] 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜置于混合保護液中震蕩1?24h ;所述 的混合保護液為干燥保護液與輻射保護液按體積1 :1?2的混合；其中，干燥保護液為1? 15g/L濃度的海藻糖水溶液、或是15?40%體積濃度的甘油水溶液，輻射保護液為5?15g/ L濃度的抗壞血酸水溶液、或1?10g/L濃度的甘露醇水溶液、或0. 5?5g/L濃度的茶多酚 水溶液； 海藻糖為非還原性糖，可在蛋白質(zhì)干燥失水的部位以羥基和分子形成氫鍵，使蛋白質(zhì) 分子在缺水狀態(tài)下仍保持正常構象，維持功能；而且其玻璃化溫度較高，可避免冰凍過程中 冰晶對細胞膜的破壞。甘油屬于滲透型保護劑，在干燥脫水過程中能穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能。目 前更傾向于用"水替代假說"來解釋這種保護作用：即認為蛋白質(zhì)表面有一層水膜，對于維 持蛋白質(zhì)的構象和功能有重要作用；在高溫干燥過程中，失去水膜會使蛋白質(zhì)構象發(fā)生變 化而失活。本步驟采用海藻糖或甘油進行保護處理，可避免羊膜中天然膠原蛋白及活性因 子在后續(xù)的干燥脫水中大量損失。
[0014] 通常，在輻照滅菌過程中產(chǎn)生的大量具有極強氧化性的自由基(如羥基自由基、超 氧自由基等)，會嚴重破壞蛋白質(zhì)的一級、二級及三級結(jié)構，使蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學 性質(zhì)遭到破壞。而抗壞血酸、甘露醇以及茶多酚是這類氧化性自由基的有效清除劑，從而起 到保護蛋白質(zhì)的作用。
[0015] 本發(fā)明采用的干燥保護劑和輻照保護劑，均對羊膜的膠原成分及結(jié)構具有保護作 用，能避免在干燥和輻照過程中羊膜機械強度的損失。試驗證明，經(jīng)過保護處理的羊膜拉伸 強度為30?60MPa，縫合撕裂力為5?15N，與未經(jīng)保護處理相比提高了 40?60% ;證明本 步驟可有效保護羊膜內(nèi)部的膠原結(jié)構及其機械性能，克服臨床使用中不利于縫合的缺點， 并提高生物膜產(chǎn)品的抗降解能力。
[0016] 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為-0. 08? 0. IMpa，溫度為40?55°C，干燥時間0. 1?5小時； 通常，真空干燥機內(nèi)真空度在-0. 〇95Mpa時，水的沸點約37°C，遠低于蛋白質(zhì)失活溫度 (為60°C左右)，本發(fā)明在40?55°C條件下對羊膜進行真空加熱干燥脫水處理，能防止蛋白 質(zhì)因高溫變性失活，克服羊膜在冷凍干燥后變脆、不利于手術縫合操作的缺陷； 另外，由于本步驟羊膜經(jīng)干燥保護劑處理，可最大程度保留羊膜良好的機械性能。由 于供體的個體差異，羊膜厚度有較大差異，一般在〇. 01?〇. 〇5mm，拉伸強度在30?65Mpa、 縫線撕裂力在5?15N。經(jīng)實驗證明，冷藏羊膜厚度與新鮮羊膜差異不大，但羊膜的機械 強度下降較為明顯，拉伸強度為30?50MPa，縫線撕裂力為5?12N ;而凍干羊膜的機械強 度下降明顯，拉伸強度為10?25MPa，縫線撕裂力為2?8N ;脫細胞羊膜的厚度下降明顯 (0. 005?0. 02mm)，造成機械強度的損失較大，拉伸強度為15?30MPa，縫線撕裂力為3? ION ;而本發(fā)明經(jīng)干燥保護和輻照保護后，真空干燥得到的羊膜，厚度為0. 01?0. 05mm，拉 伸強度為30?60MPa，縫合撕裂力為5?15N。同時，本發(fā)明采用真空干燥能提高脫水干燥 效率，方法簡單、耗能耗時少、生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
[0017] 步驟五、包裝與輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，在裁剪及真空封裝后，采用電 離輻射滅菌處理，即得到生物膜產(chǎn)品；所述的電離輻射可以是伽馬射線輻照或是高能電子 束輻照，劑量為15?30kGy。
[0018] 本步驟可以保證羊膜處于無菌狀態(tài)供臨床使用，同時電離輻照具有病毒滅活的作 用，再次的病毒滅活處理以保證羊膜的生物安全性。
[0019] 本發(fā)明制備的生物膜與未處理新鮮羊膜中天然成分相比，所含膠原及活性因子 與新鮮羊膜的含量相差不大。經(jīng)檢測，生物膜含有I型膠原251.3±1.3以8/!1^、111型膠 原 305. 5±2. 5μ g/mg，IV型膠原 38. 6±0. 7μ g/mg，肝細胞生長因子 56. 9±1. 2μ g/mg ; 而新鮮羊膜中含I型膠原303. 5±5. 3μ g/mg，III型膠原384. 2±4. 5μ g/mg，IV型膠原 53. 6± 1. 7 μ g/mg，肝細胞生長因子89. 9±3. 2 μ g/mg。由此可見本發(fā)明方法制備的生物膜 可有效保留天然羊膜中膠原及活性因子成分。
[0020] 本發(fā)明制備的生物膜，可有效保護天然羊膜的內(nèi)部結(jié)構，維持接近新鮮羊膜的機 械強度。經(jīng)檢測，本發(fā)明生物膜平均拉伸強度為58. 1 ±2. 4MPa，新鮮羊膜的平均拉伸強度為 63. 4±3. IMPa，經(jīng)真空凍干處理的羊膜平均拉伸強度僅為18. 3±1. 1 MPa，而僅經(jīng)真空干燥 處理的生物膜平均拉伸強度為40. 9±3. 1 Mpa?？梢钥闯觯瑑龈商幚硌蚰さ睦鞆姸认鄬τ?新鮮羊膜降低了 70%以上，容易拉裂；本發(fā)明生物膜的拉伸強度比新鮮羊膜的僅下降8%，但 比僅經(jīng)真空干燥處理生物膜的高約50%，接近新鮮羊膜的強度。證明干燥保護處理在真空干 燥中起到了保護羊膜結(jié)構的作用，也說明本發(fā)明方法中采用的保護劑可有效保護天然羊膜 的膠原結(jié)構及成分，減小干燥中對羊膜的破壞。
[0021] 與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明生物膜能夠保留羊膜中各種天然成分及結(jié)構，以及相同 治療效果，機械強度與新鮮羊膜相近，并確保生物膜無任何病毒隱患。與現(xiàn)有技術相比，本 發(fā)明制備方法具有以下優(yōu)點： (1)采用本發(fā)明制備方法得到的生物膜，可有效的保留了羊膜各種天然活性成分，如I 型膠原、III型膠原、IV型膠原以及表皮生長因子（EGF)、肝細胞生長因子（HGF)、角質(zhì)生長因 子（KGF)、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、組織金屬蛋白酶抑制因子（TIMP)等等；經(jīng)過對 以上成分的檢測證明，本發(fā)明生物膜產(chǎn)品與新鮮羊膜的含量相差僅為10?20%，說明本發(fā) 明制備方法能夠有效保留羊膜的各種天然成分。
[0022] (2)本發(fā)明采用的真空干燥脫水處理，在低于蛋白質(zhì)變性溫度下除去水分，不僅達 到了干燥脫水效果(含水率5?10%)，生物膜能夠長期室溫保存、運輸方便，還克服了因冷 凍處理使羊膜中的蛋白質(zhì)失活，造成羊膜變脆，改善了臨床使用中羊膜撕裂的情況；經(jīng)實驗 驗證，采用本發(fā)明得到的生物膜比采用冷凍干燥處理得到的羊膜在機械強度方面有明顯改 善，其拉伸強度比后者提高了 180?200%。
[0023] (3)由于本發(fā)明采用干燥保護和輻照保護處理，可以降低對羊膜膠原蛋白和活性 因子結(jié)構的破壞，有效保持生物膜的機械強度以及降解時間(參見圖2)，保留了良好的機械 性能，使臨床應用中的縫合不會發(fā)生生物膜撕裂，確保其應用于眼表手術后不會出現(xiàn)因過 快降解導致的修復效果不佳的情況。實驗證明，經(jīng)保護處理的生物膜的撕裂力比未經(jīng)處理 的提高40?60%。
[0024] (4)本發(fā)明采用的病毒滅活和抑菌處理方法，可有效降低羊膜的微生物負載，徹底 滅活可能攜帶的各類病毒，使生物膜的安全性得到有效保證。本發(fā)明中病毒滅活方法經(jīng)解 放軍軍事醫(yī)學科學院驗證，可完全保證各類病毒（如HIV、HBV、HCV、梅毒等）滅活，極大地 提高了臨床使用的安全性。
[0025] 將本發(fā)明制備的生物膜和新鮮羊膜分別用于眼表燒傷及結(jié)膜損傷動物模型修復 的對比實驗，術后4周實驗動物的眼表損傷和結(jié)膜損傷均得到有效修復，結(jié)果證明生物膜 保留了良好的促進上皮、抗炎癥、抑制瘢痕的功能，在眼表燒傷和結(jié)膜損傷的修復中具有良 好的治療效果(見圖4和圖5)。說明本發(fā)明生物膜有效保留了羊膜的各種天然成分和結(jié)構， 具有與新鮮羊膜等效的治療作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 附圖1是本發(fā)明制備的生物膜與新鮮羊膜的I型膠原、III型膠原和IV型膠原免疫 組化染色結(jié)果對比照片；其中，A、B、C、D為本發(fā)明生物膜的照片，E、F、G、H為新鮮羊膜的對 比照片；A和E為I型膠原染色結(jié)果，B和F為III型膠原染色結(jié)果，C和G為IV型膠原染色結(jié) 果，D和Η為陰性對照染色結(jié)果?？梢钥闯?，在生物膜和新鮮羊膜中，I型膠原、III型膠原和 IV型膠原有較強的陽性表達，證明本發(fā)明制備方法能夠保留羊膜中的天然膠原成分；由染 色結(jié)果也能看到，本發(fā)明制備的生物膜中各膠原分布有序，羊膜上皮細胞層、致密層、纖維 細胞層等結(jié)構清晰可見，說明本發(fā)明方法中干燥保護和輻照保護能夠有效地保護羊膜的天 然結(jié)構。
[0027] 附圖2為本發(fā)明方法中采用輻照保護處理效果的對比實驗照片；對比實驗是將不 同處理的生物膜采用0. 2mg/mL濃度的蛋白酶Κ溶液降解lh的結(jié)果比較；其中，Α為未經(jīng)輻 照滅菌的對照生物膜，可見生物膜完整性較好，有降解現(xiàn)象，膜部分破損；B為未經(jīng)保護處 理但經(jīng)輻照滅菌的生物膜，可見膜幾乎完全降解；C為經(jīng)保護處理(抗壞血酸處理)后再經(jīng)輻 照滅菌的生物膜，可見生物膜完整性較好，有部分降解現(xiàn)象。說明經(jīng)保護處理后再經(jīng)輻照滅 菌的生物膜的降解速率明顯低于未經(jīng)保護處理的；而且與未經(jīng)輻照的降解情況相同，證明 本發(fā)明所采用保護劑可有效保護羊膜，降低輻照對膜的損壞。
[0028] 附圖3為采用本發(fā)明制備的生物膜植入兔眼角膜板層間8周后的外觀照片及其HE 染色照片。顯示出在植入8周后仍能保持較完整的膜狀形態(tài)，植入部位未出現(xiàn)菌斑，兔眼角 膜未發(fā)生潰爛、炎癥、瘢痕等，說明植入的生物膜與兔角膜板層組織相容性良好，逐漸被吸 收融合，也說明本發(fā)明方法能夠徹底去除材料中的微生物污染，保證生物膜本身的安全性。
[0029] 附圖4為采用不同膜材料修復兔眼表化學燒傷實驗的外觀對比照片；其中，A、B、C 為采用新鮮羊膜修復的實驗情況:A、B、C分別為術后0天、2周、4周照片，可明顯看出，兔眼 術后狀況良好，在術后4周時的兔角膜已經(jīng)得到修復，角膜透明，無血管及瘢痕形成；D、E、 F為采用本發(fā)明生物膜修復的實驗情況：D、E、F分別為術后0天、2周、4周照片，可明顯看 出，兔眼術后狀況良好，在術后4周時的兔角膜透明、無血管生成，未出現(xiàn)紅腫、炎癥、角膜 潰瘍、瘢痕化的現(xiàn)象，與新鮮羊膜修復的效果相同；G、H、I為未使用膜材料修復的實驗情況 (空白對照):G、H、I分別為術后0天、2周、4周照片，可明顯看出，兔眼術后恢復較差，角膜有 部分區(qū)域出現(xiàn)炎癥反應及瘢痕組織，實驗兔眼角膜始終未能修復，未形成連續(xù)的多層角膜 上皮細胞，角膜板層也未能得以修復。說明本發(fā)明方法有效保留了羊膜中的各種天然成分， 保證了生物膜中促進上皮化、抗炎癥、抑制瘢痕生成等生物活性發(fā)揮作用，與新鮮羊膜具有 等效作用。
[0030] 附圖5為采用不同膜材料修復兔眼結(jié)膜缺損實驗的外觀對比照片；其中，A、B、C為 采用新鮮羊膜修復的實驗情況:A、B、C分別為術后1周、2周、4周照片，可明顯看出，兔眼結(jié) 膜缺損部位在羊膜移植后得到修復，結(jié)膜上皮細胞已經(jīng)重新形成，結(jié)膜光滑，無血管及瞼球 粘連形成；D、E、F為采用本發(fā)明生物膜修復的實驗情況：D、E、F分別為術后1周、2周、4周 照片，可明顯看出，兔眼術后狀況良好，結(jié)膜缺損部位在移植后得到修復，結(jié)膜光滑，無血管 及瞼球粘連形成，與新鮮羊膜修復效果相同；G、H、I為未使用膜材料修復的實驗情況(空白 對照）:G、H、I分別為術后1周、2周、4周照片，結(jié)果顯示，結(jié)膜缺損處結(jié)膜沒能修復，形成瘢 痕化，上皮化未完成。證明本發(fā)明方法有效保留了羊膜中的各種天然成分，其促進上皮化、 抗炎癥、抑制瘢痕生成等生物活性發(fā)揮作用，與新鮮羊膜具有等同效果。

【具體實施方式】
[0031] 以下結(jié)合實例對本發(fā)明技術方案及其效果作進一步的說明。實例中羊膜原料來自 于沈陽何氏眼科醫(yī)院羊膜庫。
[0032] 實施例1、 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜3次后，置于0. 5M的NaOH水溶液中浸泡0. 5 小時，再用純化水清洗3次； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含有50 μ g/mL的青霉素和50 μ g/mL的鏈霉 素的生理鹽水中15分鐘； 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜浸泡于混合保護液中震蕩24小時；混合保 護液為干燥保護液與輻射保護液按體積1 :1的混合；其中干燥保護液為lg/L濃度的海藻 糖水溶液；輻射保護液為5g/L濃度的抗壞血酸水溶液； 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為0. IMpa，并控 制溫度為40°C，干燥時間5小時； 步驟五、包裝與輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，按需要規(guī)格裁剪并真空封裝，最后 采用劑量為15kGy的伽馬射線輻照滅菌處理。
[0033] 本實例制備的生物膜，保留了多種膠原及活性成分，真空干燥溫度為40°C，與 動物正常生理溫度接近，避免了過高溫度造成蛋白質(zhì)變性失活，具有與新鮮羊膜等同的角 膜損傷治療效果。本實例干燥時間較長，生物膜含水率約為5%，有利于長期保存。采用兔眼 表損傷模型對該膜有效性進行評價，結(jié)果如圖4所示，顯示本實例制備的生物膜具有抑制 血管、抗炎癥、抑制瘢痕生成的良好效果。
[0034] 實施例2、 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜5次，置于75%酒精溶液中浸泡5小時，再用純 化水清洗10次； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含4μ g/mL慶大霉素及2. 5μ g/mL兩性霉素 B的pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液中l(wèi)h ; 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜浸泡于混合保護液中震蕩1小時；混合保護 液為干燥保護液與輻射保護液按體積比1 :2混合；其中干燥保護液為體積濃度為40%甘油 水溶液；輻射保護劑為l〇g/L的甘露醇水溶液； 步驟四、真空干燥：將經(jīng)步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為-0. 〇8Mpa， 并控制溫度為55°C，干燥時間0. 1小時。
[0035] 步驟五、包裝及輻照滅菌：將經(jīng)步驟四處理后的羊膜，按需要規(guī)格進行裁剪以及真 空封裝，最后采用劑量為30kGy的伽馬射線輻照滅菌處理。
[0036] 本實例制備的生物膜，保留了多種膠原及活性成分，真空干燥溫度為55°C，仍低于 大部分蛋白的變性失活溫度，且干燥時間僅為0. 1小時，對羊膜厚度影響較小（小于10%)， 保證了羊膜手術的可操作性；并且干燥時間極短，保留了羊膜的生物活性，具有與新鮮羊膜 等同的結(jié)膜損傷治療效果。采用兔眼結(jié)膜缺損模型對其有效性進行評價，結(jié)果如圖5所示， 顯示本實例的生物膜具有抑制血管、抗炎癥、抑制瘢痕生成的良好效果。
[0037] 實施例3、 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜4次，置于lg/L過氧化氫水溶液中浸泡1小 時，再用純化水清洗6次； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含50 μ g/mL青霉素及2. 5 μ g/mL兩性霉素 B的生理鹽水中30分鐘； 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜浸泡于混合保護液中震蕩24小時；混合保 護液為干燥保護液與輻射保護液按體積比1 :1. 5的混合；其中干燥保護液為15g/L的海藻 糖水溶液；輻射保護液為5g/L的茶多酚水溶液。
[0038] 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為 0. 05Mpa，并控制溫度為45°C，干燥時間2小時。
[0039] 步驟五、包裝及輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，按需要規(guī)格進行裁剪以及真空 封裝，最后采用劑量為25kGy的伽馬射線輻照滅菌處理。
[0040] 本實例采用15g/L的海藻糖溶液及5g/L的茶多酚溶液進行干燥保護及輻照保護， 混合保護劑中海藻糖濃度較高，在干燥保護中可有效地避免蛋白結(jié)構在干燥及輻照滅菌中 受到破壞，其拉伸強度檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過保護劑保護羊膜的拉伸強度接近新鮮羊膜，證實 本實例的生物膜可有效降低在制備中機械強度的損失，使生物膜在臨床使用中不會出現(xiàn)易 撕裂、不易縫合的現(xiàn)象。
[0041] 實施例4、 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜5次，置于0. lg/L過氧乙酸水溶液中浸泡3小 時，再用純化水清洗5次； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含50 μ g/mL青霉素的生理鹽水中l(wèi)/2h ; 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜浸泡于混合保護液中，震蕩12小時；混合保 護液為干燥保護液與輻射保護液按體積比1 :1. 2混合；其中干燥保護液為10g/L的海藻糖 水溶液；輻射保護液為15g/L的抗壞血酸水溶液； 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為-0. 〇5Mpa，并 控制溫度為50°C，干燥時間1小時； 步驟五、包裝及輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，按需要的規(guī)格進行裁剪以及真空封 裝，最后采用劑量為15kGy的高能電子束輻照滅菌處理。
[0042] 本實例采用lOg/L海藻糖溶液和15g/L抗壞血酸溶液進行干燥與輻照保護，由于 輻照保護劑的濃度較高，可更為有效避免蛋白在干燥及輻照滅菌過程中受到破壞，其降解 性能檢測結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過保護生物膜的降解速率與未處理新鮮羊膜的近似，證實本 實例生物膜可有效降低蛋白結(jié)構在制備過程中受到破壞，保證在臨床使用中不會因過快降 解而無法起到治療作用。
[0043] 實施例5、 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜5次，置于60%酒精溶液中浸泡4小時，再用純 化水清洗8次； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含50 μ g/mL鏈霉素、4 μ g/mL慶大霉素的pH 為7. 0的磷酸鹽緩沖液（PBS)中40分鐘； 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜浸泡于混合保護液中震蕩8小時；混合保護 液為干燥保護液和輻射保護液按體積比1 :1. 8混合，其中干燥保護液為體積濃度為20%甘 油水溶液；輻射保護液為8g/L的甘露醇水溶液； 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為0. 〇2Mpa，并 控制溫度為48°C，干燥時間2. 5小時； 步驟五、包裝及輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，按需要的規(guī)格進行裁剪以及真空封 裝，最后采用劑量為30kGy的高能電子束輻照滅菌處理。
[0044] 本實例制備的生物膜采用60%酒精處理4h及30kGy高劑量的輻照滅菌，可確保生 物膜無微生物污染及潛在病毒的隱患，滅菌劑量雖然較高，但仍能通過干燥及輻照保護、真 空干燥的結(jié)合使用，有效保留新鮮羊膜中多種膠原及活性因子，避免羊膜在輻照時受到破 壞；將本實例制備的羊膜經(jīng)免疫組化定性檢測，結(jié)果如圖1所示，本實例羊膜與新鮮羊膜相 t匕，I型膠原、III型膠原以及IV型膠原的分布部位相同，含量接近，間接證實了本發(fā)明方法 可有效保留羊膜生物活性的功能，保證在臨床上發(fā)揮出與新鮮羊膜相同的修復效果。
【權利要求】
1. 一種用于眼表修復的生物膜，其特征在于，所述的生物膜為一層致密的膠原膜結(jié)構， 主要成分為I型膠原和III型膠原及各類活性因子，厚度為0. 01?0. 05mm，拉伸強度為30? 60MPa，縫合撕裂力為5?15N，具有抑制瘢痕和炎癥的作用；其中的各類活性因子包括堿性 成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、肝細胞生長因子、角質(zhì)生長因子、組織金屬蛋白酶抑 制因子。
2. 制備權利要求1所述的用于眼表修復生物膜的方法，其特征在于，具體步驟包括： 步驟一、原料消毒：用生理鹽水清洗羊膜后，浸泡于消毒液中0. 5?5小時，再用純化水 清洗干凈； 步驟二、抑菌處理：將消毒后的羊膜浸泡于含有抗生素的生理鹽水或pH為7. 0的磷酸 鹽緩沖液中〇. 2?lh ; 步驟三、保護處理：將步驟二處理后的羊膜置于混合保護液中震蕩1?24h ;所述的混 合保護液為干燥保護液與輻射保護液按體積1 :1?2的混合；其中，干燥保護液為1?15g/ L濃度的海藻糖水溶液、或是15?40%體積濃度的甘油水溶液，輻射保護液為5?15g/L濃 度的抗壞血酸水溶液、或1?l〇g/L濃度的甘露醇水溶液、或0. 5?5g/L濃度的茶多酚水 溶液； 步驟四、真空干燥：將步驟三處理后的羊膜進行真空干燥處理，真空度為-0.08? 0. IMpa，溫度為40?55°C，干燥時間0. 1?5小時； 步驟五、包裝與輻照滅菌：將步驟四處理后的羊膜，在裁剪及真空封裝后，采用電離輻 射滅菌處理，即得到生物膜產(chǎn)品。
3. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟一中所述的消毒液為0. 1? 0. 5M的NaOH水溶液、或是1?3g/L的過氧化氫水溶液、或是0. 1?0. 5 g/L的過氧乙酸水 溶液、或是體積濃度為60%?90%的乙醇水溶液的任一種。
4. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟二中所述的抗生素及其濃度為 50 μ g/mL青霉素、50 μ g/mL鏈霉素、4 μ g/mL慶大霉素、以及2. 5 μ g/mL兩性霉素B的任一 種或是幾種的組合。
5. 根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟五中所述的電離輻射為伽馬射 線輻照或是高能電子束輻照，劑量為15?30kGy。
【文檔編號】A61L27/36GK104083803SQ201310109216
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年4月1日 優(yōu)先權日:2013年4月1日
【發(fā)明者】劉博文, 劉影, 王二浩 申請人:陜西佰傲再生醫(yī)學有限公司