專利名稱：貓變應原融合蛋白及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學、公共衛(wèi)生、免疫學、分子生物學和病毒學領域。本發(fā)明提供包含病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒和至少一種抗原的組合物，所述抗原特別是至少一種貓抗原，更特別地是至少一種為人變應原的貓抗原。在特定實施方案中，所述抗原是與VLP共價連接的Fel dl抗原或其片段。本發(fā)明也提供制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物在哺乳動物中，特別是在人中誘導有效的免疫應答，特別是抗體應答。本發(fā)明的組合物和方法可以用于制備疫苗，該疫苗特別用于治療和/或預防對貓毛皮屑和其他貓抗原和變應原的變態(tài)反應。
背景技術：
家貓(Felis domesticus)是室內變應原的一種重要的來源(Lau, S.等人.(2000)Lancet356，1392-1397)。實際上，在西方國家中有大約25%的家庭養(yǎng)貓，并且在一大部分群體中發(fā)現(xiàn)針對貓的變態(tài)反應。癥狀的嚴重程度從相對較輕的鼻炎和結膜炎到潛在危及生命的哮喘加重不等。盡管患者偶然對貓毛皮屑和毛皮中的幾種不同的分子敏感，但是主要的變應原是Fel dl (即家貓變應原I ;以前稱為Cat 1，即貓變應原I)。這種變應原的重要性已經在大量研究中被強調。事實上超過80%的貓過敏患者顯示出針對該強變應原的IgE抗體(vanRee, R.等人(1999) J.Allergy Clin Immunol 104，1223-1230)。Fel dl是35_39k Da的酸性糖蛋白，含有10-20%的N-連接的碳水化合物，存在于貓的毛皮、唾液和淚腺中。它是由兩個非共價連接的異二聚體形成的。每一個異二聚體由一個70個殘基的肽(稱為“鏈I”)和一個78、85、90或92個殘基的肽(稱為“鏈2”)組成，這兩個肽由單獨的基因編碼(參見，Duffort，0.A.等(1991)Mol Immunol28, 301-309 ；Morgenstern,J.P.等(1991)Proc Natl Acad Sci USA88,9690-9694 和 Griffith,1.J.等(1992)Gene 113,263-268)。當前對貓過敏患者的治療是通過脫敏療法，包括重復注射劑量逐漸提高的貓毛皮屑粗提物或由Fel dl衍生的短肽。Lilja等人和Hedlin等人公開了一種脫敏程序，在此過程中給予貓過敏患者貓毛皮屑粗提物(Lil ja, Q,等(1989) J Allergy Clin Immunol83,37-44 和 Hedlin 等(1991) J Allergy Clin Immunol87，955-964)。該程序至少需要兩到三年，而患者在三年治療后仍然具有全身癥狀。使用由Fel dl衍生的短肽進行脫敏在肽治療組和安慰劑組之間沒有獲得顯著性差異(01dfield，W.L.等(2002) Lancet 360，47_53)。只在給予患者大量(750 μ g)短肽時才觀察到效力(Norman, P.S.等(1996) Am J ReSpir CritCare Medl54,1623-1628)。
在貓毛皮屑粗提物治療和短肽治療中都曾經報道了變應性副作用，如延遲哮喘反應。因此，由于注射變應原引起的過敏性休克對于任何脫敏程序都是重要的安全性問題。然而，通過減少變應原的注射量來避免這種效應也降低了治療的效力或延長了治療。因此，在貓變態(tài)反應治療領域非常需要替代的脫敏方案，特別是能夠減少變應性癥狀而不引發(fā)變應性副反應的脫敏方案。

發(fā)明內容
現(xiàn)在，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，分別包含至少一種本發(fā)明的Fel dl抗原或其片段的本發(fā)明的組合物和疫苗不僅能夠誘導針對Fel dl的免疫應答，特別是抗體應答，而且能夠使患有貓變態(tài)反應的患者脫敏，從而特別是在短期內分別指示本發(fā)明的組合物和疫苗的高效力。另外，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的Fel dl當與本發(fā)明的VLP共價連接時，與未與VLP共價連接的本發(fā)明的Fel dl相比，具有顯著降低的過敏活性，同時保持高度的抗原性和免疫原性。與現(xiàn)有技術的貓變態(tài)反應治療相比，這是非常有利的，因為本發(fā)明的組合物和疫苗分別顯著減少了在被免疫的動物和人中引起過敏性休克的危險。此外，本發(fā)明的組合物和疫苗分別允許給予抗原的劑量大大高于現(xiàn)有技術的貓變態(tài)反應治療，這又可以提高效力和/或縮短整個脫敏程序。因此，本發(fā)明的組合物和疫苗分別誘導強抗-Fel dl免疫應答，但是不引發(fā)變態(tài)反應。因此，在第一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含:(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一 附著位點和所述至少一個第二附著位點共價連接，優(yōu)選形成有序且重復的抗原陣列。在另一個方面，本發(fā)明提供一種疫苗組合物。而且，本發(fā)明提供一種給對貓、優(yōu)選對貓Fel dl過敏的人或非人哺乳動物如狗施用該疫苗組合物的方法。在一個優(yōu)選實施方案中，疫苗組合物還含有至少一種佐劑。然而，本發(fā)明的疫苗組合物在不存在至少一種佐劑的情況下能夠誘導強免疫應答，特別是抗體應答。因此，在一個優(yōu)選實施方案中，該疫苗不含佐劑。避免使用佐劑可以減少可能發(fā)生的與使用佐劑有關的副作用。在一個優(yōu)選實施方案中，組合物和疫苗組合物中包含的VLP分別在宿主中重組產生，并且該VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選不含宿主核酸。有利的是減少或者優(yōu)選消除宿主的量，優(yōu)選不含宿主核酸，以避免不希望的T細胞應答以及其它不希望的副作用，如發(fā)熱。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物還含有至少一種免疫刺激物，優(yōu)選至少一種免疫刺激性核酸。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激性核酸包裝在本發(fā)明的VLP內。使免疫刺激物、優(yōu)選免疫刺激性核酸包含在本發(fā)明的組合物內可以使免疫應答轉向Thl應答，由此抑制Th2應答，從而抑制IgE的產生。一方面，本發(fā)明提供一種治療貓變態(tài)反應的方法，該方法包括給貓過敏者，優(yōu)選人，分別施用本發(fā)明的組合物或疫苗。在另一方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的組合物和可接受的藥物載體的藥物組合物。再另一方面，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的組合物的方法，包括:(a)提供具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒；(b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段；和(c)將所述核心顆粒與所述至少一種抗原相組合，產生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述核心顆粒通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。在一個方面，本發(fā)明提供一種Fel dl融合蛋白，其包含通過氨基酸間隔區(qū)融合的Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2，所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，其中所述氨基酸間隔區(qū)由具有10-30個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，并且其中所述融合蛋白是在大腸桿菌中產生的，或者其中所述融合蛋白是未被糖基化的。本發(fā)明特別地涉及以下方面:1.一種組合物，其包含:(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒，(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點共價連接。2.第I項所述的組合物，其中所述Fel dl蛋白包含F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2，其中所述Fel dl的鏈I與Fel dl的鏈2通過至少一個共價鍵聯(lián)接。3.第I或2項所 述的組合物，其中所述Fel dl蛋白是包含F(xiàn)el dl的鏈I和Feldl的鏈2的融合蛋白，其中所述Fel dl的鏈I與Fel dl的鏈2通過一個肽鍵直接融合或者通過間隔區(qū)融合，該間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端。4.第3項所述的組合物,其中所述Fel dl蛋白的鏈2通過其C末端與所述Fel dl的鏈I的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。5.第3項所述的組合物,其中所述Fel dl蛋白的鏈I通過其C末端與所述Fel dl的鏈2的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。6.第3-5項中任意一項所述的組合物，其中所述間隔區(qū)由具有1-20個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。7.第3-6項中任意一項所述的組合物，其中所述融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:24 ；(b)SEQ ID NO:54 ；(c)SEQ ID NO: 55 ;(d) SEQ ID NO: 56 ;和(e) SEQ ID NO: 57。8.第3-6項中任意一項所述的組合物，其中所述Fel dl蛋白的鏈I包含SEQ IDNO:22的序列或其同源序列，其中所述同源序列與SEQ ID NO:22具有大于80%，優(yōu)選大于90 %，或更優(yōu)選大于95 %的同一性。9.第3-6項中任意一項所述的組合物，其中所述Fel dl蛋白的鏈2包含SEQ IDNO: 23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO:26的序列或其同源序列，其中所述同源序列與SEQ IDNO:23,SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26具有大于80%，優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95%的同一I"生。10.前述各項中任一項的組合物，其中所述核心顆粒是病毒顆粒，并且其中優(yōu)選地所述病毒顆粒是RNA噬菌體的病毒顆粒。11.第1-9項中任一項所述的組合物，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒，并且其中優(yōu)選地所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒。12.第10或11項所述的組合物，其中所述RNA噬菌體選自Q β、fr、GA或AP205。13.前述各項中任一項所述的組合物，其中所述第一附著位點包含或者優(yōu)選是氨基，優(yōu)選賴氨酸的氨基。14.前述各項中任一項所述的組合物，其中所述第二附著位點包含或者優(yōu)選是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。15.前述各項中任一項所述的組合物，其還包含連接體。16.第15項所述的組合物，其中所述連接體與所述Fel dl蛋白的C末端融合或者與所述Fel dl片段的C末端融合。17.一種疫苗，其包含第1-16項中任一項的組合物。18.第17項的疫苗，其還包含至少一種佐劑。19.一種藥物組合物，其包含:(a)第1- 16中任一項的組合物；和(b)可接受的藥物載體。20.一種制備第1-16項中任一項的組合物的方法，包括:(a)提供具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒；(b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段；和(C)將所述核心顆粒與所述至少一種抗原連接，產生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述核心顆粒通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。21.第1-16項中任一項的組合物在制備治療貓變態(tài)反應的藥物中的用途。22.一種治療貓變態(tài)反應的方法，包括給人或非人哺乳動物施用第1-16項中任一項的組合物或第17-18項中任一項的疫苗，其中優(yōu)選地所述非人哺乳動物是狗或貓。23.在治療貓變態(tài)反應的方法中使用的第1-16項中任一項的組合物或第17_18項中任一項的疫苗，所述方法包括給人或非人哺乳動物施用所述組合物或所述疫苗，其中優(yōu)選地所述非人哺乳動物是狗或貓。24.一種Fel dl融合蛋白，其包含通過氨基酸間隔區(qū)融合的Fe Idl的鏈I和Feldl的鏈2，所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，其中所述氨基酸間隔區(qū)由具有10-30個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，并且其中所述融合蛋白不是包含SEQ ID NO:22的鏈I通過(GGGGS) 3與SEQ ID NO:23、25或26的鏈2的N末端融合的融合蛋白，并且其中所述排除的融合蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達。25.第24項所述的Fel dl融合蛋白，其中所述間隔區(qū)由具有2、3或4次GGGGS重復的氨基酸序列組成。26.第24或25項所述的Fel dl融合蛋白，其中所述Fel dl融合蛋白在大腸桿菌
中產生。27.第24-26項中任一項所述的Fel dl融合蛋白，其中Fel dl的鏈2位于融合蛋白的N末端。28.第24-26項中任一項所述的Fel dl融合蛋白，其中Fel dl的鏈I位于融合蛋白的N末端。29.第24-28項中任一項所述的Fel dl融合蛋白，其包含選自下組的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:54 ；(b) SEQ ID NO: 55 ;和(c)SEQ ID NO: 57。30.一種包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的Fel dl融合蛋白，其中所述Fel dl蛋白在大腸桿囷中廣生。


圖1顯示在SDS-PAGE非還原凝膠上考馬斯藍染色的純化的和復性的Fel dl融合蛋白。泳道I中的樣品含有DTT作為還原劑。泳道2中的樣品不含DTT。

圖2顯示了單獨的Fel dl融合蛋白或與QP偶聯(lián)的Fel dl融合蛋白引起的嗜堿性粒細胞的脫粒。X軸代表相應的Fel dl蛋白的濃度。Y軸代表已經脫粒的嗜堿性粒細胞的百分比。圖3顯示在第0、7、14天接受Q β -FELDl的貓過敏志愿者的皮膚穿刺試驗結果，該試驗也在第0、14、21天進行。圖4Α顯示在第0、7、14天接受Q β -FELDl的貓過敏志愿者的鼻劑量增加得分和鼻總得分(圖4Β)，該試驗也在第0、14、21天進行。發(fā)明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術和科技術語與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的通常理解具有相同的含義。佐劑:本文使用的術語“佐劑”是指免疫應答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產生儲庫(depot)的物質，當分別與本發(fā)明的疫苗和藥物組合物組合時可以產生更強的免疫應答。有多種佐劑可以使用。例子包括弗氏完全和不完全佐劑、氫氧化鋁和修飾的胞壁酰二肽。其它佐劑包括無機礦物凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油狀乳劑、匙孔蟲戚血藍蛋白、二硝基酚，以及潛在的可用于人的佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。這些佐劑在本領域中公知。能夠與本發(fā)明的組合物一起施用的其它佐劑包括但不限于:單磷酰脂質免疫調節(jié)劑、AdjuVax100a、QS-21、QS-18、CRL1005、鋁鹽(明礬)、MF-59、0M-174、0M-197、0M-294 和病毒體佐劑技術。佐劑也可包括這些物質的混合物。VLP通常被描述為佐劑。然而，在本申請中使用的術語“佐劑”是指這樣一種佐劑，它不是用于本發(fā)明組合物的VLP，而是除所述VLP以外的佐劑。
抗原:本文所用的術語“抗原”指如果被MHC分子呈遞，則能夠被抗體或T細胞受體(TCR)結合的分子。本文所用的術語“抗原”也包括T細胞表位。抗原還能夠被免疫系統(tǒng)識別，以及/或者能夠誘導體液免疫應答和/或細胞免疫應答，導致B和/或T淋巴細胞的活化。然而，至少在某些情況下，這可能需要抗原含有Th細胞表位或者連接于Th細胞表位上，并且包含于佐劑中。一個抗原可能包含一個或多個表位(B和T表位)。上面提到的特異性反應表示抗原優(yōu)選地一般以高選擇性方式與其相應的抗體或TCR反應，而不與可能由其它抗原誘導的其它許多抗體或TCR反應。本文所用的抗原也可以是幾種不同抗原的混合物?？乖晕稽c:術語“抗原性位點”和術語“抗原性表位”在本文中可以互換使用，是指多肽的連續(xù)或不連續(xù)的部分，它可以被抗體或在MHC分子環(huán)境內被T細胞受體免疫特異性地結合。免疫特異性結合不包括非特異性結合，但是不一定排除交叉反應性。抗原性位點在對于該抗原性位點而言獨特的空間構象中一般包含5-10個氨基酸。聯(lián)接的(associated):本文所用的術語“聯(lián)接的”(或其名詞:聯(lián)接)是指所有可能的方式，優(yōu)選化學相互作用，通過這種方式，兩個分子聯(lián)接在一起。化學相互作用包括共價和非共價的相互作用。非共價相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基于共價鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。第一附著位點:本文所用的短語“第一附著位點”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一種元件，第二附著位點可與之連接。第一附著位點可以是蛋白質、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學反應基如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨酰基或其組合。作為第一附著位點的化學反應基的一個優(yōu)選的實施方案是氨基酸如賴氨酸的氨基。第一附著位點一般位于VLP的表面上，優(yōu)選位于VLP的外表面上。多個第一附著位點一般以重復構型存在于病毒樣顆粒的表面上，優(yōu)選外表面上。在一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點與VLP通過至少一個共價鍵，優(yōu)選通過至少一個肽鍵聯(lián)接。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點自然存在于VLP中?？商娲?，在一個優(yōu)選的實施方案中，第一附著位點被人工添加到VLP上。第二附著位點:本文使用的短語“第二附著位點”是指天然存在于或者人工添加到本發(fā)明的Fel dl上的一種元件，第一附著位點可以與之連接。本發(fā)明的Fel dl的第二附著位點可以是蛋白質、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次級代謝物或化合物(生物素、熒光素、視黃醇、洋地黃毒苷、金屬離子、苯甲基磺酰氟)、或化學反應基例如氨基、羧基、巰基、羥基、胍基、組氨?；?、或其組合。作為第二附著位點的化學反應基的一個優(yōu)選的實施方案是巰基，優(yōu)選氨基酸半胱氨酸的巰基。因此術語“具有至少一個第二附著位點的本發(fā)明的Fel dl”是指包含本發(fā)明的Fel dl和至少一個第二附著位點的構建體。但是，特別是對于非天然存在于本發(fā)明的Fel dl內的第二附著位點來說，這種構建體典型且優(yōu)選地還含有“連接體 ”。在另一個優(yōu)選的實施方案，第二附著位點與本發(fā)明的Fel dl通過至少一個共價鍵，優(yōu)選通過至少一個肽鍵聯(lián)接。在另一個實施方案中，第二附著位點自然存在于本發(fā)明的Fel dl內。在另外一個優(yōu)選的實施方案中，通過連接體將第二附著位點人工添加到本發(fā)明的Fel dl上，其中該連接體包含半胱氨酸或者由半胱氨酸組成。優(yōu)選地，連接體與本發(fā)明的Fel dl通過肽鍵融合。外殼蛋白:本申請中的術語“外殼蛋白”和可互換使用的術語“衣殼蛋白”是指能夠摻入病毒衣殼或VLP內的病毒蛋白質，優(yōu)選病毒(優(yōu)選RNA噬菌體)的天然衣殼的亞單位。本發(fā)明的Fel dl:本文使用的術語“本發(fā)明的Fel dl”是指至少一種Fel dl蛋白或至少一種Fel dl片段。Fel dl的鏈1:本文使用的術語“Fel dl的鏈I”是指包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列或其同源序列或由該序列組成的多肽。本文使用的術語“SEQ ID N0:22的同源序列”是指與SEQ ID NO:22具有大于70%，優(yōu)選大于80%，更優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95%的同一性的多肽。本文所用的術語“Fel dl的鏈I”應當還包括含有至少一個翻譯后修飾的多肽，這種修飾包括但不限于本文定義的Fel dl的鏈I的至少一個糖基化。優(yōu)選地，本文定義的Fel dl的鏈I由總共最多130個、更優(yōu)選最多100個氨基酸組成。Fel dl的鏈2:本文使用的術語“FeI dl的鏈2”是指包含SEQ ID NO:23,SEQ IDNO:25或SEQ ID NO:26的氨基酸序列或其同源序列或由該序列組成的多肽。本文使用的術語“SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:26 的同源序列”是指與 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有大于70%，優(yōu)選大于80%，更優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95%的同一性的多肽。本文所用的術語“Fel dl的鏈2”應當還包括含有至少一個翻譯后修飾的多肽，這種修飾包括但不限于本文定義的Fel dl的鏈2的至少一個糖基化。優(yōu)選地，本文定義的Fel dl的鏈2由總共最多150個、更優(yōu)選最多130個、更優(yōu)選最多100個氨基酸組成。Fel dl蛋白:本文使用的術語“Fel dl蛋白”是指包含F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2或者由其組成的蛋白質。優(yōu)選地，F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2共價連接。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2通過至少一個二硫鍵連接。在另一個優(yōu)選實施方案中，鏈I和鏈2直接融合或者通過間隔區(qū)融合，在后一種情況下，所述Fel dl蛋白還包含或者由間隔區(qū)組成。優(yōu)選地，本文定義的Fel dl蛋白由總共最多300個、更優(yōu)選最多200個氨基酸組成。典型且優(yōu)選地，本發(fā)明的Fel dl蛋白能夠在體內誘導產生與天然存在的Fel dl或與按照本發(fā)明實施例5制備的重組Fel dl特異性結合的抗體。Fel dl片段:本文使用的術語“Fel dl片段”是指包含或者由Fel dl的至少一個抗原性位點組成的多肽。典型且優(yōu)選地，本文使用的術語“Fel dl片段”是指包含或者由Fel dl的至少兩個抗原性位點組成的多肽。優(yōu)選地，這些抗原性位點共價連接，進一步優(yōu)選地，這些抗原性位點通過至少一個肽鍵連接，在這種情況下，在抗原性位點之間可能需要間隔區(qū)。優(yōu)選地，該至少兩個抗原性位點來源于Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2兩者。優(yōu)選地，本文定義的Fel dl片段由總共最多130個、更優(yōu)選最多100個、再更優(yōu)選60個氨基酸組成。典型且優(yōu)選地，F(xiàn)el dl片段能夠在體內誘導產生與天然存在的Fel dl或與按照本發(fā)明實施例5制備的重組Fel dl特異性結合的抗體。連接的:本文所用的術語“連接的”(或其名詞:連接)是指所有可能的方式，優(yōu)選化學相互作用，通過這種方式，至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點連接在一起?；瘜W相互作用包括共價和非共價的相互作用。非共價相互作用的典型例子是離子相互作用、疏水相互作用或氫鍵，而共價相互作用例如基于共價鍵如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷鍵、碳-硫鍵如硫醚或酰亞胺鍵。在某些優(yōu)選實施方案中，第一附著位點和第二附著位點通過至少一個共價鍵連接，優(yōu)選通過至少一個非肽鍵連接，更優(yōu)選只通過非肽鍵連接。然而，本文所用的術語“連接”應當不僅包括至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點的直接連接，而且可替代地并且優(yōu)選地，包括至少一個第一附著位點和至少一個第二附著位點通過中間分子的間接連接，典型且優(yōu)選地通過使用至少一個，優(yōu)選一個異雙功能交聯(lián)劑連接。連接體:本文所用的“連接體”將第二附著位點與本發(fā)明的Fel dl聯(lián)接，或者已經包含第二附著位點、基本由、或者由第二附著位點組成。優(yōu)選地，本文所用的“連接體”已經包含第二附著位點，典型且優(yōu)選地-但不是必需地-為一個氨基酸殘基，優(yōu)選半胱氨酸殘基。本文所用的“連接體”也被稱為“氨基酸連接體”，特別是當本發(fā)明的連接體含有至少一個氨基酸殘基時。因此，術語“連接體”和“氨基酸連接體”在本文中可以交換使用。然而，這并不意味著這種連接體僅由氨基酸殘基組成，即使由氨基酸殘基組成的連接體是本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案。連接體的氨基酸殘基優(yōu)選由本領域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物組成。本發(fā)明的連接體的進一步優(yōu)選的實施方案是包含巰基或半胱氨酸殘基的分子，這些分子因此也包括在本發(fā)明中?？捎糜诒景l(fā)明的其他連接體有包含C1-C6烷基_、環(huán)烷基如環(huán)戊基或環(huán)己基、環(huán)烯基、芳基或雜芳基部分的分子。而且，優(yōu)選包含C1-C6烷基_、環(huán)烷基-(C5，C6)、芳基-或雜芳基-部分和另外的氨基酸的連接體也可以用作本發(fā)明的連接體，并且包括在本發(fā)明的范圍內。連接體與本發(fā)明的Fel dl優(yōu)選通過至少一個共價鍵，更優(yōu)選通過至少一個肽鍵聯(lián)接。有序且重復的抗原陣列:本文所用的術語“有序且重復的抗原陣列”通常是指抗原的重復模式，或者其特征在于抗原相對于病毒樣顆粒的空間排列具有典型且優(yōu)選地高度的均一性。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種重復模式可以是幾何模式。本發(fā)明的某些實施方案，例如與RNA噬菌體的VLP偶聯(lián)的抗原，是合適的有序且重復的抗原陣列的典型且優(yōu)選的實例，其具有嚴格重復的類晶體抗原排列，優(yōu)選間隔1-30納米，優(yōu)選2-15納米，更優(yōu)選2-10納米,更優(yōu)選2-8納米,進一步更優(yōu)選1.6-7納米。包裝的:本文所用的術語“包裝的”是指聚陰離子大分子或免疫刺激物相對于VLP的狀態(tài)。本文所用的術語“包裝”包括結合，該結合可以是共價的，例如化學偶聯(lián)，也可以是非共價的，例如離子相互作用、疏水相互作用、氫鍵等。該術語也包括聚陰離子大分子的包封或部分包封。因此，聚陰離子大分子或免疫刺激物可以被VLP包封，而不需存在實際上的結合，特別是共價結合。在優(yōu)選的實施方案中，至少一個聚陰離子大分子或免疫刺激物被包裝在VLP內，最優(yōu)選地以非共價的方式包裝。間隔區(qū):術語“間隔區(qū)”以及其等同使用的術語“氨基酸間隔區(qū)”是指一段氨基酸序列，它不超過30個氨基酸，并且連接Fel dl的一條鏈的N末端與另一條鏈的C末端。病毒顆粒:本文使用的術語“病毒顆?！笔侵覆《镜男螒B(tài)學形式。在某些病毒類型中，它包含由蛋白質衣殼圍繞的基因組；另外一些具有另外的結構(例如被膜、尾等)。本文使用的病毒樣顆粒(VLP)是指非復制性或非傳染性的，優(yōu)選非復制性且非傳染性的病毒顆粒，或者是指非復制性或非傳染性的，優(yōu)選非復制性且非傳染性的類似于病毒顆粒優(yōu)選病毒衣殼的結構。本文使用的術語“非復制性”是指不能復制VLP所含的基因組。本文使用的術語“非傳染性”是指不能進入宿主細胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的病毒樣顆粒是非復制性和/或非傳染性的，因為它缺乏全部或部分的病毒基因組或基因組功能。在一個實施方案中，病毒樣顆粒是其中病毒基因組已經被物理或化學滅活的病毒顆粒。典型且更優(yōu)選地，病毒樣顆粒缺少病毒基因組的全部或部分復制性和傳染性部分。本發(fā)明的病毒樣顆?？赡芎信c其基因組不同的核酸。本發(fā)明的病毒樣顆粒的一個典型且優(yōu)選的實施方案是病毒衣殼，如相應病毒、曬菌體，優(yōu)選RNA曬菌體的病毒衣殼。術語“病毒衣殼”或“衣殼”是指由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配體。典型地，有60、120、180、240、300、360個和360個以上的病毒蛋白亞單位。典型且優(yōu)選地，這些亞單位的相互作用導致形成具有固有的重復組織的病毒衣殼或病毒衣殼樣結構，其中所述結構一般是球形或管狀。例如，RNA-噬菌體或HBcAg的衣殼具有二十面體對稱的球形結構。本文使用的術語“衣殼樣結構”是指類似于以上定義的衣殼形態(tài)、但是不同于典型的對稱裝配體、而同時保持充分的有序性和重復性程度的由病毒蛋白質亞單位組成的大分子裝配體。病毒顆粒和病毒樣顆粒的一個共同特征是其高度有序且重復的亞單位排列。RNA噬菌體的病毒樣顆粒:本文使用的術語“RNA噬菌體的病毒樣顆?！笔侵赴琑NA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段或者優(yōu)選基本由其組成或者由其組成的病毒樣顆粒。另外，RNA噬菌體的病毒樣顆粒類似于RNA噬菌體的結構，并且是非復制性或非傳染性的，并且至少缺少編碼RNA噬菌體的復制機制的基因，一般也缺少編碼負責病毒附著或進入宿主的蛋白質的基因。然而，該定義應當也包括上述基因仍然存在但是無活性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒，這樣也可產生非復制性和/或非傳染性的RNA噬菌體的病毒樣顆粒。來源于RNA-噬菌體的優(yōu)選的VLP顯示二十面體對稱，并且由180個亞單位組成。在本申請的公開內容中，術語“亞單位”和“單體”在上下文中可互換并且等同地使用。使RNA噬菌體的病毒樣顆粒成為非復制性和/或非傳染性的優(yōu)選方法是通過物理、化學滅活，如紫外線照射、甲醛處理，典型且優(yōu)選地通過遺傳操作。一種或一個:術語“一種”或“一個”在本申請中使用時，除非另外說明，是指“至少一種(個)”或“一種(個)或一種(個)以上”。多肽的氨基酸序列同一性可以使`用諸如Bestfit程序等已知計算機程序常規(guī)確定。當使用Bestfit或其它任何序列比對程序,優(yōu)選使用Bestfit來確定一種特定序列與參照氨基酸序列是否例如95%相同時，將參數(shù)設置為使得在參照氨基酸序列的全長上計算同一性百分比，并且允許最多占參照序列中氨基酸殘基總數(shù)的5%的同源性缺口。上述測定多肽之間百分同一性的方法適用于本發(fā)明公開的所有蛋白質、多肽或其片段。在本申請中，如果抗體與抗原結合的結合親和力(Ka)為IO6M-1或更高，優(yōu)選ΙΟΙ1或更高，更優(yōu)選IO8M-1或更高，最優(yōu)選IO9M-1或更高，則該抗體被定義為特異性結合。本領域技術人員可以容易地測定抗體的親和力(例如通過Scatchard分析)。本發(fā)明提供本發(fā)明的組合物，其包含:(a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒；和(b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段，并且其中(a)和
(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點共價連接。優(yōu)選地，F(xiàn)eldl蛋白或Fel dl片段與核心顆粒連接，從而形成有序且重復的抗原-VLP陣列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，至少20個，優(yōu)選至少30個，更優(yōu)選至少60個，更優(yōu)選至少120個，進一步更優(yōu)選至少180個Fel dl蛋白或Fel dl片段與核心顆粒連接。
可以選擇本領域公知的任何具有有序且重復的結構的病毒作為本發(fā)明的VLP或病毒顆粒。其外殼或衣殼蛋白能夠用于制備VLP的示例性的DNA或RNA病毒已經在W02004/009124的第25頁第10-21行，第26頁第11-28行，和第28頁第4行到第31頁第4行公開。這些公開的內容在此引入作為參考。病毒或病毒樣顆?？梢詮牟《靖腥镜募毎囵B(yǎng)物中產生和純化。獲得的用于疫苗目的的病毒或病毒樣顆粒優(yōu)選地應當是無復制性或無感染性的，更優(yōu)選無復制性且無感染性的。紫外線照射、化學處理，例如用甲醛或氯仿處理，是本領域技術人員已知用來滅活病毒的常用方法。在一個優(yōu)選實施方案中，核心顆粒是病毒顆粒，并且其中優(yōu)選地所述病毒顆粒是噬菌體的病毒顆粒，并且其中進一步優(yōu)選地所述噬菌體是RNA噬菌體，其中更進一步優(yōu)選地所述RNA噬菌體是選自Q β、fr、GA或AP205的RNA噬菌體。在一個優(yōu)選實施方案中，核心顆粒是VLP。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，VLP是一種重組VLP。幾乎所有公知的病毒都已經被測序，并且可以容易地被公眾獲得。本領域技術人員可以容易地確定編碼外殼蛋白的基因。通過在宿主中重組表達外殼蛋白來制備VLP是本領域技術人員公知的常識。在一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含或者由選自下組的病毒的重組蛋白、其突變體或片段組成:a)RNA卩遼菌體；b)卩遼菌體(bacteriophages) ；c)乙型肝炎病毒,優(yōu)選其衣殼蛋白(Ulrich 等人，Virus Res.50:141-182 (1998))或其表面蛋白(W092/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人，Genel60:173-178(1995)) ;e)辛德畢斯病毒；f)輪狀病毒(US5, 071，651 和 US5, 374，426) ；g) 口蹄疫病毒(Twomey 等人，Vaccinel3:1603-1610，(1995)) ；h)諾沃克病毒(Jiang, X.等人，Science250:1580-1583 (1990) ；Matsui, S.Μ.等人，J.Clin.1nves t.87:1456-1461 (1991)) ；i)甲病毒；j)逆轉錄病毒，優(yōu)選其 GAG 蛋白(W096/30523) ；k)逆轉錄轉座子Ty，優(yōu)選蛋白pi ；1)人乳頭瘤病毒(W098/15631) ；m)多瘤病毒；n)煙草花葉病毒；和ο)禽獸棚病毒。在一個優(yōu)選實施方案中，VLP包含或者由重組蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸序列，優(yōu)選兩種氨基酸序列組成。包含或者由一種以上的氨基酸序列組成的VLP在本申請中被稱為嵌合VLP。本文使用的術語“重組蛋白的片段”或術語“外殼蛋白的片段”被定義為分別為野生型重組蛋白或外殼蛋白長度的至少70%,優(yōu)選至少80%,更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%，并且優(yōu)選保留形成VLP的能力的多肽。優(yōu)選地，該片段通過至少一個內部缺失、至少一個截短或至少一個它們的組合而獲得。術語“重組蛋白的片段”或術語“外殼蛋白的片段”還包括與以上定義的“重組蛋白的片段”或“外殼蛋白的片段”分別具有至少80%，優(yōu)選90 %，更優(yōu)選95 %的氨基酸序列同一性并且優(yōu)選能夠裝配為病毒樣顆粒的多肽。在本發(fā)明中可以交換使用的術語“突變重組蛋白”或術語“重組蛋白突變體”，或者在本發(fā)明中可以交換使用的術語“突變外殼蛋白”或術語“外殼蛋白突變體”，分別是指具有來源于野生型重組蛋白或外殼蛋白的氨基酸序列的多肽，其中該氨基酸序列與野生型序列至少80%，優(yōu)選至少85%、90%、95%、97%或99%相同，并且優(yōu)選地保留裝配為VLP的能力。在一個優(yōu)選實施 方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒是乙型肝炎病毒的病毒樣顆粒。乙型肝炎病毒樣顆粒的制備已經在W000/32227、W001/85208和W002/056905中公開，所有這三篇文獻在這里都引用以作參考。適合在本發(fā)明的實施中使用的HBcAg的其他變體在W002/056905的第34-39頁已經公開。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，將賴氨酸殘基導入HBcAg多肽中，來介導本發(fā)明的Fel dl與HBcAg的VLP的連接。在優(yōu)選的實施方案中，利用包含SEQ ID NO:20的氨基酸1-144、或1-149、1-185或者由該序列組成的HBcAg制備本發(fā)明的VLP和組合物，其中該氨基酸序列被修飾使得第79和80位的氨基酸被替代為具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。這個修飾將SEQ ID N0:20改變?yōu)镾EQ ID NO:21。在進一步優(yōu)選的實施方案中，SEQ ID NO:21或其相應片段(優(yōu)選1-144或1-149)的第48和110位的半胱氨酸殘基被突變?yōu)榻z氨酸。本發(fā)明進一步包括包含具有上述相應氨基酸改變的乙型肝炎核心蛋白突變體的組合物。本發(fā)明進一步包括分別包含HBcAg多肽的組合物和疫苗，該HBcAg多肽包含與SEQ ID NO:21至 少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同的氨基酸序列或者由該序列組成。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌體的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。優(yōu)選地，該RNA噬菌體選自:a)噬菌體
；b)噬菌體R17 ；c)噬菌體fr ；d)噬菌體GA ；e)噬菌體SP ；f)噬菌體MS2 ；g)噬菌體Mil ；h)噬菌體MXl ；i)噬菌體NL95 ；k)噬菌體f2 ；1)噬菌體PP7和m)噬菌體AP205。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段，其中該外殼蛋白具有選自以下序列的氨基酸序列:(a) SEQ ID N0:1;涉及Q β CP ; (b) SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 的混合物(涉及 Q β Al 蛋白)；(c) SEQ ID NO:3 ；
(d)SEQ ID NO:4 ； (e) SEQ ID NO:5 ； (f) SEQ ID NO:6 ； (g) SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7 的混合物；(h) SEQ ID NO:8 ；⑴ SEQ ID NO:9 ； (j) SEQ ID NO:10 ; (k) SEQ ID NO:11 ； (I) SEQID NO:12 ； (m)SEQ ID NO:13 ;和(n) SEQ ID NO:14。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌體的外殼蛋白、其突變體或片段的一種以上的氨基酸序列，優(yōu)選兩種氨基酸序列，或者由該氨基酸序列組成。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，VLP包含或者由RNA噬菌體的兩種不同的外殼蛋白組成，所述兩種外殼蛋白具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的病毒樣顆粒包含或者基本由或者由RNA噬菌體Qi3、fr、AP205或GA的重組外殼蛋白、其突變體或片段組成。在一個優(yōu)選的實施方案中，VLP是RNA噬菌體的VLP，優(yōu)選RNA噬菌體Q β、fr、AP205或GA的VLP。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的VLP是RNA噬菌體Q β的VLP。Qi3的衣殼或病毒樣顆粒顯示為二十面體噬菌體樣衣殼結構，直徑為25nm，T = 3半對稱。該衣殼含有180個拷貝的外殼蛋白，它們通過二硫鍵連接為共價五聚體和六聚體(Golmohammadi R.等人，Structure4:543-5554(1996)),使QP衣殼具有顯著的穩(wěn)定性。然而，由重組QP外殼蛋白構成的衣殼或VLP可能含有不通過二硫鍵與衣殼內的其它亞單位連接的或不完全連接的亞單位。我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，高達30%的DMSO和乙腈濃度和高達IM的胍鹽濃度不影響衣殼的穩(wěn)定性。的衣殼或VLP的高穩(wěn)定性是一個有利的特征，特別是對于根據(jù)本發(fā)明免疫和接種哺乳動物和人的用途而言。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的RNA噬菌體、特別是Qi3和fr的病毒樣顆粒，已經在W002/056905中公開，其公開內容在此引用作為參考。特別地，W002/056905的實施例18給出了由QP制備VLP顆粒的詳細描述。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的VLP是RNA噬菌體AP205的VLP。在本發(fā)明的實踐中也可以使用AP205VLP的能夠裝配的突變形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置換為蘇氨酸的AP205外殼蛋白，導致本發(fā)明的其他優(yōu)選的實施方案。W02004/007538，特別是在實施例1和實施例2中，描述了如何獲得包含AP205外殼蛋白的VLP，以及特別是其表達和純化。W02004/007538在此引入作為參考。AP205VLP具有高度免疫原性，可以與本發(fā)明的Fel dl連接，典型且優(yōu)選地產生展示以重復方式定向的本發(fā)明的Fel dl的疫苗構建體。產生了針對這樣展示的本發(fā)明的Fel dl的高抗體效價，這表明連接的本發(fā)明的Fel dl容易與抗體分子相互作用，并且具有免疫原性。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的VLP包含或者由病毒、優(yōu)選RNA曬菌體的突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過刪除而除去至少一個賴氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的VLP包含或者由病毒、優(yōu)選RNA噬菌體的突變外殼蛋白組成，其中通過置換和/或通過插入而添加至少一個賴氨酸殘基，從而修飾了該突變外殼蛋白。至少一個賴氨酸殘基的刪除、置換或添加可以改變偶聯(lián)程度，即病毒、優(yōu)選RNA噬菌體的每個VLP亞單位上本發(fā)明的Fel dl的量，特別是，用來滿足和適應疫苗的要求。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。本文所用的術語“抗原密度”是指VLP、優(yōu)選RNA噬菌體的VLP的每個亞單位上、優(yōu)選每個外殼蛋白上連接的本發(fā)明的Fel dl的平均數(shù)。因此，該值可以計算為在本發(fā)明的組合物或疫苗中VLP、優(yōu)選RNA噬菌體的VLP的所有亞單位或單體上的平均數(shù)。外殼蛋白的VLP或衣殼在其表面上展示數(shù)量確定的賴氨酸殘基，具有3個賴氨酸殘基指向衣殼內部并與RNA相互作用，而另外4個賴氨酸殘基暴露于衣殼外部的確定的拓撲學。優(yōu)選地，至少一個第一附著位點是指向或位于VLP外部的賴氨酸殘基。其中暴露的賴氨酸殘基被置換為精氨酸的Qi3突變體可以用于本發(fā)明。因此，在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含突變Q3外殼蛋白、基本由或由突變
外殼蛋白組成。優(yōu)選地，這些突變外殼蛋白包含或者由選自下組的氨基酸序列組成:a)Q β -240 (SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO:1 的 Lysl3_Arg) ；b) Q β -243 (SEQ ID NO:16, SEQ IDNO:1 的 AsnlO-Lys) ；c) Q β -250 (SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:1 的 Lys2_Arg) ；d) Q β-251 (SEQID NO:18, SEQ ID NO:1 的 Lysl6_Arg) jPe)Q0_259" (SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:1 的Lys2-Arg, Lysl6_Arg)。上述Qi3突變外殼蛋白、突變Qi3外殼蛋白VLP和衣殼的構建、表達和純化分別在W002/056905中描述。特別參考上述申請的實施例18。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由QP的突變外殼蛋白、或其突變體或片段和相應的Al蛋白組成。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，病毒樣顆粒包含或者基本由或者由具有氨基酸序列SEQ ID NO:15、16、17、18或19的突變外殼蛋白和相應的Al蛋白組成。其它一些RNA噬菌 體外殼蛋白在細菌宿主中表達時也顯示自裝配(Kastelein，RA.等人，Gene23:245-254 (1983)，Kozlovskaya, TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR287:452-455(1986)，Adhin, MR.等人，Virologyl70:238-242 (1989)，Priano, C.等人，J.Mol.Biol.249:283-297 (1995))。特別是已經公開了 GA (Ni，CZ，等人，Protein Sc1.5:2485-2493 (1996)，Tars，K 等人，J.Mol.Biol.271:759-773(1997))和 fr (Pushko P.等人，Prot.Eng.6:883-891 (1993)，Lil jas，L等人.J Mol.Biol.244:279-290, (1994))的生物學和生化性質。幾種RNA卩遼菌體的晶體結構已經確定(Golmohammadi, R.等人，Structure4:543-554 (1996))。利用這些信息，能夠確定表面暴露的殘基，從而能夠修飾RNA噬菌體的外殼蛋白，以便可以通過插入或置換方式插入一個或多個反應性氨基酸殘基。來源于RNA噬菌體的VLP的另一個優(yōu)點是它們在細菌中的高表達產率，這允許以可承受的成本產生大量的物質。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物包含至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白包含或者由天然存在的Fel dl組成。鏈I的一級結構是SEQ ID N022的序列。報道的鏈I的變體是Lys29_Arg或Asn、Val33_Ser、Val60-Leu。鏈2的一級結構是SEQ ID N023、25或26的序列。報道的鏈2的變體是SEQ IDNO:23,25 或 26 的 Cys7_Phe、Phel5_Thr、Asnl9_Ser、Gly20_Leu、Ile55_Val、Arg57_Lys、Val58-Phe。鏈 2 的其他變體有 SEQ ID NO:25 的 Glu69_Val、Tyr70_Asp、Met72_Thr、Gln-77-Glu 和 Asn86-Lys ；SEQ ID NO:23 的 Met74-Thr、Gln79_Glu 和 Asn88_Lys (Griffith1.J.等人，Genel 13:263-268 (1992) ；Morgenstern J.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.88:9690-9694 (1991).Duffort 0.A.，等人 Mol.1mmunol.28:301-309 (1991);Leitermann K.,等人，J.Allergy Clin.Tmmunol.74:147-153 (1984) ；Kristensen, A.K,等人.(1997)Biol Chem378，899-908)。天然存在的Fel dl通過從(例如)貓唾液、貓毛皮屑、貓所生活的房間的屋塵等中純化獲得。在一個優(yōu) 選實施方案中，本發(fā)明的Fel dl是重組Fel dl蛋白或重組Fel dl片段。本文使用的重組Fel dl蛋白或重組Fel dl片段是指通過包括重組DAN技術的至少一個步驟的方法獲得的Fel dl蛋白或Fel dl片段。術語“重組Fel dl蛋白或重組Fel dl片段”和“重組產生的Fel dl蛋白或重組產生的Fel dl片段”在本文中可以互換使用，應當具有相同的含意。重組Fel dl蛋白或片段可以在原核表達系統(tǒng)例如大腸桿菌(W02004/094639)或真核表達系統(tǒng)如桿狀病毒(W000/20032)中產生。Sepp注I注等人公開了在桿狀病毒中通過雙順反子啟動子同時表達Fel dl的鏈I和鏈2 (J.Biol.Chem.Nov，2004)。重組產生的Fel dl蛋白或片段可以是糖基化或非糖基化的，這取決于用來產生重組蛋白的宿主細胞。在一個實施方案中，重組Fel dl蛋白包含或者由Fel dl蛋白的鏈I和Fel dl蛋白的鏈2組成，其中所述Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2僅通過非共價鍵如疏水相互作用聯(lián)接。在一個優(yōu)選實施方案中，重組Fel dl蛋白包含或者由Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2組成，其中所述Fel dl的鏈I與Fel dl的鏈2通過至少一個共價鍵聯(lián)接。在一個優(yōu)選實施方案中，至少一個共價鍵是非肽鍵，其中所述非肽鍵是二硫鍵，或者其中優(yōu)選地所述非肽鍵是二硫鍵。例如，F(xiàn)eldl的鏈I和Fel dl的鏈2可以分開表達，然后在允許正確形成二硫鍵的條件下組合在一起，例如通過改組(reshuffling)法?？商娲?Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2可以在一個宿主中同時表達，例如通過將編碼Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2的基因分別克隆到一個質粒中處于兩個啟動子之下。在真核表達系統(tǒng)中，F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2可以轉錄為一個mRNA，并且由內部核糖體進入位點(IRES)分開翻譯。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白包含或者由融合蛋白組成，其中所述融合蛋白包含F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2。在一個優(yōu)選實施方案中，所述Fel dl的鏈I和所述Fel dl的鏈2直接融合或者通過一個肽鍵融合，該肽鍵連接一條鏈的N末端和另一鏈的C末端。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述Fel dl的鏈I和所述Fel dl的鏈2通過間隔區(qū)融合，該間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一鏈的C末端。優(yōu)選地所述間隔區(qū)具有1-30個、優(yōu)選1-25個、優(yōu)選1-20個、優(yōu)選1-15個、優(yōu)選1-9個、優(yōu)選1_5個、優(yōu)選1_3個氨基酸?？商娲?，所述間隔區(qū)具有10-30個、優(yōu)選10-25個、更優(yōu)選10-20個、更優(yōu)選13-20個、更優(yōu)選15-20個、更優(yōu)選13-17個、更優(yōu)選15-17個氨基酸。優(yōu)選地，所述間隔區(qū)由具有10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選實施方案中，所述間隔區(qū)具有15個氨基酸。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述間隔區(qū)是(GGGGS)315在一個優(yōu)選實施方案中，融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:(a)SEQ ID NO:24 ； (b) SEQ ID NO:54 ； (c) SEQ ID NO:55 ； (d) SEQ ID NO:56 ;和(e) SEQ ID NO:57。在一個優(yōu)選實施方案中，所述Fel dl的鏈2通過其C末端與所述Fel dl的鏈I的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述Fel dl蛋白包含或者由SEQ ID NO:24的氨基酸序列組成。W02004/094639公開了分子和生物學性質類似于天然對應物的重組折疊的Feldl，并且具體公開了編碼Fel dl鏈2的N末端與鏈I直接融合的融合體的合成基因。大腸桿菌表達產生非共價聯(lián)接的同型二聚體，其表觀分子量根據(jù)大小排阻層析確定為30kDa，每個19177Da的亞單位顯示與在天然Fel dl中發(fā)現(xiàn)的相同的二硫鍵模式，并且天然和重組Fel dl具有相同的折疊。重組Fel dl與天然Fel dl類似地與來自貓過敏患者的血清的IgE反應。因此,該Fel dl融合蛋白模擬天然Fel dl的抗原性。
在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的鏈I通過其C末端與Fel dl的鏈2的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的鏈I包含SEQ ID NO:22的序列或其同源序列，或由該序列組成，其中所述同源序列與SEQ ID NO:22具有大于80%,優(yōu)選大于90%,或更優(yōu)選大于95%的同一性。在一個優(yōu)選實施方案中，所述Fel dl的鏈2包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的序列或其同源序列，或由該序列組成，其中所述同源序列與SEQ ID NO:
23、SEQ ID NO: 25或SEQ ID NO: 26具有大于80%，優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95%的同一性。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白是重組Fel dl蛋白，其中至少一個二硫鍵被破壞，優(yōu)選通過突變、更優(yōu)選通過保守性置換例如Cys置換為Ser而被破壞。在天然Fel dl中已經鑒定了連接兩個肽的三個鏈間二硫鍵，即Cys3 (I) -Cys73 (2)、Cys44 (I) _48Cys (2)和 Cys70(l)-Cys7(2)，提示 Fel dl 肽為反平行方向。(Kristensen，A.K.，等人.(1997) BiolChem378，899-908)。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白的一個這樣的二硫鍵被破壞。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白的兩個這樣的二硫鍵被破壞。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，F(xiàn)el dl蛋白的所有三個這樣的二硫鍵都被破壞。在一個優(yōu)選實施方案中，鏈I的CyS70被刪除或突變。在另一個優(yōu)選實施方案中，該鏈的Cys73被刪除或突變。在一個優(yōu)選實施方案中，所述Fel dl蛋白是包含直接融合或通過間隔區(qū)融合的Fel dl蛋白的鏈I和Fel dl蛋白的鏈2的融合蛋白，其中所有三個這樣的二硫鍵都被破壞。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述Fel dl蛋白包含或者由SEQ ID NO:24、55或57的氨基酸序列組成，其中至少一個、優(yōu)選至少三個、更優(yōu)選至少五個半胱氨酸通過置換或刪除而被除去。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗原包含或者由Fel dl片段組成。眾所周知，具有免疫原性通常不需要全長蛋白質，一個蛋白質通常含有一個以上的抗原性表位，即抗原性位點。一個片段或短肽可能足以含有至少一個可被抗體或MHC分子環(huán)境內的T細胞受體免疫特異性結合的抗原性位點?？乖晕稽c可以通過本領域技術人員公知的大量技術來確定?？梢酝ㄟ^序列比對和結構預測來進行。例如，人們可以使用諸如Rasmol的程序預測可能的α-螺旋、轉角、鏈間和鏈內二硫鍵等。人們可以進一步預測埋藏在分子內的序列或暴露于分子表面的序列。暴露于分子表面的序列更可能含有天然抗原性位點，因此在誘導治療性抗體中有用。在確定表面肽序列后，例如，通過飽和誘變法(如丙氨酸掃描誘變，Cunningham BC,Wells JA.Sciencel989Jun2 ;244(4908):1081-5),可以進一步確定該序列內的抗原性位點。簡要地說，將該序列內的氨基酸一個一個地突變?yōu)楸彼幔浔彼嵬蛔兎謩e顯示與抗體(抗野生型序列)的結合降低或總體喪失結合的氨基酸可能是抗原性位點的成分。測定抗原性位點的另一種方法是產生覆蓋Fel dl全長序列的重疊的肽(Geysen，PNAS Vol 81:3998-4002, (1984)和 Slootstra，J.W.等人，(1996)Mol.Divers.1，87-96)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗原包含或者由至少一個、優(yōu)選至少兩個Feldl表位、進一步優(yōu)選至少一個來源于Fel dl的鏈I的表位和至少一個來源于Fel dl的鏈2的表位組成。Fel dl的T細胞反應性表位已經在整個Fel dl蛋白上作圖，并且已經在現(xiàn)有技術中公開，如US6120769，第14欄第4段，US6025162的第130和131欄，這些公開內容引入本文作為參考。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的T細胞表位選自SEQ ID NO:27_32。

本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明組合物的方法，包括:(a)提供具有至少一個附著位點的VLP ;(b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段；和(c)將所述VLP和所述至少一種抗原相組合，產生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述VLP通過所述第一附著位點和所述第二附著位點連接。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，即Fel dl蛋白或Fel dl片段，是通過表達而實現(xiàn)的，優(yōu)選通過在細菌系統(tǒng)、優(yōu)選在大腸桿菌中表達。為了有利于純化過程，通常添加標簽，如His標簽、Myc標簽。在另一種方法中，特別可以化學合成具有不長于50個氨基酸的Fel dl片段。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，具有至少一個第一附著位點的VLP與具有至少一個第二附著位點的本發(fā)明的Fel dl通過至少一個肽鍵連接。編碼本發(fā)明的Fel dl、優(yōu)選Fel dl片段、更優(yōu)選不長于50個氨基酸，更優(yōu)選不到30個氨基酸的片段的基因，符合讀框地連接到編碼VLP外殼蛋白的基因的內部或優(yōu)選N末端或C末端。本發(fā)明的抗原用于病毒的外殼蛋白、其突變體或片段的實施方案已經在W02004/009124的第62頁第20行至第68頁第17行公開，在此引入作為參考。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl片段與RNA噬菌體AP205的外殼蛋白、其突變體或片段的N末端或C末端融合。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述融合蛋白還包括間隔區(qū)，其中所述間隔區(qū)與AP205的外殼蛋白、其片段或突變體和本發(fā)明的Fel dl融合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，組合物包含或基本由通過至少一個共價鍵連接的具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒和具有至少一個第二附著位點的至少一個本發(fā)明的Fel dl組成，優(yōu)選地該共價鍵是非肽鍵。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，第一附著位點包含或優(yōu)選地是氨基，優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方案中，第二附著位點包含或優(yōu)選地是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。在本發(fā)明的一個非常優(yōu)選的實施方案中，至少一個第一附著位點是氨基，優(yōu)選賴氨酸的氨基，并且至少一個第二附著位點是巰基，優(yōu)選半胱氨酸的巰基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，通過化學交聯(lián)，典型且優(yōu)選地通過使用異雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的Fel dl與VLP連接。在優(yōu)選的實施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有能夠與VLP的優(yōu)選的第一附著位點、優(yōu)選氨基、更優(yōu)選賴氨酸殘基的氨基反應的一個官能團，和能夠與本發(fā)明的Fel dl上固有的或人工添加的優(yōu)選的第二附著位點、即巰基、優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基反應的另一個官能團，任選地該另一個官能團也可通過還原用于反應。有幾種異雙功能交聯(lián)劑在本領域公知。包括優(yōu)選的交聯(lián)劑SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 和例如可從Pierce Chemical Company獲得的、具有一個氨基反應性官能團和一個巰基反應性官能團的其它交聯(lián)劑。上述交聯(lián)劑均導致在與氨基反應后形成酰胺鍵和與巰基反應后形成硫醚鍵。適用于實施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑的特征在于偶聯(lián)時在本發(fā)明的Fel dl與VLP之間引入二硫鍵。屬于這一類的優(yōu)選交聯(lián)劑包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。 在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的組合物還包含連接體。根據(jù)本發(fā)明的公開內容，通過連接優(yōu)選包含至少一個適合作為第二附著位點的氨基酸的連接體，實現(xiàn)向本發(fā)明的Fel dl上構建第二附著位點。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，連接體通過至少一個共價鍵、優(yōu)選通過至少一個、通常一個肽鍵與本發(fā)明的Fel dl連接。優(yōu)選地，連接體包含或者由第二附著位點組成。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，連接體包含巰基，優(yōu)選半胱氨酸殘基的巰基。在另一個優(yōu)選的實施方案中，氨基酸連接體是半胱氨酸殘基。連接體的選擇取決于本發(fā)明的Fel dl的性質，取決于其生化性質，如p1、電荷分布和糖基化。柔性的氨基酸連接體通常是有利的。在本發(fā)明的一個進一步優(yōu)選的實施方案中，連接體由氨基酸組成，其中進一步優(yōu)選地，連接體由最多25個，優(yōu)選最多20個，更優(yōu)選最多15個氨基酸組成。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，氨基酸連接體含有不超過10個氨基酸。連接體的優(yōu)選實施方案選自:(a) CGG ； (b) N-端Y I連接體(例如CGDKTHTSPP，SEQID NO:58) ; (c) N-端 Y 3 連接體(例如 CGGPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO:69) ;(d)Ig 鉸鏈區(qū)；(e)N-端甘氨酸連接體(例如 GCGGGG，SEQ ID NO:59) ； (f) (G)kC(G)n，其中 η = 0-12,k = 0-5 ; (g) N-端甘氨酸-絲氨酸連接體((GGGGS) η, η = 1_3，具有另外一個半胱氨酸(例如SEQ ID勵:60，它相當于其中11 = 1的實施方案)；01)(6)比(6)111(5)1(66665)11，其中11=0-3, k = 0-5, m = 0-10,1 = 0-2 (例如 SEQ ID NO:61,它相當于其中 n=l、k=l、l =I且m = I的實施方案)；⑴GGC ； (k) GGC-NH2 ;⑴C端Y I連接體(例如DKTHTSPPCG, SEQID NO:62) ； (m) C-端 Y 3 連接體(例如 PKPSTPPGSSGGAPGGCG, SEQ ID NO:63) ； (n) C-端甘氨酸連接體(GGGGCG，SEQ ID NO:64) ； (o) (G)nC(G)k，其中 η = 0-12, k = 0-5 ； (p)C_ 端甘氨酸-絲氨酸連接體((SGGGG) η, η = 1_3，具有另外一個半胱氨酸(例如SEQ ID NO:65，它相當于其中 η = I 的實施方案))；(q) (G)m(S) I (GGGGS)n (G) oC(G) k,其中 η = 0-3, k =0-5, m = 0-10, I = 0-2, ο = 0-8 (例如 SEQ ID NO:66,它相當于其中 η = 1、k = 1、I =l、o = I且m = I的實施方案)。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，連接體被添加到本發(fā)明的Fel dl的N末端。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，接連體被添加到本發(fā)明的Fel dl的C末端。本發(fā)明優(yōu)選的連接體是進一步含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點的甘氨酸連接體(G) n，如N-末端甘氨酸連接體(GCGGGG)和C-末端甘氨酸連接體(GGGGCG)。進一步優(yōu)選的實施方案是C-末端甘氨酸-賴氨酸連接體(GGKKGC，SEQ ID NO:67)和N-末端甘氨酸-賴氨酸連接體(CGKKGG，SEQ ID NO:68)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(" NH2"代表酰胺化)連接體、或位于其N-末端的CGG。甘氨酸殘基通常插入大氨基酸與作為第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免偶聯(lián)反應中較大氨基酸的潛在的空間位阻。在一個優(yōu)選實施方案中，連接體與Fel dl蛋白或Fel dl片段的N末端融合。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，連接體是GCGG。在另一個優(yōu)選實施方案中，連接體與Feldl蛋白或Fel dl片段的C末端融合。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，連接體是GGC。在由兩個多肽鏈組成的Fel dl蛋白或Fel dl片段的情況中，這些Fel dl蛋白或Fel dl片段具有兩個N末端或兩個C末端。連接體可以與兩個N末端或與兩個C末端都融合。優(yōu)選地，連接體只與兩個N末端之一或只與兩個C末端之一融合。根據(jù)上述優(yōu)選方法利用異雙功能交聯(lián)劑連接本發(fā)明的Fel dl與VLP，使得本發(fā)明的Fel dl以定向方式與VLP偶聯(lián)。連接本發(fā)明的Fel dl和VLP的其它方法包括使用碳二亞胺EDC和NHS交聯(lián)本發(fā)明的Fel dl和VLP的方法。本發(fā)明的Fel dl也可以首先通過反應，例如與SATA、SATP或亞氨硫醇(iminothiolane)反應而硫醇化。必要時，在脫保護之后，本發(fā)明的Fel dl可以和VLP如下所述偶聯(lián)。在分離過量的硫醇化試劑之后，本發(fā)明的Fel dl與預先用含有 半胱氨酸反應性部分的異雙功能交聯(lián)劑活化的VLP反應，該活化的VLP展示至少一個或幾個對半胱氨酸殘基具有反應性的官能團，如上所述的硫醇化的本發(fā)明的Fel dl能夠與該官能團反應。任選地，在反應混合物中含有少量的還原劑。另外一些方法使用同型雙功能交聯(lián)劑，如戊二醛、DSG、BM[PEOJ4, BS3 (Pierce)或含有對VLP的胺基或羧基有反應性的官能團的其它已知同型雙功能交聯(lián)劑，將本發(fā)明的Fel dl與VLP連接。在本發(fā)明的其他實施方案中，所述組合物包含或者基本由通過化學相互作用連接到本發(fā)明的Fel dl上的病毒樣顆粒組成，其中這些化學相互作用中的至少一個不是共價鍵。例如，VLP與本發(fā)明的Fel dl的連接可以通過將VLP生物素化并將本發(fā)明的Fel dl表達為鏈霉抗生物素-融合蛋白而實現(xiàn)。一種或幾種抗原分子，即本發(fā)明的Fel dl，如果空間允許，可以優(yōu)選通過RNA噬菌體VLP外殼蛋白上暴露的賴氨酸殘基附著到VLP、優(yōu)選RNA噬菌體外殼蛋白的一個亞單元上。因此，RNA噬菌體的VLP，特別是Qi3外殼蛋白VLP的一個具體特征是每個亞單元有偶聯(lián)數(shù)個抗原的可能性。這樣就允許產生密集的抗原陣列。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fel dl通過已添加到本發(fā)明的Fel dl的N末端或C末端上的半胱氨酸殘基，或本發(fā)明的Fel dl內的自然半胱氨酸殘基，與RNA噬菌體VLP的外殼蛋白的賴氨酸殘基連接，特別是與Qi3的外殼蛋白連接。如上所述，4個賴氨酸殘基暴露于Qβ外殼蛋白的VLP的表面。典型且優(yōu)選地，這些殘基在與交聯(lián)劑分子反應時被衍生化。當不是所有的暴露賴氨酸殘基都能與抗原偶聯(lián)時，已與交聯(lián)劑反應的賴氨酸殘基使得交聯(lián)劑分子在衍生化步驟后附著到ε-氨基上。這就使可能對VLP的溶解性和穩(wěn)定性不利的一個或幾個正電荷消失。通過例如公開的Q β外殼蛋白突變體中那樣用精氨酸取代某些賴氨酸殘基，我們防止了正電荷的過度消失，因為精氨酸殘基并不能與優(yōu)選的交聯(lián)劑反應。此外，用精氨酸殘基取代賴氨酸殘基會產生更確定的抗原陣列，因為只有較少的位點可與抗原反應。因此，在下列的QP外殼蛋白突變體中，用精氨酸取代暴露的賴氨酸殘基: -240 (Lysl3-Arg ；SEQ ID NO: 15), Q β-250 (Lys2-Arg, Lysl3-Arg ；SEQ ID NO:17), -259(Lys2-Arg, Lysl6-Arg ；SEQ ID NO:19)和 Q β-251 ; (Lysl6_Arg，SEQ ID NO:
18)。在另一實施方案中，我們公開了具有另一個賴氨酸殘基的QP突變外殼蛋白 -243 (AsnlO-Lys ；SEQ ID NO: 16)，其適合于獲得更高密度的抗原陣列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的VLP由宿主重組產生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述組合物還包含至少一種與VLP結合、優(yōu)選包裝或包封于VLP內部的聚陰離子大分子。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，聚陰離子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸?；静缓拗鱎NA、優(yōu)選宿主核酸:本文所用的術語“基本不含宿主RNA，優(yōu)選宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸的量，該量典型且優(yōu)選地為每mg VLP不到30 μ g,優(yōu)選不到20 μ g,更優(yōu)選不到10 μ g,甚至更優(yōu)選不到8 μ g,甚至更優(yōu)選不到6 μ g,甚至更優(yōu)選不到4 μ g，最優(yōu)選不到2 μ g。在上述內容中使用的宿主是指在其中重組產生VLP的宿主。測定RNA、優(yōu)選核酸的量的常規(guī)方法是本領域技術人員公知的。根據(jù)本發(fā)明測定RNA、優(yōu)選核酸的量的典型且優(yōu)選的方法在同一受讓人于2005年10月5日提交的PCT/EP2005/055009的實施例17中描述。對于含有QP以外的VLP的本發(fā)明的組合物，測定RNA、優(yōu)選核酸的量典型且優(yōu)選地使用相同、相似或類似的條件。最終需要的條件的改變是本領域技術人員的常識。確定的量的數(shù)值應當?shù)湫颓覂?yōu)選地被理解為包括指定數(shù)值±10%、優(yōu)選±5%偏差的數(shù)值。聚陰離子大分子:本文所用的術語“聚陰離子大分子”是指包含重復負電荷基團的高相對分子量的分子，其結構基本包括實際上或概念上來源于低相對分子量的分子的多個重復單位。聚陰離子大分子的分子量應當為至少2000道爾頓，更優(yōu)選至少3000道爾頓，甚至更優(yōu)選至少5000道爾頓。本文所用的術語“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地指不能活化toll-樣受體的分子。因此術語“聚陰離子大分子”典型且優(yōu)選地不包括Toll-樣受體配體，甚至更優(yōu)選地不包括免疫刺激物，如Toll-樣受體配體、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更優(yōu)選地，本文所用的術語“聚陰離子大分子”是指不能誘導細胞因子產生的分子。甚至更優(yōu)選地，術語“聚陰離子大分子”不包括免疫刺激物。本文所用的術語“免疫刺激物”是指能夠誘導和/或增強特別針對本發(fā)明中包括的抗原的免疫應答的分子。
宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸:本文使用的術語“宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸”或術語“具有二級結構的宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA或優(yōu)選核酸。然而，RNA、優(yōu)選核酸在典型且優(yōu)選地通過本發(fā)明的方法減少或去除RNA、優(yōu)選核酸的量的過程中可能經受化學和/或物理學改變，例如，RNA、優(yōu)選核酸的大小可能被縮短，或者其二級結構可能改變。但是，甚至這種得到的RNA或核酸仍然被認為是宿主RNA，或宿主核酸。2005年10月5日同一受讓人提交的PCT/EP2005/055009公開了確定VLP包含的RNA的量以及減少VLP包含的RNA的量的方法，因此整個申請引入本文作為參考。減少或消除宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸的量，最小化或者減少了不希望的T細胞應答，如炎性T細胞應答和細胞毒性T細胞應答，和其他不希望的副作用，如發(fā)熱，而同時保持特異性針對Fel dl的強抗體應答。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明的組合物和本發(fā)明的RNA曬菌體VLP-Fel dl的方法，其中所述VLP由宿主重組產生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA、優(yōu)選宿主核酸，該方法包括以下步驟:a)由宿主重組產生具有至少一個第一附著位點的病毒樣顆粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌體的外殼蛋白、其變體或片段；b)將所述病毒樣顆粒解裝配為所述RNA噬菌體的所述外殼蛋白、其變體或片段；c)純化所述外殼蛋白、其變體或片段；d)將所述純化的所述RNA噬菌體的外殼蛋白、其變體或片段重裝配為病毒樣顆粒，其中所述病毒樣顆?；静缓拗鱎NA、優(yōu)選宿主核酸；和e)將具有至少一個第一附著位點的至少一個本發(fā)明的抗原與步驟(d)獲得的所述VLP連接。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述純化的外殼蛋白、其變體或片段的重裝配在至少一種聚陰離子大分子的存在下實現(xiàn)。在一個優(yōu)選實施方案中， 本發(fā)明的組合物還包含至少一種能夠誘導和/或增強免疫應答的免疫刺激物。優(yōu)選地，免疫刺激物是Toll-樣受體配體，優(yōu)選選自:(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(C)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白;(h)免疫刺激性有機分子；⑴含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j) (a)、(b)、(c)、
(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和⑴的物質的任意混合物。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激性核酸選自:(a)細菌來源的核酸；
(b)病毒來源的核酸；(c)包含非甲基化CpG基序的核酸；(d)雙鏈RNA ； (e)單鏈RNA ;和(g)不含CpG基序的核酸。不含非甲基化CpG基序的免疫刺激性核酸已經在現(xiàn)有技術中公開，例如W001/22972。本文使用的術語“核酸”是指由線性共價連接的單體(核苷酸)組成的分子。它是指核苷酸分子鏈，不是指特定長度的產物。因此，寡核苷酸包括在核酸的定義內。核苷酸之間的鍵典型且優(yōu)選地是磷酸二酯鍵。包含鍵的修飾例如硫代磷酸鍵的核酸也包括在本發(fā)明中。在一個優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物與重組VLP混合。在另一個優(yōu)選的實施方案中，免疫刺激物與本發(fā)明的VLP結合，優(yōu)選包裝在本發(fā)明的VLP內。免疫刺激物，特別是免疫刺激性核酸，更特別是包含非甲基化CpG的寡核苷酸的詳細描述已經在W003/024480、03/024481和PCT/EP/04/003165中公開。混合免疫刺激物和VLP-抗原的方法已經在W003/024480中公開。將免疫刺激物包裝在VLP內的方法已經在TO03/024481 中公開。W003/024480、03/024481 和 PCT/EP/04/003165 的完整申請因此引入本文作為參考。VLP通?？梢哉T導和/或增強免疫系統(tǒng)。然而，在本申請中使用的術語“免疫刺激物”是指不是用于本發(fā)明組合物的VLP的免疫刺激物，而是除所述VLP以外的免疫刺激物。本發(fā)明的組合物內包含免疫刺激物，優(yōu)選免疫刺激性核酸，可以使免疫應答轉為Thl應答，由此抑制Th2應答。在一個方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的組合物的疫苗。在一個方面，本發(fā)明提供一種含有本發(fā)明的組合物和適當?shù)木彌_液的疫苗。在一個優(yōu)選實施方案中，該疫苗組合物還包含至少一種佐劑。所述至少一種佐劑的施用可以在施用本發(fā)明的組合物之前、同時或之后進行。本文使用的術語“佐劑”是指免疫應答的非特異性刺激物，或可以在宿主中產生儲庫(depot)的物質，當分別與本發(fā)明的疫苗和藥物組合物且合時可以產生更強的免疫應答。在另一個優(yōu)選實施方案中，所述疫苗組合物不含佐劑。本發(fā)明的一個有利的特征是組合物的高免疫原性，甚至在不含佐劑時依然如此。不使用佐劑可以減少與使用佐劑有關的副作用的可能的發(fā)生。因此，優(yōu)選地給患者施用本發(fā)明的疫苗組合物而不需在施用該疫苗之前、同時或之后給同一名患者施用至少一種佐劑。本發(fā)明進一步公開了一種免疫方法，包括給人或非人哺乳動物如狗或貓施用本發(fā)明的疫苗。并非意在用理論限制本發(fā)明，給貓注射本發(fā)明的疫苗組合物可以中和Fel dl，因而減少貓唾液中Fel dl的量。疫苗可以用本領域所知的各種方法施用，但是通常通過注射、輸注、吸入、口服或其他適當?shù)奈锢矸椒▉硎┯谩；蛘?，偶?lián)物可以肌肉內、靜脈內、經粘膜、經皮、鼻內、腹膜內或皮下施用。用于施用的偶聯(lián)物的組分包括無菌水溶液(例如生理鹽水)或非水溶液和懸液。非水溶劑的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油、和注射用有機酯如油酸乙酯?？梢岳幂d體或封閉敷料提高皮膚通透性并促進抗原吸收。如果接受個體能夠耐受本發(fā)明的疫苗的施用，則認為該疫苗是“藥學可接受的”。進而，本發(fā)明的疫苗將以“治療有效量”(即產生希望的生理學效果的量)施用。免疫應答的性質或類型不是本申請公開內容的限制因素。并非意在通過以下機制的解釋來限制本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗可以誘導可與Fel dl結合的抗體，推測為IgG亞型，因而阻止了與肥大細胞和嗜堿性粒細胞結合的IgE發(fā)現(xiàn)Fel dl?？商娲鼗蛘咄瑫r，本發(fā)明的組合物使免疫應答轉為Thl應答，由此抑制了 Th2應答的發(fā)展和IgE抗體的產生，IgE抗體是變態(tài)反應中的一種主要成分。在一個方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明所述組合物和可接受的藥物載體的藥物組合物。當給個體施用本發(fā)明的疫苗時，它可以是含有鹽、緩沖液、佐劑或其他改善偶聯(lián)物效果所需的物質的形式。適合在制備藥物組合物中使用的材料的例子在許多資料中提供，包括 REMINGTON' S PHARMA CEUTICAL SCIENCES(Osol, A, ed, Mack Publishing Co,(1990))。本發(fā)明教導了一種制備本發(fā)明的組合物的方法，該方法包括以下步驟:(a)提供具有至少一個附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒；
(b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白或Fel dl片段；和(c)將所述核心顆粒和所述至少一種抗原組合，產生組合物，其中所述至少一種抗原和所述核心顆粒通過所述第一附著位點和第二附著位點連接。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，提供具有至少一個附著位點的核心顆粒的步驟包括以下另外的步驟:(a)將所述核心顆粒解裝配為所述核心顆粒的外殼蛋白、其突變體或片段；(b)純化所述外殼蛋白、其突變體或片段；(c)重裝配所述純化的所述核心顆粒的外殼蛋白、其突變體或片段，其中所述核心顆?；静缓拗鱎NA、優(yōu)選宿主核酸。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，所述純化的外殼蛋白的重裝配在至少一種聚陰離子大分子或至少一種免疫刺激性核酸的存在下實現(xiàn)。在一個方面，本發(fā)明提供一種使用本發(fā)明的組合物預防和/或治療哺乳動物中的貓變態(tài)反應的方法，其中優(yōu)選地所述哺乳動物是人或狗。在一個方面，本發(fā)明教導了本發(fā)明的組合物作為藥物的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的組合物在制備治療哺乳動物中的貓變態(tài)反應的藥物中的用途，其中優(yōu)選地所述哺乳動物是人或狗。在另一方面，本發(fā)明提供了一種Fel dl融合蛋白，該融合蛋白包含通過氨基酸間隔區(qū)融合的Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2，所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，其中所述氨基酸間隔區(qū)由具有10-30個、優(yōu)選10-25個、優(yōu)選10-20個、優(yōu)選13-20個、優(yōu)選15-20個、優(yōu)選13-17個、優(yōu)選15-17個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，并且其中所述融合蛋白不是這樣的融合蛋白:其包含的SEQ ID NO:22的鏈I通過(GGGGS)3與SEQ IDN0:23、25或26的鏈2的N末端融合，并且其中所述排除的融合蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達。W02004094639公開了通過用連接體連接鏈I和鏈2形成的Fel dl融合蛋白，該連接體選自碳-氮鍵和短肽，即具有1-9個、優(yōu)選1-5個、特別優(yōu)選1-3個氨基酸。它進一步指出鍵或短肽不誘導顯著的約束或解折疊。然而，W02004094639沒有公開比9個氨基酸長的連接體。W000/20032公開了桿狀病毒表達的重組Fel dl，其含有連續(xù)表達并且通過甘氨酸/絲氨酸連接體(GGGGS)3連接在一起的鏈I和鏈2。W000/20032也報道了與在大腸桿菌中表達的變應原相比，在桿狀病毒中表達變應原顯著改善了 rFel dl對于IgG和IgE抗體的免疫反應性。本發(fā)明的Fel dl融合蛋白可以在原`核表達系統(tǒng)中產生,也可以在真核表達系統(tǒng)如桿狀病毒系統(tǒng)中產生。在一個優(yōu)選實施方案中，所述本發(fā)明的Fel dl融合蛋白從大腸桿菌中產生。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的Fel dl融合蛋白包含的間隔區(qū)由具有10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19或20個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl融合蛋白包含的間隔區(qū)由具有2、3或4次GGGGS重復的氨基酸序列組成。在一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的鏈2位于本發(fā)明的融合蛋白的N末端。在另一個優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)el dl的鏈I位于本發(fā)明的融合蛋白的N末端。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白從大腸桿菌中產生。在一個非常優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fel dl融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:(a) SEQ ID NO:54 ； (b) SEQ ID NO:55 ;和(c) SEQ ID NO:57。本發(fā)明進一步提供編碼本發(fā)明的Fel dl融合蛋白的核苷酸序列。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的融合蛋白的核苷酸序列，該融合蛋白的氨基酸序列選自:(a)SEQ ID N0:54；(b)SEQ IDNO:55 ;和(c)SEQ ID NO:57。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fel dl融合蛋白在大腸桿菌中產生。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的Fel dl融合蛋白包含或者由SEQ ID NO:57的氨基酸序列組成，其中所述本發(fā)明的融合蛋白在大腸桿菌中產生。在一個方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的Fel dl融合蛋白在診斷和治療貓變態(tài)反應中的用途。
實施例實施例1在不同聚陰離子大分子的存在下，通過解裝配/重裝配制備本發(fā)明的QPVLP，產生重裝配的QP VLP(A)現(xiàn)有技術Q β VLP的解裝配從大腸桿菌裂解液中純化的溶于PBS (20mM磷酸鹽，150mM NaCl，pH7.5)中的45mg現(xiàn)有技術QP VLP(2.5mg/ml,通過Bradford分析測定)在攪拌條件下于室溫用IOmM DTT還原15分鐘。然后加入氯化鎂至0.7M的終濃度，繼續(xù)在攪拌條件下于室溫溫育15分鐘，導致包裹的宿主細胞RNA被沉淀。溶液于4°C下以4000rpm離心10分鐘(Eppendorf5810R,固定角轉頭A-4-62，在下列所有步驟中均使用)，以從溶液中除去沉淀的RNA。用含有釋放的二聚QP外殼蛋白的上清液進行層析純化步驟。(B)通過陽離子交換層析和大小排阻層析純化Q β外殼蛋白含有二聚體外殼蛋白、宿主細胞蛋白質和殘留的宿主細胞RNA的解裝配反應上清液用水1: 15稀釋，以調節(jié)電導率低于10mS/cm,并加樣到SP-Sepharose FF柱(xkl6/20,6ml, Amersham Bioscience)上。該柱預先用20mM磷酸鈉緩沖液pH7平衡。用達到20mM磷酸鈉/500mM氯化鈉的分步梯度來完成對結合的外殼蛋白的洗脫，以大約25ml的級分體積收集蛋白質。以5ml/min的流速在室溫下進行層析,在260nm和280nm處測量吸光度。在第二步中，將分離的QP外殼蛋白(從陽離子交換柱上洗脫的級分)加樣到(分兩次進行)用20mM磷酸鈉/250mM氯化鈉ρΗ6.5平衡的S印hacrylS-lOOHR柱(xk26/60，320ml, Amersham Bioscience)上。以2.5ml/min的流速在室溫下進行層析，在260nm和280nm處測量吸光度。收集5ml的級分。(Cl)通過透析重裝配QP VLP將純化的QP外殼蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸鈉pH6.5中)、一種聚陰離子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT (0.5M水溶液)混合至終濃度為1.4mg/ml外殼蛋白、0.14mg/ml各自的聚陰離子大分子、IM尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa阻斷值的膜將混合物(各lml)于5°C下在20mM TrisHCl, 150mM NaCl pH8中透析2天。聚陰離子大分子是:聚半乳糖醛酸(25000-50000，F(xiàn)luka)、硫酸葡聚糖(MW5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MWl 1000 和 33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW3000、13600 和 84600，Sigma)和來自面包酵母和小麥胚的tRNA。(C2)通過滲濾重裝配Q β VLP將33ml 純化的 QP 外殼蛋白(1.5mg/ml，在 20mM 磷酸鈉 pH6.5,250mM NaCl 中)與水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW:84600)混合?；旌衔锏捏w積為50ml,各成分的終濃度為lmg/ml外殼蛋白、300mM NaCl> 1.0M尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用Pel licon XL膜柱(Biomax5K,Millipore)的正切流動過濾裝置中，應用10ml/min的橫流速和2.5ml/min的滲透流速，用500ml的20mM TrisHClpH8,50mM NaCl在室溫下滲濾該混合物。實施例2AP205VLP的體外裝配(A)AP205外殼蛋白的純化解裝配:20ml的AP205VLP溶液(1.6mg/ml,在PBS中，從大腸桿菌提取物中純化)與0.2ml的0.5M DTT混合，于室溫溫育30分鐘。加入5ml的5M NaCl，然后將該混合物于60°C下溫育15分鐘，使DTT-還原的外殼蛋白沉淀。將渾濁的混合物離心(轉頭SorvallSS34, IOOOOg, 10min,20°C )，棄去上清液，將沉淀物分散到20ml的IM尿素/20mM檸檬酸鈉PH3.2中。于室溫下攪拌30分鐘后，加入1.5M Na2HPO4將分散液調節(jié)至pH6.5，然后離心(轉頭SOrVallSS34，10000g，10min，20°C )，獲得含有二聚體外殼蛋白的上清液。陽離子交換層析:用20ml水稀釋上清液(見上)，以調節(jié)電導率約為5mS/cm。將得到的溶液加至預先用20mM磷酸鈉pH6.5緩沖液平衡的6ml SP Sepharose FF柱(AmershamBioscience)上。加樣后，用48ml20mM磷酸鈉pH6.5緩沖液洗柱，然后以20倍柱體積用達到IM NaCl的線性梯度洗脫結合的外殼蛋白。合并主峰級分，通過SDS-PAGE和UV光譜法進行分析。根據(jù)SDS-PAGE，分離的外殼蛋白是基本純化的，基本不含其他蛋白質雜質。根據(jù)UV光譜法，蛋白質濃度為0.6mg/ml (總量12mg)，I個A280單位反映1.0 lmg/ml AP205外殼蛋白。此外，A280值(0.5999)與A260值(0.291)之比為2，表明該制品基本不含核酸。(B)AP205VLP 的裝配在不含任何聚陰離子大分子的條件下的裝配:將上述洗脫的蛋白質級分滲濾并且通過TFF濃縮，至在20mM磷酸鈉pH6.5中的蛋白質濃度為lmg/ml。將500 μ I該溶液與50 μ I的5Μ NaCl溶液混合，于室溫下溫育48小時?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示。使用用20mM磷酸鈉，150mMNaCl pH7.2平衡的TSKgelG5000PWXL 柱(Tosoh Bioscience)進行 HPLC 分析。在聚谷氨酸存在下的裝配:將375 μ I純化的AP205外殼蛋白(lmg/ml，在20mM磷酸鈉pH6.5中)與50 μ I的NaCl貯存溶液(5Μ水溶液)、50 μ I聚谷氨酸貯存溶液(2mg/ml水溶液，MW:86400, Sigma)和25 μ I水混合?；旌衔镌谑覝叵聹赜?8小時?；旌衔镏兄匮b配的VLP的形成通過非還原SDS-PAGE和大小排阻HPLC顯示?；旌衔镏械耐鈿さ鞍讕缀跬耆珦饺氲絍LP中，表明裝配效率高于在不含任何聚陰離子大分子情況下裝配的ΑΡ205外殼蛋白。實施例3Feldl融合蛋白的克隆使用如下所示的重疊DNA引物，通過PCR擴增制備分別編碼Fel dl鏈I和鏈2的基因。示出了正向(F)和反向(R)引物。將片段連接到pCRI Ι-Τ0Ρ0載體(Invitrogen)內，并轉化XLl-Blue。通過測序證實Fel dl鏈I和鏈2的插入。引物序列IF:SEQ ID NO:34 ;引物序列2R:SEQ ID NO:35引物序列3F:SEQ ID NO:36引物序列4R:SEQ ID NO:37引物序列 5F:SEQ ID NO:38
引物序列6R:SEQ ID NO:39引物序列7F:SEQ ID NO:40引物序列8R:SEQ ID NO:41引物序列9F:SEQ ID NO:42引物序列IOR:SEQ ID NO:43Fel dl融合構建體:FELDl是指在N末端的鏈2與鏈I直接融合的蛋白質。使用引物11連接體(SEQID NO:44)通過剪接重疊延伸(SOE) PCR產生編碼FELDl的核苷酸序列。FD12是指在N末端的鏈I與鏈2直接融合的蛋白質。使用引物12-1 (SEQ ID NO:45)、12-3 (SEQ ID NO:46)和 12-2-1 (SEQ ID NO:47)通過剪接重疊延伸(SOE) PCR 產生編碼FD12的核苷酸序列。FELDl-1 Oaa和FELDl_15aa是指在N末端的鏈2分別通過IO(GGGGS)2或15 (GGGGS)3氨基酸間隔區(qū)與在C末端的鏈I融合的蛋白質。使用含有編碼FELDl的核苷酸序列的質粒作為模板，通過反向PCR誘變(IPCRM)產生10個氨基酸或15個氨基酸的間隔區(qū)。對于1-15間隔區(qū)，使用兩個引物(引物1-lOaa, SEQ ID NO:48和引物2_5aa，SEQ IDNO:49)。對于1-10間隔區(qū)，使用兩個引物(引物l_5aa，SEQ ID NO:50和引物2_5aa)。得到的PCR片段通過連接環(huán)化。它耐受Dpn I消化，因為Dpn I只識別含有甲基化腺嘌呤的序列，而質粒模板被Dpn I消化。FD12_10aa 和 FD12_15aa 是指在 N 末端的鏈 I 分別通過 10 (GGGGS)2 或 15 (GGGGS) 3氨基酸間隔區(qū)與在C末端的鏈2融合的蛋白質。融合FD12-10aa和FD12-15aa如上所述類似地產生。對于15個氨基酸的間隔區(qū)使用引物FD2-10aa(SEQ ID NO:51)和引物FDl_5aa(SEQID NO:52) ο對于10個氨基酸的間隔區(qū)，使用引物FDl-5aa和FD2-5aa(SEQ ID NO:53)。實施例4His標記的Fel dl融合蛋白的細菌表達和純化將如實施例3所述的編碼各種Fel dl融合構建體的核苷酸序列亞克隆到由質粒pET-42a(+) (Novagen)修飾而來的基于T7的表達系統(tǒng)pET_42T(+)中。該融合構建體的C末端與His-標記序列融合，之后是GGC，含有半胱氨酸作為第二附著位點的氨基酸連接體。得到的構建體根據(jù)在末端添加“-HC”而相應地命名。FELD1-HC、FELDl-1Oaa-HC 和 FELD1-15aa_HC 和 FD12_15aa_HC 如下表達并純化:用質粒轉化BL21(DE3)。通過向0D600約為I的培養(yǎng)物中加入ImM IPTG誘導表達。培養(yǎng)物在20°C下再生長20小時，收獲，并通過在非變性裂解緩沖液(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl,IOmM咪唑，pH8.0)中超聲處理而裂解。澄清后的細菌裂解液添加非變性裂解緩沖液至50ml。加入5ml鎳-次氮基三乙酸(N1-NTA)瓊脂糖(Qiagen)，裂解液在4°C下倒置培養(yǎng)I小時。通過用非變性裂解緩沖液洗滌4次除去非特異性結合的蛋白質。通過將N1-NTA瓊脂糖重懸浮在2ml洗脫緩沖液(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl，250mM咪唑，pH8.0)中洗脫結合的蛋白質。實施例5在純化的Fel dl融合蛋白中氧化折疊二硫鍵Ni2+-親和純化的FELDl-HC由15kD至20kD的多種混合二硫鍵橋接的物質組成。FELDl-HC的天然折疊通過用摩爾比為1:1的氧化型谷胱甘肽(GSSG，Applichem)和還原型谷胱甘肽(GSH，Applichem)分子內改組二硫鍵而實現(xiàn)。在用洗脫緩沖液洗脫FELDl后立即加入2.5mM GSSG和2.5mM GSH在室溫下反應24小時。重折疊的FELDl-HC在非還原條件下顯示分子量為15kD的一條帶(圖1，第一張圖，第2泳道)。使用碘乙酰胺(Sigma)將FELDl-HC的潛在的游離巰基烷基化。在室溫下用5mM碘乙酰胺在20mM碳酸氫銨pH8.0中處理探針15分鐘。通過用PBS 平衡的大小排阻層析(SEC) (Superdex75pg, Amersham PharmaciaBiosciences)將重折疊的FELDl-HC進一步純化為均質的。FELDl-1Oaa-HC和FELDl_15aa_HC通過與以上所述基本相同的方法復性(圖1，中間兩張圖)。FD12-15aa_HC的天然折疊類似地通過用摩爾比為10: I的氧化型谷胱苷肽和還原型谷胱苷肽改組二硫鍵而實現(xiàn)。在洗脫后，F(xiàn)D12-15aa用FD12-15aa重折疊緩沖液(50mMTris-Cl pH8.5,240mM NaCl，IOmM KCl，ImM EDTA，0.05% PEG3, 550，ImM GSH，0.1mM GSSH)稀釋20倍，并在4°C下溫育24小時。重折疊的FD12-15aa顯示分子量為20kD的一條帶，與之相比，還原型在23kD處(圖1，最后一張圖)。實施例6表位特異性單克隆抗體識別Fel dl融合蛋白與天然Fel dl (nFel dl)相比較的Fel dl融合蛋白與表位特異性單克隆抗體(mAB)的結合使用來自 Indoor biotechnologies (Cardiff, UK)的 Fel dlELISA 試劑盒(6F9/3E4)通過夾心ELISA檢測。

簡要地說，作為2mg/ml貯存液提供的抗-Fel dlmAB6F9用50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液PH9.6以1: 1000稀釋。微量滴定孔用每孔100 μ I稀釋的mAB6F9在4°C下包被過夜。用 PBS-0.05%Tween20 (PBS-T)洗板三次，然后用 100 μ I 封閉緩沖液(I % BSA (Sigma)，在PBS-T中)封閉。然后微量滴定孔與100 μ I Fel dl融合蛋白或nFel dl標準(Indoorstechnologies ；UK)溫育I小時，使用從80ng/ml到0.16ng/ml的倍比稀釋。nFel dl參照由含有13.47U/ml Fel dl (I單位=4mg蛋白質)的CBER貓毛皮屑參照ElO亞標準化。然后洗板，加入100 μ I稀釋的(I: 1000，用1% BSA/PBS-T)生物素化的抗-FeldlmAB3E4抗體，在室溫下溫育I小時。用PBS-T洗板三次，使用100μ1稀釋的(I: 1000，用1% BSA/PBS-T)鏈霉抗生物素-過氧化物酶(Sigma S5512，0.25mg，在Iml蒸餾水中重建)。在室溫下溫育30分鐘后，用PBS-T洗孔三次。用OPD底物溶液和作為終止溶液的5%H2SO4進行檢測。使用ELISA讀板器(BioRad)在450nm處測量吸光度，使用EXCEL軟件(MSOffice ；Microsoft)計算算術平均值和平均值的標準差(SEM)。結果顯示在表I中。因此，表位特異性mAB對Fel dl融合蛋白和nFel dl的識別反映了兩種蛋白質的抗原性的高度相似性。表1
檢測的蛋白質 FELDl-HCFELDl-1Oaa-HC FELDl-15aa-HC 天然 Feldl
權利要求
1.一種組合物，其包含: (a)具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒， (b)具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原， 其中所述至少一種抗原是Fel dl蛋白，所述Fel dl蛋白是包含F(xiàn)el dl的鏈I和Feldl的鏈2的融合蛋白，并且其中(a)和(b)通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點共價連接。
2.權利要求1的組合物，其中所述Feldl的鏈I與Fel dl的鏈2通過一個肽鍵直接融合或者通過間隔區(qū)融合，其中所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端。
3.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈2通過其C末端與所述Fel dl的鏈I的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。
4.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈I通過其C末端與所述Fel dl的鏈2的N末端直接融合或者通過間隔區(qū)融合。
5.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈I與Fel dl的鏈2通過間隔區(qū)融合，其中所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，且其中所述間隔區(qū)由具有1-20個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。
6.權利要求1的組合物，其中所述Feldl的鏈I與Fel dl的鏈2通過間隔區(qū)融合，其中所述間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，且其中所述間隔區(qū)由具有10-30個氨基酸殘基的氨基酸 序列組成。
7.權利要求6的組合物，其中所述間隔區(qū)由具有15個氨基酸殘基的氨基酸序列組成。
8.權利要求7的組合物，其中所述間隔區(qū)是(GGGGS)315
9.權利要求2的組合物，其中所述融合蛋白包含選自下組的氨基酸序列:(a)SEQID NO:24 ;(b)SEQID NO:54 ；(c)SEQID NO:55 ；(d)SEQID NO:56 -M(e)SEQID NO:57。
10.權利要求1的組合物，其中所述至少一種抗原是Feldl蛋白，且其中所述Fel dl蛋白選自:(a)SEQID NO:24 ;(b)SEQID NO:54 ；(c)SEQID NO:55 ;和(d)SEQID NO:57。
11.權利要求1的組合物，其中所述融合蛋白由選自以下的氨基酸序列組成:(a)SEQID NO:24 ;和(b)SEQID NO:57o
12.權利要求1的組合物，其中所述融合蛋白由SEQID NO:24的氨基酸序列組成。
13.權利要求1的組合物，其中所述融合蛋白由SEQID NO:57的氨基酸序列組成。
14.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈I包含SEQ ID NO:22的序列或其同源序列，其中所述同源序列與SEQ ID NO:22具有大于80%，優(yōu)選大于90%，或甚至更優(yōu)選大于95%的同一性。
15.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈I由SEQ ID NO:22的氨基酸序列組成。
16.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈2包含SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的序列或其同源序列，其中所述同源序列與SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26具有大于80%，優(yōu)選大于90%，或甚至更優(yōu)選大于95%的同一性。
17.權利要求2的組合物，其中所述Feldl的鏈2由SEQ ID NO:23的氨基酸序列組成。
18.權利要求1的組合物，其中所述病毒樣顆粒是RNA噬菌體的病毒樣顆粒。
19.權利要求18的組合物，其中所述RNA噬菌體選自Qβ、fr、GA或AP205。
20.權利要求18的組合物，其中所述RNA噬菌體是RNA噬菌體Qβ。
21.權利要求18的組合物，其中所述RNA噬菌體的病毒樣顆粒包括SEQID NO:1的外殼蛋白。
22.權利要求1的組合物，其中所述第一附著位點是氨基。
23.權利要求22的組合物，其中所述氨基是賴氨酸的氨基。
24.權利要求1的組 合物，其中所述第二附著位點是巰基。
25.權利要求24的組合物，其中所述巰基是半胱氨酸的巰基。
26.權利要求1的組合物，其中所述第一附著位點是氨基，且其中所述第二附著位點是疏基。
27.權利要求26的組合物，其中所述氨基是賴氨酸的氨基，且其中所述巰基是半胱氨酸的疏基。
28.權利要求1的組合物，其還包含連接體，其中所述連接體與所述Feldl蛋白的C末端融合。
29.一種疫苗，其包含權利要求1-28中任一項的組合物。
30.權利要求29的疫苗，其還包含至少一種佐劑。
31.一種藥物組合物，其包含: (a)權利要求1-28中任一項的組合物；和 (b)可接受的藥物載體。
32.—種制備權利要求1-28中任一項的組合物的方法，包括: (a)提供具有至少一個第一附著位點的核心顆粒，其中所述核心顆粒是病毒樣顆粒； (b)提供具有至少一個第二附著位點的至少一種抗原，其中所述抗原是Feldl蛋白，其中所述Fel dl蛋白是包含F(xiàn)el dl的鏈I和Fel dl的鏈2的融合蛋白；和 (c)將所述核心顆粒與所述至少一種抗原連接，產生所述組合物，其中所述至少一種抗原和所述核心顆粒通過所述至少一個第一附著位點和所述至少一個第二附著位點連接。
33.權利要求1-28中任一項的組合物在制備治療貓變態(tài)反應的藥物中的用途。
34.—種Fel dl融合蛋白，其包含通過氨基酸間隔區(qū)融合的Fel dl的鏈I和Fel dl的鏈2，其中所述氨基酸間隔區(qū)連接一條鏈的N末端和另一條鏈的C末端，其中所述氨基酸間隔區(qū)由具有10-30個氨基酸殘基的氨基酸序列組成，并且其中所述融合蛋白不是包含SEQID NO:22的鏈I通過(GGGGS) 3與SEQ ID NO:23、25或26的鏈2的N末端融合的融合蛋白，并且其中所排除的融合蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達。
35.權利要求34的Feldl融合蛋白，其包含選自下組的氨基酸序列:(a)SEQID NO:54 ;(b)SEQID NO:55 ;和(c)SEQID NO:57。
36.一種包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的Fel dl融合蛋白，其中所述Fel dl蛋白在大腸桿菌中 產生。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學、公共衛(wèi)生、免疫學、分子生物學和病毒學領域。本發(fā)明提供包含病毒樣顆粒(VLP)或病毒顆粒和至少一種抗原的組合物，所述抗原特別是至少一種貓抗原，更特別地是至少一種為人變應原的貓抗原。在特定實施方案中，抗原是與VLP共價連接的Fel d1抗原或其片段。本發(fā)明也提供制備所述組合物的方法。本發(fā)明的組合物在哺乳動物，特別是在人中誘導有效的免疫應答，特別是抗體應答。本發(fā)明的組合物和方法可以用于制備疫苗，該疫苗特別用于治療和/或預防對貓毛皮屑和其他貓抗原和變應原的變態(tài)反應。
文檔編號A61P37/08GK103203016SQ20131011521
公開日2013年7月17日 申請日期2006年3月17日 優(yōu)先權日2005年3月18日
發(fā)明者M·巴克曼, M·鮑爾, K·迪特邁爾, N·施米茨, S·尤特津格爾 申請人:賽托斯生物技術公司