專利名稱：一種針對轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程藥物和藥劑學領(lǐng)域，特別是涉及一種針對轉(zhuǎn)化生子因子β II 型受體(transforming growth factor- β receptor II , T β R II )的核酸適配子納米制劑 CS (Seq58)-NP (chitosan (Seq58)-nanoparticle)及其制備方法。
背景技術(shù)：
青光眼是一種常見的不可逆性致盲眼病，是人類的第二大致盲性疾病，病理性眼壓升高是其主要特點。 目前臨床上主要使用藥物、激光和手術(shù)治療的方法來降低眼壓。濾過性手術(shù)被證明是適合于藥物降眼壓無效患者的最佳手術(shù)方法。與其它手術(shù)不同，青光眼濾過術(shù)后并不希望傷口完全修復，而是形成不完全愈合，以便房水外流，但該手術(shù)失敗率高達15%-30%，主要原因是濾過通道瘢痕的形成。針對青光眼濾過手術(shù)后瘢痕的形成，目前主要的對抗手段是術(shù)中、術(shù)后采用抗瘢痕藥物，臨床上應用較廣泛的是抗代謝藥絲裂霉素C (mitomycin, MMC)、5_氟尿卩密唳(5-f luorouracil, 5_Fu)等,這類藥物能有效提高青光眼術(shù)后的早期濾過，但其毒副作用不容忽視，常出現(xiàn)較多的并發(fā)癥，如濾過泡滲漏、角膜上皮缺損、持續(xù)性低眼壓等。因此，尋找一種療效好、特異性強且毒副作用小的抗瘢痕藥物已成為近年來青光眼研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕化的發(fā)生及發(fā)展與多種致纖維化因子的活性密切相關(guān)，如TGF-β、FOGF、FGF、VEGF 等，其中轉(zhuǎn)化生長因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )占主要地位[I]，其亞型TGF-β 2在眼部瘢痕疾病的發(fā)生中又起主要作用[2]。TGF-β與其受體TiiRII (轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體)結(jié)合作為始動環(huán)節(jié)，促使成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為具有收縮功能的肌成纖維細胞，在瘢痕化的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用[3]。因此，對抗TGF-β的生物學作用在減少瘢痕形成及防止組織纖維化中有著極其重要的意義。對抗TGF-β的現(xiàn)有策略主要包括:(I)干預配體TGF-β的表達水平及活性；(2)利用受體拮抗劑阻斷TGF-β與其II型受體Ti3R II的結(jié)合，阻止TGF-β信號傳入細胞；(3)干預TGF-β受體后信號傳遞途徑。目前已有很多關(guān)于配體TGF-β的特異性抗體[4]、反義寡核苷酸(ASODN)[5]以及小分子干擾RNA (siRNA)[6]的相關(guān)研究，大部分結(jié)果都顯示可減少青光眼濾過術(shù)后的結(jié)膜瘢痕形成，但在實際應用中各有利弊。單抗對TGF-β的阻封效果較弱，在體內(nèi)容易被降解且多次用藥有免疫原性；AS0DN和siRNA可以減少TGF-β蛋白的生成，但是動物實驗中其組織特異性和穿膜效率差，其應用還有待研究。利用受體拮抗劑阻斷TGF- β與其II型受體T β R II的結(jié)合，阻止TGF- β信號傳入細胞，不失為一種可以嘗試的方法。本發(fā)明的申請人通過計算機聯(lián)網(wǎng)檢索，僅檢索到2篇關(guān)于TGF-β III型受體核酸適配子的文獻[7，8]，并未檢索到與Τβ R II相關(guān)的抗體及適配子的文獻。同時，該兩篇關(guān)于TGF-β III型受體核酸適配子的文獻篩選Τβ RIII適配子的目的僅是用作細胞標記物，與抗瘢痕并無關(guān)系。通過配體指數(shù)級富集系統(tǒng)進化技術(shù)(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX),從大容量的隨機寡核苷酸庫中篩選出對靶分子具有高度結(jié)合能力的寡核苷酸，這些寡核苷酸被稱之為核酸適配子(aptamer,又稱適配體)。適配子因其自身獨特的空間構(gòu)象，能夠與特定的靶分子相結(jié)合，包括蛋白質(zhì)、核酸、小分子有機物、金屬離子等。核酸適配子由于具有高親和力、高特異性、易體外合成等特點，已在基礎(chǔ)研究、臨床診斷與治療以及新藥研發(fā)等諸多領(lǐng)域展示了廣闊的應用前景。因此，本發(fā)明的申請人應用SELEX技術(shù)，從大容量的隨機寡核苷酸庫中獲得了高親和力、高特異性的祀向Τβ R II的核酸適配子一Seq58,并通過作用于人Tenon’s囊成纖維細胞(HTFs)，證明了 Seq58可阻礙TGF- β與T β R II結(jié)合。但是核酸適配子普遍存在易被核酸酶降解、作用時效短等缺點[9]。化學性修飾，例如硫代修飾能夠增強核酸的穩(wěn)定性，但同時增強了其細胞毒性及非特異效應。因此，選擇一種有效且安全的方法來保持核酸適配子的生物活性，顯得很有必要。殼聚糖(chitosan)作為一種天然的可生物降解的線性聚合物，來源豐富，理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，因為其良好的生物降解性、生物相容性、較低的免疫原性，以及突出的大分子粘附能 力，近年被廣泛應用于大分子、核酸、蛋白質(zhì)的載體研究中[10]。已有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖納米化后作為寡核苷酸的載體，可有效保護寡核苷酸免于被核酸酶所降解。因此，將殼聚糖納米微粒作為核酸適配子Seq58的載體，有望成為保持并延長Seq58生物活性的一種理想手段。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑，即核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP，并通過實驗初步評價所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP對抗血清核酸酶及緩釋適配子的能力、與細胞結(jié)合的情況以及其生物活性。本發(fā)明的再一目的是提供所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備方法。本發(fā)明的還一目的是提供所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下措施:本發(fā)明所述針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: I ;所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100 300nm，電位為+4 +28mV ;所述核酸適配子為Seq58。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比為20 30: I。優(yōu)選地，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP中殼聚糖的平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的制備方法，包括如下步驟:(I)核酸適配子的制備將核酸適配子Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，-20°C冷藏備用；(2)殼聚糖溶液的制備
精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計算,用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至5 6，加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml，用0.22 μ m —次性針頭式濾器過濾后，置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液；(3)核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: 1，滴加速度為40 50滴/min，至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06ml Tween-80 (2%, v/v),并加入雙蒸水，定容至6ml,室溫孵育30min,最后用
0.22 μ m —次性針頭式濾器過濾后，置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得核酸適配子納米制劑 CS(Seq58)_NP。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP的生物活性與使用濃度有關(guān)。當CS(Seq58)-NP使用濃度大于25nM時，能夠明顯地抑制成纖維細胞的增殖及轉(zhuǎn)分化。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP可按本領(lǐng)域已知方法制成對抗斑痕形成的外用凝膠制劑，所述外用凝膠制劑為透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠或聚丙烯酸凝膠，所述外用凝膠制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP可按本領(lǐng)域已知方法制成對抗斑痕形成的外用生物膜制劑，所述外用生物膜制劑為透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜，所述外用生物膜制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP可用于制備應用于實驗室及臨床的TPR II檢測試劑盒 。本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP可與藥學上可以接受的輔料或其它藥物組成組合物。優(yōu)選地，上述所述的組合物為由核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP與緩釋材料組成的組合物。本發(fā)明通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及體外緩釋的方法評價所述核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP對抗血清核酸酶及緩釋適配子的能力，表明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能夠?qū)寡宄^48小時，CS (Seq58) -NP能夠緩釋核酸適配子Seq58超過96小時；接著通過熒光標記CS(Seq58)_NP，及與人tenon’ s囊成纖維細胞共培養(yǎng)，評價CS(Seq58)_NP與細胞結(jié)合的情況，表明CS (Seq58)-NP能與T β R II特異性結(jié)合；進一步對CS (Seq58) -NP的生物活性研究表明，CS(Seq58)_NP能抑制成纖維細胞增殖達35.1% ;在血清存在的情況下，CS(Seq58)-NP能夠明顯抑制人tenon’ s囊成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化超過36小時，抑制率達44.8%，遠高于未經(jīng)包裹時的裸核酸適配子Seq58。亦即是說，本發(fā)明所述核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能競爭性地抑制TGF-β與其受體Τβ R II結(jié)合，并具有良好的血清穩(wěn)定性及緩釋性，有望成為抗青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成及防治其他纖維化相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。本發(fā)明的實施對嚴重危害人類健康的青光眼及其他纖維化相關(guān)疾病的預防及治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖1為核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP對抗血清的能力。圖2為核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的緩釋能力。圖3為熒光標記以后的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP與細胞的結(jié)合情況。圖4為核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細胞增殖的能力。圖5為核酸適配子納米制 劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的能力。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容作進一步的詳細描述。應理解，本發(fā)明的實施例只用于說明本發(fā)明而非限制本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識和慣用手段，做出的各種替換和變更，均應包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實施例1核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的制備(I)核酸適配子溶液的制備將上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成的核酸適配子序列Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，_20°C冷藏備用；(2)殼聚糖溶液的制備精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計算,用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)PH值至5 6，加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml，用0.22 μ m —次性針頭式濾器過濾后，置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液； (3)核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP的制備將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml交聯(lián)劑三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比分別為1: 1、5: 1、10: 1、20: 1、30: I，滴加速度為40 50滴/min,至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06mlTween-80(2%，V/V)，并加入雙蒸水定容至6ml,室溫孵育30min,最后用0.22 μ m—次性針頭式濾器過濾后,置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得不同殼聚糖:Seq58摩爾比的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP。本實施例制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP為球形微粒，粒徑為100 300nm,電位為 +4 +28mV。實施例2核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的血清穩(wěn)定性驗證取適量實施例1制得的各CS(Seq58)_NP，以及未經(jīng)包裹的裸Seq58加入到EP管中，保持各EP管中Seq58含量為0.018nmol，用雙蒸水定容至0.9ml (各管中Seq58終濃度都為20nM);再向各EP管中加入0.1ml胎牛血清，空白對照組不加血清，每個殼聚糖:Seq58摩爾比的CS (Seq58) -NP均設(shè)5管；將各EP管置于37° C水浴中，每隔一定時間段(2小時、6小時、12小時、24小時、48小時)從每組EP管中各取I支EP管，置于65° C水浴IOmin以滅活血清酶的活性，再向其中加入5μ I肝素鈉(1000IU/ml)以解析出CS(Seq58)_NP中的Seq58 ;每組充分混勻后取40 μ I上樣，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%，含7Μ尿素)，在I X TBE溶液中恒壓200V電泳Ih ;電泳完畢后，將凝膠置于1: 10000的SYBR-Green II染料中染色40min,最后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察未被酶解的Seq58條帶。結(jié)果表明，按不同殼聚糖:Seq58摩爾比制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP在血清中的穩(wěn)定性不同，說明各組制劑對抗血清核酸酶的能力各不相同(見圖1)。其中，殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP，在經(jīng)過48小時的反應以后，仍然有一半左右的Seq58未受到血清酶的降解，表明按殼聚糖:Seq58摩爾比20及以上制備出的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP具有良好的血清穩(wěn)定性，能保護適配子Seq58免于核酸酶降解。實施例3核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的緩釋能力驗證取適量實施例1制備的各殼聚糖:Seq58摩爾比的CS (Seq58)-NP，加入到EP管中，保持各管中Seq58含量為0.02nmol，用pH=7的PBS定容至Iml ;將各管置于37° C恒溫搖床上，每隔一定時間段(12小時、24小時、36小時、48小時、72小時、96小時)取出各管于4° C下離心I小時(IOOOOrpm),取0.8ml上清液在260nm處測定吸光度,計算該時間段釋放出的Seq58含量，再補加0.8ml PBS緩沖液回EP管，繼續(xù)放回37° C恒溫搖床上，最后計算各時間點累計釋放Seq58百分率，以累計釋放Seq58百分率對時間作圖。結(jié)果表明，按不同殼聚糖:Seq58摩爾比制備的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP的緩釋能力各不相同，緩釋時間大致與殼聚糖的含量成正比(見圖2)。其中，殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP，96小時時尚未釋放完所有的Seq58，但殼聚糖:Seq58摩爾比為20及30的CS(Seq58)_NP緩釋情況并無統(tǒng)計學差異，表明殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP具有良好的緩釋能力，能夠緩釋Seq58超過9 6小時。本發(fā)明申請人優(yōu)選殼聚糖:Seq58摩爾比為20的CS(Seq58)-NP,因為殼聚糖含量增高會降低CS(Seq58)_NP的載藥量。實施例4核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的細胞結(jié)合能力驗證按實施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS(Seq58)_NP，在交聯(lián)的過程中加入熒光蛋白FITC，制得熒光標記的核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP-FITC ；以亂序的Seq58 (Scrambled Seq58)作為對照組，也按實施例1的方法制備出 CS (Sera)-NP-FITC。取第4代人Tenon’ s囊成纖維細胞(HTFs), I X IO5個細胞每孔接種于6孔板，于37° C 二氧化碳孵箱中孵育24小時；將熒光標記的核酸適配子納米制劑CS (Seq58)-NP-FITC及對照組CS(Scra)-NP-FITC分別加入6孔板中，與細胞共同孵育2小時；2小時后使用PBS于搖床上洗滌三遍，每遍10分鐘，再加入4%多聚甲醛固定細胞，封片液封片；最后于激光共聚焦顯微鏡下觀察CS (Seq58) -NP-FITC及CS (Sera) -NP-FITC與細胞的結(jié)合情況。結(jié)果表明，激光共聚焦顯微鏡下能夠觀察到熒光標記的核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP-FITC呈綠色熒光，并且與細胞排列相一致；而使用亂序Seq58制備出的CS (Sera) -NP-FITC組幾乎無熒光信號(見圖3 )，表明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP能夠特異性與轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體(Ti3R II)結(jié)合。實施例5核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細胞增殖的能力驗證按實施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS (Seq58)-NP。
取第4代人Tenon’ s囊成纖維細胞(HTFs)，I X IO4個細胞每孔接種于96孔板，于37° C 二氧化碳孵箱中孵育24小時。各孔分別加入濃度為5、10、25、50、100nM的CS (Seq58) -NP,并加入2ng/ml的TGF- β 2，共同刺激細胞48小時，對照組為相應濃度的空白殼聚糖CS-NP加入2ng/ml的TGF-β 2，陰性對照組只加培養(yǎng)基，陽性對照組只加TGF-β 2 ；每組設(shè)3個副孔，48小時以后，按MTT試劑盒說明書進行操作。最后于酶標儀上檢測各孔在570nm 處的吸光度；細胞相對增值率=(Asample-ADMEM/ATCF_02-ADMEM) X 100。結(jié)果表明，核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP能夠明顯抑制成纖維細胞的增殖，并且與濃度呈正相關(guān)(見圖4)。相比之下空白殼聚糖也具有輕微的抑制成纖維細胞增殖的能力，但比CS (Seq58) -NP弱很多。當核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP使用濃度為25nM，50nM，IOOnM時，能夠抑制成纖維細胞的增殖分別達25.8%，32.4%，35.1%，即當核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP使用濃度大于25nM時，能夠明顯地抑制成纖維細胞的增殖。實施例6核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP抑制成纖維細胞轉(zhuǎn)分化的能力驗證按實施例1的方法制備殼聚糖:Seq58摩爾比為20及以上的CS (Seq58)-NP。取第4代人Tenon’s囊成纖維細胞(HTFs)，使用含10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基于50ml細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞長至70%融合左右，按如下分組刺激細胞:2ng/ml的TGF- β 2，2ng/ml 的 TGF- β 2+25ηΜ 的 Seq58，以及 2ng/ml 的 TGF- β 2+25ηΜ 的 CS (Seq58) -NP,分別刺激細胞6小時，12小時，24小時，48小時。刺激結(jié)束以后，裂解細胞，提取總蛋白，Western Blot法檢測各組細胞中a-SMA (成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的標志性蛋白)的表達情況。結(jié)果表明，在血清存在的情況下，未經(jīng)包裹的裸Seq58僅能抑制TGF-β 2介導的HTFs轉(zhuǎn)分化12小時左右，而制成核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP以后，能夠抑制TGF-β 2介導的HTFs轉(zhuǎn)分化超過36小時，抑制率達44.8% (見圖5)。實施例7核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP的用途取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP,按本領(lǐng)域常規(guī)方法制成對抗斑痕形成的透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠、聚丙烯酸凝膠等外用凝膠制劑，其外用凝膠制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS (Seq58) -NP,按本領(lǐng)域常規(guī)方法制成對抗斑痕形成的透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜等外用生物膜制劑，其外用生物膜制劑中核酸適配子納米制劑的濃度為大于25nM。取本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS(Seq58)_NP按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備成應用于實驗室及臨床的TPR II檢測試劑盒。本發(fā)明核酸適配子納米制劑CS(Seq58)-NP還可與藥學上可以接受的輔料或其它藥物組成組合物，包括與緩釋材料組成的組合物。參考文獻[I]Grotendorst GR.Connective tissue growth factor: a mediator ofTGF-beta action on fibroblasts.Cytokine Growth Factor Rev, 1997, 8:171 - 179.
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該專利由國家自然科學基金面上項目(81170852)、全軍醫(yī)學科技“十二五”科研項目(CWS11J137)資助。
權(quán)利要求
1.一種針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述核酸適配子納米制劑為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: I ;所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100 300nm,電位為+4 +28mV ;所述核酸適配子為Seq58。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述殼聚糖與核酸適配子的摩爾比為20 30: I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑，其特征在于:所述殼聚糖的平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%。
4.一種制備如權(quán)利要求1所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的方法，包括如下步驟: (1)核酸適配子溶液的制備 將核酸適配子Seq58充分溶解于TE緩沖液中，得lnmol/μ I的核酸適配子溶液，_20°C冷藏備用； (2)殼聚糖溶液的制備 精密稱取平均分子量為100000 200000，脫乙酰度>90%的殼聚糖溶于2%醋酸中，其中醋酸用量按照殼聚 糖質(zhì)量:醋酸體積=Ig: 200 300mL計算，用0.lmol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5 6，再加入雙蒸水至殼聚糖的濃度為1.5 2.0mg/ml ;用0.22 μ m —次性針頭式濾器過濾后，置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，得殼聚糖溶液； (3)核酸適配子納米制劑的制備 將步驟(I)制備的lnmol/μ I核酸適配子溶液加入到1.0 1.5ml三聚磷酸鈉溶液中，所述三聚磷酸鈉溶液中三聚磷酸鈉的濃度為0.9mg/ml，得混合液；用5號針頭將該混合液逐滴滴入到2.0 3.5ml步驟(2)制備的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20: 1，滴加速度為40 50滴/min，至溶液出現(xiàn)白色乳光，再向其中滴加0.04 0.06ml Tween-80 (2%, v/v),并加入雙蒸水，定容至6ml,室溫孵育30min,最后用0.22 μ m —次性針頭式濾器過濾后，置于無菌小瓶中，4°C冷藏備用，即得針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑。
5.權(quán)利要求1 3之一所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備對抗斑痕形成的外用凝膠制劑的用途，其特征在于:所述外用凝膠制劑為透明質(zhì)酸鈉凝膠、殼聚糖凝膠或聚丙烯酸凝膠，所述外用凝膠制劑中針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的濃度為大于25ηΜ。
6.權(quán)利要求1 3之一所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備對抗斑痕形成的外用生物膜制劑的用途，其特征在于:所述外用生物膜制劑為透明質(zhì)酸鈉膜、殼聚糖膜或脂質(zhì)體膜，所述外用生物膜制劑中針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑的濃度為大于25ηΜ。
7.權(quán)利要求1 3之一所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑用于制備應用于實驗室及臨床的轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體檢測試劑盒的用途。
8.權(quán)利要求1 3之一所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑與藥學上可以接受的輔料或其它藥物組成的組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的針對轉(zhuǎn)化生子因子βII型受體的核酸適配子納米制劑與藥學上可以接受的輔料或其它藥物組 成的組合物，其特征在于:所述組合物由針對轉(zhuǎn)化生子因子β II型受體的核酸適配子納米制劑與緩釋材料組成。
全文摘要
本發(fā)明提供一種針對轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑。該核酸適配子納米制劑為由殼聚糖和核酸適配子組成的球形微粒，殼聚糖包裹核酸適配子，其中殼聚糖與核酸適配子的摩爾比大于20∶1；所述核酸適配子納米制劑的粒徑為100～300nm，電位為+4～+28mV；所述核酸適配子為Seq58。本發(fā)明還提供所述核酸適配子納米制劑的制備方法。本發(fā)明針對轉(zhuǎn)化生子因子βⅡ型受體的核酸適配子納米制劑能競爭性地抑制TGF-β與其受體TβRⅡ結(jié)合，并具有良好的血清穩(wěn)定性及緩釋性，有望成為抗青光眼濾過術(shù)后瘢痕形成及防治其他纖維化相關(guān)疾病的新型生物工程藥物。
文檔編號A61K31/7088GK103230369SQ20131012120
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者謝琳, 陳俠, 李磊, 朱曉燕 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院