專利名稱：一種磁性水溶性富勒烯及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種磁性水溶性富勒烯及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
作為碳元素的第三種同素異形體富勒烯家庭的發(fā)現(xiàn)，是上世紀(jì)自然科學(xué)發(fā)展史最重要的突破之一。Kroto等三人也因為他們在富勒烯研究中開創(chuàng)性的工作而榮獲1996年諾貝爾化學(xué)獎。富勒烯以其獨特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)倍受人們重視，近十年來，幾乎全世界所有著名大學(xué)和研究所的科學(xué)家都進行了與富勒烯有關(guān)的研究。它已成為當(dāng)今物理、化學(xué)、材料及生命科學(xué)研究者共同關(guān)心的課題。富勒烯分子的重要科學(xué)意義，被美國《Science》雜志評為1991年的“明星分子”。在納米材料中，包括富勒烯、碳納米管在內(nèi)的碳納米材料一直是近年來國際科學(xué)的前沿領(lǐng)域之一。富勒烯是由60個碳原子組成的球形分子，包含12個五元環(huán)和20個六元環(huán)，直徑為0.71nm。近年來，富勒烯在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究相當(dāng)引人矚目，研究發(fā)現(xiàn)富勒烯具有多種特殊的生物學(xué)效應(yīng):(I)可抑制多種酶的活性，包括HIV蛋白酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶；(2)對腫瘤細胞顯示出細胞毒性；(3)具有神經(jīng)保護劑的作用；(4)還具有在可見光照射下產(chǎn)生氧自由基、切割DNA的作用。富勒烯作為一種優(yōu)良的光敏劑表現(xiàn)在其在可見光照射的情況下可以產(chǎn)生活性氧，活性氧包括單線態(tài)氧、超氧負離子等。富勒烯光照下產(chǎn)生活性氧為高度反應(yīng)性的，并且可以表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，比如裂解細胞中的DNA，抑制細胞的有絲分裂以及生長，還可以抑制細胞蛋白水解酶的活性。由此推斷，富勒烯可以用于腫瘤的治療。為此利用富勒烯作為光敏劑開展光動力療法，即使其在腫瘤組織中蓄積，利用光照產(chǎn)生活性氧來選擇性的破壞腫瘤組織。目前納米磁性材料作為一種安全、高效、經(jīng)濟的醫(yī)學(xué)藥用載體，已在癌癥研究中表現(xiàn)出廣闊的發(fā)展空間。作為生物磁性`載體材料應(yīng)具有粒徑較小，毒性較低，磁性較好，造價低廉，物理化學(xué)性能穩(wěn)定以及生物相容性良好等特性。功能化的磁性富勒烯具有獨特的籠狀結(jié)構(gòu)，粒徑小，物理化學(xué)性能優(yōu)異且磁性能良好，而且表面接上的水溶性功能基團可以顯著改善富勒烯在動物體液中的生物相容性和流動性，有利于在外加磁場的作用下將藥物直接輸運至病灶，從而增強療效、減少副作用，因此成為靶向載體材料研究的熱點。磁共振成像(MRI)是一種頗具潛力的診斷方法。它是以人體在核磁共振過程中所散發(fā)的電磁波以及與這些電磁波有關(guān)的參數(shù)，如質(zhì)子密度、弛豫時間等作為成像參數(shù)進行成像。磁共振成像造影劑一定是磁性物質(zhì)，能同氫核發(fā)生磁性的相互作用，主要通過影響自旋晶格弛豫時間Tl、自旋-自旋弛豫時間T2等來改變信號強度，進而提高MRI診斷的敏感性和特異性，增強信號對比度和提高軟組織圖像的分辨率，在早期腫瘤的診斷中具有很大的價值。功能化的磁性富勒烯可作為磁共振成像造影劑，利用其磁性和水溶性，進入體內(nèi)后能選擇性分布，在靶器官富集并停留一段時間，使被觀測的組織或器官的弛豫速率比其他部位(背景部位)有更大的改變，提高核磁共振成像(MRI)診斷的敏感性和特異性，增強MRI的效果。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述情況，為解決現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種磁性水溶性富勒烯及其制備方法和應(yīng)用，可有效解決現(xiàn)有富勒烯水溶性弱，生物相容性低，靶向性差的問題。本發(fā)明的技術(shù)方案為:在富勒烯分子上負載有磁性的四氧化三鐵和親水性基團，所述的四氧化三鐵和富勒烯的質(zhì)量含量比為1-10:1 ;其制備方法為:1)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g，攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，氮氣保護，室溫15-25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C60-COOH) ；3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg，充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三價鐵鹽0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)IOh后，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C6(l-C00H-Fe304);所述的三價鐵鹽為氯化鐵、溴化鐵、碘酸鐵、高氯酸鐵、次氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵、磷酸一氫鐵、磷酸二氫鐵、碳酸鐵、醋酸鐵、硅酸鐵、高錳酸鐵、硫氰酸鐵中的任一種；4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基水溶性物質(zhì)200mg和EDC.HCllOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性富勒烯；所述的氨基水溶性物質(zhì)為氨基聚乙二醇2000 (氨基PEG2000)、氨基聚乙二醇4000 (氨基PEG4000)、氨基聚乙二醇6000(氨基PEG6000)、氨基聚乙二醇8000 (氨基PEG8000)、聚乙烯亞胺(PEI )、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氨基透明質(zhì)酸、葉酸、氨基酸、核酸、氨基糖類、氨基淀粉類、氨基纖維素中的任一種。本發(fā)明制備的磁性水溶性富勒烯不會對富勒烯本身的特性進行破壞，具有良好的磁靶向性，水分散性強，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式
做詳細說明。本發(fā)明所述的一種磁性水溶性富勒烯，在富勒烯分子上負載有磁性的四氧化三鐵和親水性基團，所述的四氧化三鐵和富勒烯的質(zhì)量含量比為1-10:1。所述的富勒烯為C6tl富勒烯。所述的磁性水溶性富勒烯的粒徑為30-300nm。所述的磁性水溶性富勒烯的制備方法，由以下步驟實現(xiàn):I)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯 ，氮氣保護，室溫15_25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；
2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C6tl-COOH)；3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg，充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三價鐵鹽0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，2000C反應(yīng)IOh后，所得產(chǎn)物加入無水乙醇50-100ml，超聲0.5_lh，再通過孔徑為0.22 μ m的聚偏氟乙烯微孔濾膜抽濾得濾餅，用20ml無水乙醇潤洗濾餅，再將濾餅轉(zhuǎn)入500ml的燒杯中，加入無水乙醇按照上述方法無水乙醇洗滌3次；再將洗滌后的濾餅轉(zhuǎn)入500ml的燒杯中，加入超純水50-100ml，超聲0.5_lh后再通過孔徑為0.45 μ m的混合纖維素脂微孔濾膜抽濾得濾餅，用20ml超純水潤洗濾餅，如此重復(fù)超純水洗滌5次，然后60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C6(l-C00H-Fe304);所述的三價鐵鹽為氯化鐵、溴化鐵、碘酸鐵、高氯酸鐵、次氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵、磷酸一氫鐵、磷酸二氫鐵、碳酸鐵、醋酸鐵、硅酸鐵、高錳酸鐵、硫氰酸鐵中的一種；4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基水溶性物質(zhì)200mg和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl) IOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15_25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾得濾餅，將濾餅轉(zhuǎn)入500ml的燒杯中，加入無水乙醇50_100ml,超聲0.5_lh后再通過0.22 μ m的聚偏氟乙烯微孔濾膜抽濾，并用20ml無水乙醇潤洗濾餅，如此重復(fù)操作用無水乙醇洗滌10次，然后60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性富勒烯；所得的氨基水溶性物質(zhì)為氨基聚乙二醇2000 (氨基PEG2000)、氨基聚乙二醇4000 (氨基PEG4000)、氨基聚乙二醇6000 (氨基PEG6000)、氨基聚乙二醇8000 (氨基PEG8000)、聚乙烯亞胺(PEI)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、氨基透明質(zhì)酸、葉酸、氨基酸、核酸、氨基糖類、氨基淀粉類、氨基纖維素中的任一種。本發(fā)明磁性水溶性富勒烯作為光敏劑的應(yīng)用分為體外和體內(nèi)兩部分:I)體外:將制得的磁 性水溶性富勒烯溶于水中制成溶液，加入到癌細胞A中進行培養(yǎng)，給藥后3h后用光源B光照，光照30-120min，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，測定癌細胞A的存活率。2)體內(nèi):將制得的磁性水溶性富勒烯溶于水中制成溶液，在外加磁場的作用下，靜脈注射到荷瘤小鼠C體內(nèi)，給藥后3h后用光源D光照，光照時間為30-120min，測量荷瘤小鼠C的腫瘤體積大小。上述步驟I)中的癌細胞A為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟I)中的光源B為:400-800nm波長的寬波長光源或者激光中的一種。優(yōu)選532nm激光。上述步驟2)中的荷瘤小鼠C為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2)中的光源D為:400-800nm波長的寬波長光源或者激光中的一種。優(yōu)選532nm激光。本發(fā)明作為光敏劑來進行光動力治療體內(nèi)深度腫瘤時，這些光源不能夠穿透照射時，可以通過適用與所述部位的方法來改善外部光源照射的穿透力進行腫瘤的治療。本發(fā)明作為光敏劑可以制成任意的藥物制劑劑型，比如:注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯透明質(zhì)酸聚合物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。本發(fā)明一種磁性水溶性富勒作為藥物轉(zhuǎn)運載體在腫瘤治療中的應(yīng)用，分為以下幾個步驟:I)將制得的磁性水溶性富勒烯衍生物和抗腫瘤藥物A通過方式B進行結(jié)合。2)將裝載藥物的磁性水溶性富勒烯衍生物進行抗腫瘤細胞C和在外加磁場的作用下體內(nèi)的抗腫瘤D的評價。上述步驟I)中的抗腫瘤藥物A為:難溶性抗腫瘤藥物、水溶性藥物和核酸藥物，比如:多西紫杉醇、紫杉醇、阿霉素、順鉬、卡鉬、柔紅霉素、寡義反核苷酸、小干擾RNA和酶類藥物中的一種或幾種。上述步驟I)中的方式B為:超聲、攪拌、探超和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)中的一種或幾種。

上述步驟2)中的腫瘤細胞C為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟2)中的腫瘤D為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。在外加磁場的作用下，本發(fā)明作為藥物轉(zhuǎn)運載體可以更多的分布在腫瘤組織中，與正常組織相比，它可以長期的高濃度的保留在腫瘤組織中，這樣當(dāng)采用適當(dāng)?shù)氖侄问褂霉庠催M行照射時能夠在腫瘤組織中產(chǎn)生更多的活性氧，并且可以使其裝載的藥物在腫瘤部位濃度提高。但也會分布在正常的組織器官中，為了避免產(chǎn)生的活性氧對正常組織產(chǎn)生損傷，可以通過一些手段來加以改善，比如:可以在磁性水溶性富勒烯衍生物上裝載一些具有靶向性質(zhì)的靶頭，也可以使用抗體等手段介導(dǎo)，可以使用臨床手段比如說內(nèi)窺鏡的方式來直接輸送載藥系統(tǒng)到達靶組織，聚焦光照面積等方式。本發(fā)明一種磁性水溶性富勒作為藥物轉(zhuǎn)運載體可以制成任意的藥物制劑劑型，t匕如:注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的富勒烯透明質(zhì)酸聚合物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射等。本發(fā)明一種磁性水溶性富勒作為磁共振成像造影劑在腫瘤治療中的應(yīng)用，具體步驟如下:將制得的磁性水溶性富勒烯衍生物溶于水中制成溶液，靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，注射后24h后對荷瘤小鼠進行T2WI磁共振成像。上述步驟中的荷瘤小鼠為:器官表面或者內(nèi)部出現(xiàn)的各種實體瘤，肺癌，鼻咽癌，食道癌，胃癌，肝癌，大腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病，胰腺癌，宮頸癌，喉癌，甲狀腺癌，舌癌，腦瘤(顱內(nèi)腫瘤)，小腸腫瘤，膽囊癌，膽管癌，腎癌，前列腺癌，陰莖癌，睪丸腫瘤，子宮內(nèi)膜癌，絨毛膜癌，陰道惡性腫瘤，外陰惡性腫瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，皮膚癌，惡性黑色素瘤中的一種。上述步驟中的核磁共振成像掃描參數(shù)為:橫斷位SE-T2WI，TR1000-5000ms, TE100-110ms, F0V10-8000mm,層厚 0.8_3臟，層間距 0.2_lmm，矩陣 256X256本發(fā)明的磁性水溶性富勒烯衍生物作為磁共振成像造影劑可以制成任意的制劑劑型，比如:注射劑、注射用無菌粉針、分散劑、貼劑、凝膠劑、植入劑等。本發(fā)明的磁性水溶性富勒烯衍生物可以加入各種制劑的添加劑，比如:生理鹽水、葡萄糖、緩沖溶液和防腐劑等以便于制備成需要的劑型。給藥方式可以為:靜脈注射、肌肉注射、瘤內(nèi)注射和皮下注射、透皮給藥、體內(nèi)植入方式等。本發(fā)明在具體實施中可由以下實施例給出:實施例1I)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，氮氣保護，室溫15_25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C6tl-COOH)84mg。3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)IOh后，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C6(l-C00H-Fe304) 86mg。4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基聚乙二醇2000200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC ^HClMOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15_25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙二醇富勒烯(C60-Fe304-PEG2000)37mg。實施例2
I)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，氮氣保護，室溫15_25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；
2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C6tl-COOH)86mg。3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C6(l-C00H-Fe304) 89mg。4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，聚乙烯亞胺(PEI) 200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC ^HClMOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15_25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙烯亞胺富勒烯(C60-Fe304-PEI) 39mg。實施例3I)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml
溴代丙二酸二乙酯，氮氣保護，室溫15_25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C6tl-COOH)82mg0
3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，硝酸鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C6(l-C00H-Fe304) 83mg。4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基聚乙二醇2000200mg和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC -HCDlOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙二醇富勒烯(C60-Fe304-PEG2000)33mg。本發(fā)明經(jīng)反復(fù)10次以上實驗均取得了相同或相似的結(jié)果，表明方法穩(wěn)定可靠，并經(jīng)活性實驗取得了有益的技術(shù)效果，有關(guān)實驗資料如下:使用光照射對本發(fā)明的磁性水溶性富勒烯對腫瘤細胞生長的抑制活性的測定。通過光照射的磁性水溶性富勒烯在體外抗腫瘤活性。將PC3前列腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將PC3細胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%，青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5%C02，每2 3天傳代一次。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ I，鋪板使待測細胞調(diào)密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5%C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(12.5、25、50、100μ g/ml)的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物，設(shè)置復(fù)孔為4 6個。光照組放置在400W可見光中60min,保持光照過程中溫度在37°C,光照結(jié)束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，對于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10%TCA200y 1，4°C放置lh。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150yll0mmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測定每孔的OD值。存活率的計算公式:存活率=實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值，實驗表明，當(dāng)用光照射60min，本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物的加入直接影響了 PC3細胞的增殖。光照射時，本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物的體內(nèi)抗腫瘤活性測定。取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射
0.3ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中36只腫瘤體積> IOOmm3昆明小鼠，隨機分為6組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；( 2)生理鹽水激光組；(3)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物組；(4)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物激光組；(5)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物加外磁場組；(6)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物激光加外磁場組。6組均采用靜脈給藥的方式，其中外磁場組的全過程在外加磁場的作用下進行，光照組使用的光源為532nm綠相光源，功率為300mW，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時間為lOmin。每2d給藥一次，每次注射生理鹽水或者2mg/ml的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物100 μ 1，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱其體重并使用游標(biāo)卡尺測量小鼠肉瘤的長徑
(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體積V= Iilil計算腫瘤體積。
2當(dāng)給藥磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物合并激光照射和外加磁場時，小鼠的腫瘤體積的增加得到了明顯的抑制，表明磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物能作為藥物轉(zhuǎn)運載體，在腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物IOmg和多西紫杉醇(由北京怡和生物科技有限公司提供)20mg，加入超純水2mL，混合均勻后，探頭超聲(工作3s，間隔6s，工作12次，功率為400W)，將探超完成的樣品進行離心(4000rpm，15min)除去大顆粒。得到了以磁性水溶性富勒烯衍生物為載體的抗腫瘤藥物多西紫杉醇給藥系統(tǒng)。通過40倍(體積比)乙醇提取出給藥系統(tǒng)中包封的多西紫杉醇，紫外分光光度計測定以本發(fā)明的產(chǎn)品為載體包封的多西紫杉醇的含量，載藥量為2.lmg/mL，磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物可以吸附抗腫瘤藥物多西紫杉醇，提高了多西紫杉醇在水中的溶解度，可以作為抗腫瘤藥物的載體使用。本發(fā)明中磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的粒子大小和表面帶電量的確定，使用Nano-ZS90型激光粒度分析儀進行測定，折射率設(shè)置為1.590，吸收系數(shù)設(shè)置為0.010，溫度設(shè)置為25°C，測量模式設(shè)置為自動，以Z平均統(tǒng)計值作為測定結(jié)果。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結(jié)果。介電常數(shù)設(shè)置為79，黏度系數(shù)設(shè)置為0.8872，溫度設(shè)置為25°C，測量模式設(shè)置為自動。每一水平縮合體均配制3份，每份測量一次，取三次測量值的平均值作為測量結(jié)果。測得的結(jié)果是粒徑為30-300nm，電位是_30mV。
本發(fā)明中磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體外抗腫瘤活性，將PC3前列腺癌細胞(由上海細胞庫提供)用作待考察的癌細胞。將PC3細胞培養(yǎng)在含胎牛血清(FBS) 10%,青鏈霉素混合液1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件為37°C、5%C02,每2 3天傳代一次。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，96孔板每孔加入200 μ 1，鋪板使待測細胞調(diào)密度至6 X IO3個/孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。置于5%C02，37°C孵育24h，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度(0、0.5、1、2、4、6、8 μ g/ml)的本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇，不加入本發(fā)明中的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇為對照組，設(shè)置復(fù)孔為4 6個。光照組放置在400W可見光中60min，保持光照過程中溫度在37°C，光照結(jié)束后用鋁箔包裹細胞板置于CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，對于不光照組而言，則直接用鋁箔包裹細胞板置于C02培養(yǎng)箱中孵育24h，終止培養(yǎng)，吸出含藥培養(yǎng)基，每孔用150 μ I PBS洗2遍，加入預(yù)冷的10%TCA200y 1，4°C放置lh。倒掉固定液，每孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100 μ I的SRB溶液，靜置放置lOmin，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸洗5遍，空氣干燥。結(jié)合的SRB用150 μ IlOmmol/L非緩沖Tris堿溶解。在515nm處測定每孔的OD值。抑制率的計算公式:抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值，其中實驗組和對照組均為扣除空白對照組后的值。結(jié)果表明，本發(fā)明中的磁性水溶性富勒烯衍生物作為藥物載體時能裝載藥物進入腫瘤細胞內(nèi)部，更好的發(fā)揮出抗腫瘤藥物的療效，而且結(jié)合光照后，能夠更明顯的抑制腫瘤細胞的增殖。本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇給藥系統(tǒng)的體內(nèi)抗腫瘤活性，取小鼠S180 腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X IO6個/ml的細胞懸液,皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后,取其中36只腫瘤體積> IOOmm3昆明小鼠，隨機分為6組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；(2)多西紫杉醇注射液組；(3)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇組；(4)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇光照組；(5)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇加外磁場組；(6)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇光照加外磁場組。多西紫杉醇注射液組、磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇組、磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇光照組、磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇加外磁場組和磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇光照加外磁場組的多西紫杉醇給藥劑量相等，都為25.125mg/kg。6組均采用靜脈給藥的方式，其中光照組使用的光源為532nm綠相光源，功率為300mW，給藥3h后激光照射腫瘤部位，一次照射時間為lOmin。每2d給藥一次，共給藥7次。整個實驗過程中每日觀察小鼠生活狀態(tài)，每2d稱其體重并使用游標(biāo)卡尺測量小鼠肉瘤的長徑(A)與短徑(B)，按公式腫瘤體
積V= 計算腫瘤體積。
Am當(dāng)給藥本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物-多西紫杉醇時，小鼠的腫瘤體積的增加比起多西紫杉醇注射液得到了明顯的抑制。合并激光照射和外加磁場時，小鼠的腫瘤體積的增加得到了更加明顯的抑制。在做上述實驗的同時，還采用其他光源以及抗腫瘤藥物做了類似的實驗，均取得了相同和相類似的結(jié)果，本發(fā)明分組科學(xué)，方法穩(wěn)定可靠，其他實驗結(jié)果不再一一列舉。
本發(fā)明的磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物作為磁共振成像造影劑在腫瘤治療中的應(yīng)用活性實驗，取小鼠S180腹水瘤細胞，用注射用生理鹽水以3:1比例稀釋后，每只小鼠于腹腔注射0.3ml，小鼠喂養(yǎng)7天后，抽取小鼠S180腹水瘤細胞，計數(shù)后以注射用生理鹽水稀釋成濃度為2X 106個/ml的細胞懸液，皮下接種與小鼠右前肢上部。小鼠接種腫瘤7d后，取其中12只腫瘤體積> IOOmm3昆明小鼠，隨機分為2組，每組6只。具體分組如下:(I)對照組(NS組):生理鹽水；(2)磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物組。對兩組小鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉0.04ml進行麻醉，固定后兩組小鼠均采用靜脈給藥的方式，其中生理鹽水200 μ I, 2mg/ml磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物生理鹽水溶液200 μ I。注射后24h后對小鼠進行T2WI磁共振成像。掃描參數(shù)為:橫斷位SE-T2WI，TR4240ms, TE1108.47ms, F0V8cm,層厚(橫斷位2mm，冠狀位3mm)，層間距1mm，矩陣256X 256。在兩組小鼠的腫瘤區(qū)域的T2WI圖像上繪制大小一致的感興趣區(qū)ROI測量腫瘤實體部分信號強度(SIT)，取其平均值，測量面積不小于6mm2。結(jié)果顯示磁性水溶性聚乙二醇富勒烯衍生物組腫瘤區(qū)域的T2WI信號與對照組小鼠相應(yīng)區(qū)域的信號相比，信號明顯減低，MRI的效果明顯增強。本發(fā)明一種磁性水溶性富勒烯不會對富勒烯本身的特性進行破壞，測試結(jié)果表明，本發(fā)明具有良好的磁靶向性，水分散性強，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。 本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為抗腫瘤光動力治療的一種良好的光敏劑,測試表明無論是體外還是體內(nèi)在光照的情況下都可以很好的抑制腫瘤細胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，在體內(nèi)合并外加磁場時更加顯著地抑制腫瘤細胞以及組織的發(fā)生和發(fā)展，而在不光照的情況下本發(fā)明提供的新的水溶性富勒烯對正常細胞以及組織毒副作用很小。本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，具有良好的磁靶向性，可以靶向定位于作用對象，本身有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，t匕表面積大，化學(xué)惰性高等優(yōu)點。測試結(jié)果表明，本發(fā)明提供的磁性水溶性富勒烯作為抗腫瘤藥物的載體時，粒徑 均勻，能夠提高水不溶性抗腫瘤藥物的水溶性，能夠起到一定的緩釋作用，而且還能夠更多的到達腫瘤組織中起到靶向給藥的作用，結(jié)合光照和外加磁場還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為一種良好的磁共振成像造影劑，進入體內(nèi)后能選擇性分布，在靶器官富集并停留一段時間，使被觀測的組織或器官的弛豫速率比其他部位(背景部位)有更大的改變，提高核磁共振成像(MRI)診斷的敏感性和特異性，增強MRI的效果。測試結(jié)果表明，該衍生物具有良好的負性增強效果，對腫瘤顯影的效果良好，并且還可以結(jié)合體內(nèi)光療，利用MIR對腫瘤治療效果進行監(jiān)測。預(yù)期可以用于治療腫瘤的一種良好的光敏劑和磁共振成像造影劑，還可以作為化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)、核酸的具有磁靶向性的轉(zhuǎn)運載體，是藥物制備上的一大創(chuàng)新。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下突出的有益技術(shù)效果:I)本發(fā)明磁性水溶性富勒烯不會對富勒烯本身的特性進行破壞，具有良好的磁靶向性，水分散性強，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，制備的條件容易滿足，原料來源豐富，成本低。而且磁性水溶性富勒烯可作為磁共振成像造影劑，通過外加梯度磁場檢測物質(zhì)所發(fā)射出的電磁波，可以繪制成物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)圖像。
2)本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為抗腫瘤光動力治療的一種良好的光敏劑，光照時能夠發(fā)揮抗腫瘤的活性，而不光照時則副作用很小，可以根據(jù)光的聚焦等手段來選擇性的殺傷腫瘤組織和細胞。3)本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為一種良好的抗腫瘤藥物的載體，具有良好的磁靶向性，可以靶向定位于作用對象，有著極小的毒性，較強的水溶性，生物相容性好，比表面積大，化學(xué)惰性高，具有緩釋性，結(jié)合光照還可以發(fā)揮出更為優(yōu)秀的抗腫瘤活性。4)本發(fā)明磁性水溶性富勒烯可以作為一種良好的磁共振成像造影劑，有著較好的負性增強效果，提高核磁共振成像(MRI)診斷的敏感性和特異性，顯著增強MRI的效果。并且還可以結(jié)合體內(nèi) 光療，利用MIR對腫瘤治療效果進行監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.一種磁性水溶性富勒烯，其特征在于，在富勒烯分子上負載有磁性的四氧化三鐵和親水性基團，所述的四氧化三鐵和富勒烯的質(zhì)量含量比為1-10:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性水溶性富勒烯，其特征在于，所述的富勒烯為C6tl富勒烯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁性水溶性富勒烯，其特征在于，所述的磁性水溶性富勒烯的粒徑為30-300nm。
4.權(quán)利要求1或2或3所述的磁性水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn): 1)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，在在氮氣保護下下，室溫15-25°C繼續(xù)攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C 抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯； 2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C60-C00H)； 3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg，充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三價鐵鹽0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)IOh后，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C60-C00H-Fe304);所述的三價鐵鹽為三氯化鐵、溴化鐵、碘酸鐵、高氯酸鐵、次氯酸鐵、硝酸鐵、硫酸鐵、硫化鐵、磷酸鐵、磷酸一氫鐵、磷酸二氫鐵、碳酸鐵、醋酸鐵、硅酸鐵、高錳酸鐵、硫氰酸鐵中的任一種； 4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基水溶性物質(zhì)200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽IOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性富勒烯；所述的氨基水溶性物質(zhì)為氨基聚乙二醇2000、氨基聚乙二醇4000、氨基聚乙二醇6000、氨基聚乙二醇8000、聚乙烯亞胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、氨基透明質(zhì)酸、葉酸、氨基酸、核酸、氨基糖類、氨基淀粉類、氨基纖維素中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁性水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn): 1)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，在在氮氣保護下下，室溫15-25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯； 2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C60-C00H)； 3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比I: 19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)IOh后，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C60-C00H-Fe304)； 4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基聚乙二醇2000200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽IOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙二醇富勒烯(C60-Fe304-PEG2000)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁性水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn): 1)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，在氮氣保護下，室溫15-25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯； 2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C60-C00H)； 3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，三氯化鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，60°C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C60-C00H-Fe304)； 4)將上述四氧化三鐵負 載的富勒烯50mg，聚乙烯亞胺(PEI)200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽IOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙烯亞胺富勒烯(C60-Fe304-PEI )。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的磁性水溶性富勒烯的制備方法，其特征在于，由以下步驟實現(xiàn): I)將富勒烯IOOmg溶于IOOml甲苯中，加入氫化鈉0.5g,攪拌均勻后加入0.3ml溴代丙二酸二乙酯，在氮氣保護下，室溫15-25°C攪拌5h，過濾除去氫化鈉，旋蒸除去甲苯，60°C抽真空干燥24h，得到溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯；2)將上述溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯和氫化鈉Ig加入50ml甲苯中，80°C水解至甲苯相無色，倒去甲苯，加入20ml濃鹽酸，過濾得濾餅，取濾餅溶于IOOml甲醇中，過濾除去不溶物，旋蒸除去甲醇，60°C抽真空干燥24h，得到丙二酸取代的富勒烯(C60-C00H); 3)將上述丙二酸取代的富勒烯50mg充分溶解于20ml由乙二醇和二縮醇按照體積比1:19組成的混合溶劑中，加入醋酸鈉1.5g，硝酸鐵0.54g，超聲充分溶解后將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)10h，所得產(chǎn)物分別用無水乙醇洗滌3次，超純水洗滌5次，600C抽真空干燥24h，得到四氧化三鐵負載的富勒烯(C60-C00H-Fe304)； 4)將上述四氧化三鐵負載的富勒烯50mg，氨基聚乙二醇2000200mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽IOOmg超聲充分分散于50ml磷酸鹽緩沖液中，避光室溫15-25°C反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后用無水乙醇使其沉淀，抽濾，無水乙醇洗滌10次，60°C抽真空干燥24h，得到磁性水溶性聚乙二醇富勒烯(C60-Fe304-PEG2000)。
8.權(quán)利要求1或2或3任一項所述的磁性水溶性富勒烯與抗腫瘤藥物結(jié)合作為藥物轉(zhuǎn)運載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的抗腫瘤藥物為:化學(xué)藥物，蛋白質(zhì)，基因藥物。
9.權(quán)利要求1或2或3所述的磁性水溶性富勒烯作為磁共振成像造影劑的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1或2或3所述的磁性水溶性富勒烯作為光敏劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及磁性水溶性富勒烯及其制備方法和應(yīng)用，有效解決富勒烯水溶性弱，相容性低，靶向性差的問題，方法是，將富勒烯溶于甲苯中，加入氫化鈉、溴代丙二酸二乙酯，氮氣保護，攪拌，除去氫化鈉、甲苯，干燥得溴代丙二酸二乙酯取代的富勒烯加入甲苯中，水解至甲苯相無色，加入濃鹽酸，過濾得濾餅，除去不溶物及甲醇，干燥，得丙二酸取代的富勒烯溶解于乙二醇和二縮醇混合溶劑中，加入醋酸鈉、三價鐵鹽反應(yīng)后，洗滌，干燥，得四氧化三鐵負載的富勒烯與氨基水溶性物質(zhì)、EDC HCl超聲分散于磷酸鹽中，避光反應(yīng)后抽濾，干燥，得到磁性水溶性富勒烯；具有磁靶向性好，水分散性強，對生物體的毒性很低，物理以及化學(xué)穩(wěn)定性良好，質(zhì)量好，成本低。
文檔編號A61K47/34GK103230604SQ20131013829
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月19日
發(fā)明者史進進, 余曉媛, 王蕾, 張靜, 張振中, 馬柔柔, 劉艷, 劉瑞瑗, 高君, 潘晶晶 申請人:鄭州大學(xué)