專利名稱：一種通關(guān)藤多糖提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從中藥通關(guān)藤中提取得到的多糖提取物及其制備方法，以及它在制備抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中藥通關(guān)藤為蘿蘑科牛奶菜屬植物通關(guān)藤ifersofeflia tenacissima (Roxb) Wightet Arn的干燥藤莖，傳統(tǒng)具有止咳平喘、散結(jié)止痛等功效，現(xiàn)代藥理和臨床作用已證實(shí)其具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保肝利尿等作用。目前以通關(guān)藤單味藥材的水提取物為原料制成的上市制劑消癌平注射劑作為抗腫瘤的一線藥物在臨床廣泛使用，是現(xiàn)今治療各種癌癥的必用藥物之一，療效確切。通過國內(nèi)外有關(guān)通關(guān)藤的研究現(xiàn)狀檢索及動(dòng)態(tài)分析顯示，目前通關(guān)藤藥材的抗腫瘤活性成分文獻(xiàn)普遍公認(rèn)為C21甾體皂苷。有關(guān)通關(guān)藤多糖研究報(bào)道少見，特別是主要包含由4種多糖組分的具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性的通關(guān)藤多糖提取物研究未見報(bào)道。中國發(fā)明專利ZL02114987.9在制備通關(guān)藤注射液時(shí)，采用乙醇提取，以乙酸乙酯萃取，制得總皂苷，再將乙醇提取后藥渣水提取，醇沉制得總多糖；發(fā)明專利ZL200310121000.9制備通關(guān)藤注射液時(shí)，采用水提取藥材，經(jīng)大孔吸附樹脂，收集水洗脫 部分，濃縮并醇沉制備多糖，收集乙醇洗脫部分制備總皂苷；上述二個(gè)發(fā)明專利制備的多糖提取物與本發(fā)明相比較，已授權(quán)的發(fā)明專利均采用水提醇沉法制得總多糖，該方法為制備粗多糖的常規(guī)方法，制得的多糖為粗多糖，雜質(zhì)多，純度低，是在保證皂苷提取的同時(shí)制備多糖，多糖的提取率較低，且因其為粗多糖，其中含有的多糖組分是否均具有藥理活性尚不明確，而本發(fā)明的通關(guān)藤多糖提取物主要是由4種多糖組分組成，經(jīng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)4種多糖組分以及由它們組成的多糖提取物均具有抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的藥理活性，4種多糖組分按重量百分比計(jì)，為占總多糖提取物的50% 100%，純度高，雜質(zhì)含量少，組分明確，抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用明確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，是提供一種多糖組分明確，且純度較高的通關(guān)藤多糖提取物。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述多糖提取物的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種以上述多糖提取物為原料，用于制備藥劑學(xué)上可接受的口服制劑、注射制劑、吸入劑或局部皮膚制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還有一目的是提供的上述多糖提取物，在抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用方面的用途。采用的技術(shù)方案是:
一種通關(guān)藤多糖提取物，其特征在于該提取物主要由4種多糖組分組成，且按重量百分含量計(jì)，4種多糖組分的總含量為50 100%。其中組分I和組分II的平均分子量范圍在5000 400000Da之間，組分III和組分IV的平均分子量范圍在5000 500000Da之間。
一種通關(guān)藤多糖提取物的制備方法，包括以下步驟:
(1)取通關(guān)藤藥材粉碎，加水提取I 5次，每次0.5 6小時(shí)，加水量為3 20倍，合并提取液，濃縮至60°C下相對(duì)密度為1.02 1.35浸膏，加乙醇使醇度達(dá)40% 90%，靜置6 72小時(shí)，回收乙醇，濃縮，干燥，加水溶解，采用已知的sevage法或三氯乙酸法或酶解法除去蛋白，制得粗多糖，備用；
(2)取粗多糖的水溶液，經(jīng)纖維素離子交換柱，分別依次以水洗脫I 7倍柱體積，制得多糖組分I ;以0.05mol/L氯化鈉洗脫I 10倍柱體積，制得多糖組分II ;以0.lmol/L氯化鈉洗脫I 8倍柱體積，制得多糖組分III ；以0.2mol/L氯化鈉洗脫I 7倍柱體積，制得多糖組分IV，合并收集得到的上述溶液，過濾，經(jīng)透析袋透析，除去氧化鈉，濃縮，干燥，即得。上述纖維素離子交換柱中的交換劑主要為陰離子交換纖維素如DEAE。

上述多糖提取物，能用于制備藥劑學(xué)上可接受的口服制劑，或注射制劑，或吸入齊U，或局部皮膚制劑。上述多糖提取物，能制備成抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物。上述制得的通關(guān)藤多糖提取物在制備藥劑學(xué)上可接受的藥物制劑應(yīng)用，可以是采用本領(lǐng)域共知的方法，制備片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸、糖漿劑、水針劑、緩釋劑、大輸液、凍干針劑、氣霧劑、噴霧劑、凝膠、橡膠膏、巴布劑等任意一種現(xiàn)有的劑型。含有上述多糖提取物制成的藥物，它可以在治療各種癌癥及其調(diào)節(jié)免疫功能方面應(yīng)用，也可作為癌癥治療過程中配合放療、化療的輔助用藥及手術(shù)后治療用藥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明提供的通關(guān)藤多糖提取物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)明確，是由具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的4種多糖組分組成，4種多糖組分的純度較高，最高純度可達(dá)100%，解決了目前中藥多糖以粗多糖為主，存在雜質(zhì)多，其活性組分不明確的問題。(2)本發(fā)明提供的多糖提取物中含有的4種多糖組分，是通過藥效試驗(yàn)跟蹤篩選出的具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的多糖組分，由它們組成的通關(guān)藤多糖提取物藥效作用明確，不含有非活性的其他多糖組分，解決了中藥提取物活性成分和非活性成分無法預(yù)知的問題。(3)本發(fā)明提供的多糖提取物的制備方法適合工業(yè)化生產(chǎn)，其中4種多糖組分的純度經(jīng)過凝膠柱色譜和紫外-可見光譜等方法檢測(cè)證實(shí)了其純度可達(dá)50% 100%，且本發(fā)明的制備方法經(jīng)多批次放大實(shí)驗(yàn)證實(shí)，方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，多糖提取率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。(4)本發(fā)明提供的多糖提取物，因其多糖組成明確，為此從根本上解決了中藥提取物質(zhì)量不可控的問題。


圖1是多糖組分I的洗脫曲線圖。圖2是多糖組分II的洗脫曲線圖。
圖3是多糖組分III的洗脫曲線圖。
圖4是多糖組分IV的洗脫曲線圖。
具體實(shí)施例方式用以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體說明，但本發(fā)明并不限于下面實(shí)施例所包含的內(nèi)容。實(shí)施例1
一種通關(guān)藤多糖提取物的制備方法是:
通關(guān)藤藥材粉碎后,加水8倍量提取3次，每次2小時(shí)，合并上清液，濾過，濾液減壓濃縮到60°C下相對(duì)密度為1.10 1.15，加95%乙醇使醇度達(dá)到80%，攪拌，靜置過夜，離心，真空干燥5小時(shí)，采用Sevage法脫蛋白，經(jīng)Deae-52纖維素柱上樣，分別依次以水洗脫2倍柱體積，獲得多糖組分I ;以0.05mol/L氯化鈉洗脫4倍柱體積，獲得多糖組分II ;以0.1mol/L氯化鈉洗脫3倍柱體積，獲得多糖組分III ；以0.2mol/L氯化鈉洗脫2倍柱體積，獲得多糖組分IV，合并上述溶液，濾過，經(jīng)透析袋透析，除去氯化鈉，濃縮，真空干燥，即得。實(shí)施例2
一種通關(guān)藤多糖提取物的制備方法是:
通關(guān)藤藥材粉碎后,加水10倍量提取2次，每次1.5小時(shí)，合并上清液，濾過，濾液減壓濃縮到60°C下1.20 1.25，加95%乙醇使溶液乙醇濃度達(dá)到85%，攪拌，靜置36小時(shí)，離心，噴霧干燥，采用三氯乙酸法脫蛋白，經(jīng)Deae-650C纖維素柱上樣，分別依次以水洗脫3倍柱體積，獲得多糖組分I ;以0.05mol/L氯化鈉洗脫5倍柱體積，獲得多糖組分II ;以0.1mol/L氯化鈉洗脫2倍柱體積，獲得多糖組分III ；以0.2mol/L氯化鈉洗脫3倍柱體積，獲得多糖組分IV，合并上述溶液，濾過，經(jīng)透析袋透析，除去氯化鈉，濃縮，噴霧干燥，即得。實(shí)施例3
通關(guān)藤多糖提取物片劑的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 200g 微晶纖維素60g
低取代羥丙基纖維素 35g 硬脂酸鎂1.5g
1%羥丙甲纖維素適量
取上述通關(guān)藤多糖提取物，加入上述輔料混勻，加入1%羥丙甲纖維素溶液濕法制粒，過20目篩，60°C干燥2小時(shí)，以20目篩整粒，加入硬脂酸鎂混勻，壓片，制成1000片，即得。實(shí)施例4
通關(guān)藤多糖提取物膠囊的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 IOOg 淀粉40g
交聯(lián)聚維酮 5g
微粉娃膠Ig
10%聚維酮Km適量
取上述通關(guān)藤多糖提取物，加入上述輔料混勻，加入10%聚維酮K3tl濕法制粒，過24目篩，60°C干燥2小時(shí)，以24目篩整粒，加入微粉硅膠混勻，裝膠囊，制成1000粒，即得。實(shí)施例5通關(guān)藤多糖提取物顆粒劑的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 300g 甘露醇50g
鹿糖150g
朽1檬香精0.5g
取上述通關(guān)藤多糖提取物，加入甘露醇、50g蔗糖混勻，余下蔗糖加水制成50%的糖漿作為粘合劑對(duì)上述輔料及多糖提取物制粒，過16目篩，60°C干燥2小時(shí)，噴以檸檬香精乙醇溶液，以16目篩整粒，制成顆粒劑1000袋，即得。實(shí)施例6
通關(guān)藤多糖提取物口服液的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 250g 羥苯甲酯Sg
阿司巴甜Ig
薄荷香精0.5g
注射用水10000ml
取上述通關(guān)藤多糖提 取物及輔料，加入80%注射用水溶解，攪拌，加入0.1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0 7.0之間，補(bǔ)充注射用水至全量，濾過，流通蒸汽滅菌30分鐘，灌裝至IOml安瓿中，封口，制成1000瓶，即得。實(shí)施例7
通關(guān)藤多糖提取物注射劑的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 30g 注射用水5000ml
取上述通關(guān)藤多糖提取物，加入處方量的80%注射用水溶解，攪勻，加入0.1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0 7.0之間，補(bǔ)充注射用水至全量，加0.5%針用活性炭攪拌30分鐘，粗濾，再以0.22 μ m濾膜過濾，以5mL為I個(gè)劑量單位灌裝，制成1000支，置121 °C條件下滅菌15分鐘，即得。實(shí)施例8
通關(guān)藤多糖提取物凍干粉針的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 50g 甘露醇25g
注射用水2000ml
取上述通關(guān)藤多糖提取物及甘露醇，加入處方量的80%注射用水溶解，攪勻，加入
0.1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0 7.0之間，補(bǔ)充注射用水至全量，加1.0%針用活性炭攪拌30分鐘，粗濾，再以0.22 μ m濾膜過濾，灌裝至5ml西林瓶中，凍干，制成1000支，即得。實(shí)施例9
通關(guān)藤多糖提取物大輸液的制備:
通關(guān)藤多糖提取物 80g
氯化鈉900g
注射用水100000ml取上述通關(guān)藤多糖提取物及氯化鈉，加入處方量70%注射用水溶解，攪勻，加入0.1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至6.0 7.0之間，補(bǔ)充注射用水至全量，加1.0%針用活性炭攪拌30分鐘，粗濾，再以0.22 μ m濾膜過濾，灌裝至IOOml注射液瓶中，置121°C條件下滅菌20分鐘，制成1000瓶，即得。通關(guān)藤多糖提取物是由4種多糖組分組成，由以下實(shí)驗(yàn)證實(shí):
粗多糖的洗脫:取制備得到的粗多糖溶液，上Deae-52纖維素柱，依次采用水、
0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，每0.5倍柱體積收集I份洗脫液，備用。多糖組分的檢測(cè):采用苯酚-硫酸法對(duì)洗脫液在490nm處進(jìn)行檢測(cè)。分別取上述洗脫液各2mL，稀釋并定容至50mL。各取出lmL，加入10 mL具塞試管中，各加入5%苯酚溶液
1.4mL，充分搖勻，再加濃硫酸7mL，充分搖勻，加水至刻度，置40°C水浴中放置15min，取出，冷卻至室溫。在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度值，分別測(cè)定水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化鈉洗脫Deae-52纖維素柱獲得的洗脫液的含量。結(jié)果見圖1_4。圖1-4纖維素柱洗脫曲線顯示，粗多糖經(jīng)水、0.05mol/L、0.1 mol/L、0.2mol/L氯化鈉洗脫后，每種溶劑的洗脫曲線均為對(duì)稱曲線，證實(shí)每種洗脫劑洗脫獲得的多糖為同一類化學(xué)性質(zhì)的多糖組分，為此，本發(fā)明的多糖提取物是由纖維素柱純化分級(jí)制得的4種同類化學(xué)性質(zhì)的多糖組分組成，其中組分I和組分II的平均分子量范圍在5000 400000Da之間，組分III和組分IV的平均分子量范圍在5000 500000Da之間。通關(guān)藤多糖提取物的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)的療效由以下藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí):
實(shí)驗(yàn)I 對(duì)S18tl荷瘤小鼠的抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用
動(dòng)物:昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g 瘤株:腹水型小鼠肉瘤S18(l。藥品:陽性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供)；通關(guān)藤多糖組分I IV、通關(guān)藤多糖提取物，自制。實(shí)驗(yàn)方法:無菌條件下操作，取接種7天的S18tl肉瘤腹水型荷瘤小鼠，消毒動(dòng)物腹部皮膚，用5mL —次性無菌注射器穿入腹腔，吸取腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)良好的腹水，所抽腹水放入無菌三角燒瓶?jī)?nèi)，置于冰盒上。另取少量腹水進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，用生理鹽水稀釋100倍，調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為IX IO7個(gè)/mL。取小鼠，每鼠0.2mL的S18tl腹水瘤細(xì)胞懸液接種于右前肢腋窩皮下，24h后稱重，隨機(jī)分組，每組10只。灌胃給藥，連續(xù)10天，其中空白組和荷瘤對(duì)照組每日0.4mL生理鹽水，環(huán)磷酰胺組、通關(guān)藤多糖組分I IV、通關(guān)藤多糖提取物，每日按下表的劑量給藥。給藥10天 后停止給藥，停藥次日處死小鼠，稱取小鼠體重，解剖瘤體、脾、胸腺，分別稱重。計(jì)算抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾指數(shù)等指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表1-2。表I 對(duì)S18。荷瘤小鼠抑瘤作用結(jié)果__
權(quán)利要求
1.一種通關(guān)藤多糖提取物，其特征在于該提取物主要由4種多糖組分組成，且按重量百分含量計(jì)，4種多糖組分的總含量為50 100%，其中組分I和組分II的平均分子量范圍在5000 400000Da之間，組分III和組分IV的平均分子量范圍在5000 500000Da之間。
2.一種通關(guān)藤多糖提取物的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)取通關(guān)藤藥材粉碎，加水提取I 5次，每次0.5 6小時(shí)，加水量為3 20倍，合并提取液，濃縮至60°C下相對(duì)密度為1.02 1.35浸膏，加乙醇使醇度達(dá)40% 90%，靜置6 72小時(shí)，回收乙醇，濃縮，干燥，加水溶解，采用sevage法或三氯乙酸法或酶解法除去蛋白，制得粗多糖，備用； (2)取粗多糖的水溶液，經(jīng)纖維素離子交換柱，分別依次以水洗脫I 7倍柱體積，制得多糖組分I ;以0.05mol/L氯化鈉洗脫I 10倍柱體積，制得多糖組分II ;以0.lmol/L氯化鈉洗脫I 8倍柱體積，制得多糖組分III ；以0.2mol/L氯化鈉洗脫I 7倍柱體積，制得多糖組分IV，合并收集得到的上述溶液，過濾，經(jīng)透析袋透析，除去氧化鈉，濃縮，干燥，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖提取物，其特征在于以此提取物為原料，用于制備藥劑學(xué)上可接受的口服制劑，或注射制劑，或吸入劑，或局部皮膚制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖提取物，其特征在于制備抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物上的應(yīng) 用。
全文摘要
一種通關(guān)藤多糖提取物，其特征在于該提取物主要由4種多糖組分組成，且按重量百分含量計(jì)，4種多糖組分的總含量為50～100%，其中組分I和組分Ⅱ的平均分子量范圍在5000～400000Da之間，組分Ⅲ和組分Ⅳ的平均分子量范圍在5000～500000Da之間。本發(fā)明提供的多糖提取物，因其多糖組成明確，為此從根本上解決了中藥提取物質(zhì)量不可控的問題。其中4種多糖組分的純度經(jīng)過凝膠柱色譜和紫外-可見光譜等方法檢測(cè)證實(shí)了其純度可達(dá)50%～100%，且本發(fā)明的制備方法經(jīng)多批次放大實(shí)驗(yàn)證實(shí)，方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，多糖提取率高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61K31/715GK103239469SQ20131014850
公開日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者張慧, 裴志東, 康廷國, 翟延君, 初正云, 王添敏 申請(qǐng)人:遼寧中醫(yī)藥大學(xué)