專利名稱：一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)療領(lǐng)域，具體的說，涉及一種醫(yī)療用的緩釋抗粘連的組織工程滑膜鞘。
背景技術(shù)：
手指屈指肌腱損傷后發(fā)生粘連愈合，導致手指的功能恢復效果不理想，是手外科領(lǐng)域亟待解決的一大難題。在肌腱愈合過程釋放的細胞因子中，TGF-^ (TransformingGrowth Factor beta)認為是組織纖維化,瘢痕形成、肌腱粘連的關(guān)鍵因子。TGF-0 3做為體內(nèi)TGF-P I的同分異構(gòu)體，可以下調(diào)TGF-P I和TGF-P 2的水平，起到TGF-P I抗體的效果，達到抑制瘢痕的形成的作用。但是TGF-P 3在體內(nèi)肌腱局部含量少，肌腱愈合環(huán)境內(nèi)TGF-^ 3的濃度無法保持，無法起到明顯抗粘連作用?；な顷P(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，淡紅色，平滑閃光，薄而柔潤，由疏松結(jié)締組織組成。滑膜分泌滑液在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，含有高度聚合的、高黏度的透明質(zhì)酸，充當著關(guān)節(jié)內(nèi)的主要潤滑劑，它將關(guān)節(jié)軟骨的摩擦系數(shù)減至0.001。手指屈指肌腱斷裂，滑膜損傷后，不能正常分泌滑液，從而導致手指活動范圍小，容易產(chǎn)生粘連。

發(fā)明內(nèi)容
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種具有緩釋作用的抑制組織愈合處粘連形成的載TGF-P 3的緩釋組織工程滑膜鞘。本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的:一種載TGF-￠3的緩釋組織工程滑膜鞘，支架由致密層⑴和多孔層⑵兩層組成，所述多孔層⑵呈網(wǎng)孔狀，該多孔層⑵內(nèi)載有含TGF-3 3的殼聚糖微球以及滑膜細胞。按照如下步驟制備:a、所述致密層(1)的形成將殼聚糖溶于2%的醋酸水溶液中，配制成1.5%的殼聚糖溶液，然后在4°C下離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將3.0ml上述溶液澆入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層(1)；b、多孔層⑵的形成再將6mll.5%的殼聚糖溶液傾入放置致密層(I)的培養(yǎng)皿中，_20°C預凍2h后冷凍干燥形成多孔層(2)得到殼聚糖不對稱膜；C、含TGF-P 3的殼聚糖微球的制備將殼聚糖120mg溶于2%的醋酸水溶液中，磁力攪拌，配成2%的殼聚糖溶液；在該殼聚糖溶液中加入0.lmg/ml的TGF-P 3溶液5ug，攪拌混勻，靜置除氣泡后待用；在燒杯中加入80ml液體石蠟，調(diào)整攪拌速度至lOOOrpm，滴加乳化劑Span-80 4ml ;用無菌注射器將含TGF-P 3的殼聚糖溶液緩慢逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；加入0.4ml的50%戊二醛溶液與殼聚糖攪拌固化30分鐘，靜置固化30分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，用石油醚反復清洗微球，倒去上層石油醚，下層微球室溫放置揮發(fā)30分鐘，得含TGF- β 3的殼聚糖微球；d、載TGF- β 3的緩釋組織工程膜制備:將步驟(b)中得到的殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準確稱量含TGF-β 3的殼聚糖微球5mg，移液槍吹打分散懸于IOOul的PBS溶液，吸取含懸浮微球的PBS溶液，加入多孔層(2)，使微球均勻吸附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜；e、TGF_i3 3緩釋組織工程滑膜鞘的制備在無菌條件下取新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用無菌PBS溶液清洗三遍組織塊后，在超凈臺內(nèi)剪切成碎粒，將碎粒移至IOmL離心管內(nèi)，加入0.1 %胰蛋白酶DMEM溶液，震蕩消化30分鐘，IOOOrpm離心5min，去上清液，加入0.1 %的II型膠原酶DMEM溶液，放置于37°C、體積分數(shù)為0.05的CO2的恒溫搖床內(nèi)消化2h，觀察組織碎片大部分被消化，液體混濁，離心，去上清液；PBS沖洗I次，100目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，離心、去上清；加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液5mL，充分吹打均勻后，移至無菌培養(yǎng)皿；放入CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；每三天換液一次，5 7天傳代；將滑膜細胞懸液調(diào)整濃度為2xl05個/mL，用加樣器吸取細胞懸液IOOul均勻加入TGF- β 3殼聚糖緩釋膜的多孔層中，孵育3h，再向培養(yǎng)孔中加入含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液，使得滑膜細胞貼附TGF- β 3殼聚糖緩釋膜多孔層生長，將片狀滑膜細胞-TGF- β 3殼聚糖緩釋膜復合物包繞于事先消毒好的硅膠管上，使其成管形結(jié)構(gòu)，得到載TGF- β 3的緩釋組織工程滑膜鞘。作為優(yōu)選:所述多孔層(2)厚度為200-300um。有益效果:本發(fā)明 的殼聚糖不對稱膜的致密層能有效阻隔外界因素的影響和干擾。多孔層內(nèi)載有含TGF-β 3的殼聚糖緩釋微球，同時可以作為細胞貼附生長的載體。在此基礎(chǔ)上，我們種植了滑膜細胞，實現(xiàn)了殼聚糖支架的人工滑膜化。該種載TGF- β 3的緩釋組織工程滑膜鞘既能實現(xiàn)TGF- β 3的緩慢釋放，發(fā)揮TGF- β 3的抗瘢痕形成的功效，使其緩慢持續(xù)釋放具有生物學活性的TGF-β 3，又能利用存活滑膜細胞分泌透明質(zhì)酸等活性物質(zhì)，起到潤滑作用，讓手指活動范圍大，以期能達到肌腱損傷修復后防粘連的作用。該種材料可以作為一種理想的肌腱損傷修復后防粘連的理想材料，用于骨科中肌腱粘連的防治效果非常好。說明書附1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為TGF- β 3的累計釋放曲線圖；圖3為本發(fā)明載TGF-β 3的緩釋組織工程滑膜鞘3d后電鏡圖；圖4為用MTT法檢測殼聚糖支架和TGF- β 3微球?qū)ぜ毎鲋车挠绊憯?shù)據(jù)圖
具體實施例方式實施例如

圖1所示，一種載TGF- β 3的緩釋組織工程滑膜鞘，殼聚糖組織工程支架由致密層I和多孔層2兩層組成，致密層I能有效阻隔外界因素的影響和干擾。所述多孔層2厚度為200-300um，多孔層2疏松、呈網(wǎng)孔狀，其內(nèi)載有含TGF- β 3的殼聚糖緩釋微球和滑膜細胞，作為細胞貼附生長的載體，實現(xiàn)了殼聚糖支架的人工滑膜化。按如下步驟進行制得:(I)殼聚糖不對稱膜a、致密層的形成將殼聚糖溶于2%的醋酸水溶液，配制成1.5%的殼聚糖溶液，然后在4°C下離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將1.0ml上述溶液澆入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層I ;b、多孔層2的形成將殼聚糖溶于2%的醋酸水溶液，配制成1.5%的殼聚糖溶液，將6ml的該殼聚糖溶液傾入放置致密層的培養(yǎng)皿中，_20°C預凍Ih后冷凍干燥形成厚度為200-300um的多孔層2，該多孔層疏松、呈網(wǎng)孔狀，得到殼聚糖不對稱膜；(2)含TGF- β 3的殼聚糖微球的制備將殼聚糖120mg溶于2%的醋酸水溶液中，磁力攪拌，配成2%的殼聚糖溶液。在殼聚糖溶液中加入0.lmg/ml的TGF- β 3溶液5ug，攪拌混勻，靜置除氣泡后待用。在150ml燒杯中加入80ml液體石臘,調(diào)整攪拌速度至IOOOrpm,滴加乳化劑Span-80 4mI ;用無菌注射器將含TGF-β 3的殼聚糖溶液緩慢逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；加入0.4ml的50 %戊二醛溶液與殼聚糖攪拌固化30分鐘，然后靜置固化30分鐘，有淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層油相，用大量石油醚反復清洗，倒去上層石油醚，下層微球室溫放置30分鐘，使得石油醚揮發(fā)得較干燥殼聚糖微球。
·
(3)載TGF- β 3的殼聚糖緩釋膜制備:將步驟⑴中的殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準確稱量含TGF- β 3的殼聚糖微球5mg，移液槍吹打分散懸于IOOul的PBS溶液，吸取含懸浮微球的PBS溶液，加入殼聚糖膜多孔層，使微球均勻吸附到殼聚糖膜的孔隙中得到載TGF-β 3的殼聚糖緩釋膜。e、TGF- β 3緩釋組織工程滑膜鞘⑷的制備在無菌條件下取新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織。用無菌PBS溶液清洗三遍組織塊后，在超凈工作臺內(nèi)剪切成碎粒。將碎粒移至IOmL離心管內(nèi)，加入0.1 %胰蛋白酶DMEM溶液，震蕩消化30分鐘，IOOOrpm離心5min，去上清液。加入0.1%的II型膠原酶DMEM溶液，放置于37°C、體積分數(shù)為0.05的CO2的恒溫搖床內(nèi)消化2h。觀察組織碎片大部分被消化，液體混濁,離心,去上清液。用PBS溶液沖洗I次，100目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，離心、去上清液。加入含10% FBS (胎牛血清)的DMEM(含100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素)培養(yǎng)液5mL,充分吹打均勻后，移至無菌培養(yǎng)皿。放入CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每三天換液一次，5 7天傳代。免疫組化法行滑膜細胞鑒定。MTT法檢測殼聚糖支架和TGF-β 3微球?qū)ぜ毎脑鲋怠⒎只挠绊?。試驗證明殼聚糖支架和TGF-β 3微球?qū)ぜ毎脑鲋禑o統(tǒng)計學差異(P > 0.05)如圖4所示。將細胞懸液調(diào)整濃度為2χ105個/mL。加樣器吸取細胞懸液IOOul均勻加入TGF-0 3殼聚糖緩釋膜的多孔層中，孵育3h，再向培養(yǎng)孔中加入充足的含10% FBS的含100u/ml青霉素，100u/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。滑膜細胞貼附TGF-β 3殼聚糖緩釋膜多孔層生長，將片狀滑膜細胞-TGF-β 3殼聚糖緩釋膜復合物包繞于事先消毒好的硅膠管上，使其成管形結(jié)構(gòu)，得到載TGF-β 3的緩釋組織工程滑膜鞘。3d后電鏡掃描如圖3所示。
載TGF- P 3的殼聚糖微球的體外緩釋實驗:精確稱量TGF-P 3殼聚糖微球20mg，置于Ep管，加入Iml的PBS，EP管置于搖床，I小時后離心，取上清液，_20°C保存離心液，將微球重懸于Iml的PBS中，繼續(xù)置于搖床。于實驗開始后2h，4h，6h，12h，24h，36h，2d，3d，4d，5d，6d，7d重復上述操作。將各次離心后的液體作為待測樣品，用ELISA試劑盒檢測樣品OD值，通過標準曲線計算各樣品中TGF-3 3的含量，繪制TGF-P 3的累計釋放曲線(如圖2所示)，在最初的3天TGF-P 3的釋放呈現(xiàn)快速釋放的趨勢，隨后開始趨于平緩， 7天的總釋放率為46.2% ±0.3%。
權(quán)利要求
1.一種載TGF-β 3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于:支架由致密層⑴和多孔層(2)兩層組成，所述多孔層(2)呈網(wǎng)孔狀，該多孔層(2)內(nèi)載有含TGF-β 3的殼聚糖微球以及滑膜細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于:按照如下步驟制備: a、所述致密層(I)的形成 將殼聚糖溶于2%的醋酸水溶液中，配制成1.5 %的殼聚糖溶液，然后在4°C下離心5min，去除雜質(zhì)，靜置除氣泡后待用；將3.0ml上述溶液澆入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置24h自然晾干形成致密層(I)； b、多孔層(2)的形成 再將6ml 1.5%的殼聚糖溶液傾入放置致密層(I)的培養(yǎng)皿中，-20°C預凍2h后冷凍干燥形成多孔層(2)，得到殼聚糖不對稱膜； C、含TGF-β 3的殼聚糖微球的制備 將殼聚糖120mg溶于2 %的醋酸水溶液中，磁力攪拌，配成2 %的殼聚糖溶液；在該殼聚糖溶液中加入0.lmg/ml的TGF-β 3溶液5ug，攪拌混勻，靜置除氣泡后待用；在燒杯中加入80ml液體石蠟，調(diào)整攪拌速度至lOOOrpm，滴加乳化劑Span-80 4ml ;用無菌注射器將含TGF-β 3的殼聚糖溶液緩慢逐滴加至液體石蠟中，攪拌乳化至顏色呈均一穩(wěn)定乳白色；力口入0.4ml的50 %戊二醛溶液與殼聚糖攪拌固化30分鐘，靜置固化30分鐘，淡黃色微球沉淀于杯底；傾去上層 油相，用石油醚反復清洗微球，倒去上層石油醚，將下層微球室溫放置揮發(fā)30分鐘，得含TGF- β 3的殼聚糖微球； d、載TGF-β3的緩釋組織工程膜制備: 將步驟(b)中得到的殼聚糖不對稱膜裁成直徑為Icm的圓片，準確稱量含TGF-0 3的殼聚糖微球5mg，移液槍吹打分散懸于IOOul的PBS溶液中，吸取含懸浮微球的PBS溶液，加入殼聚糖膜多孔層(2)，使微球均勻吸附到殼聚糖膜多孔層的孔隙中得到載TGF-133的殼聚糖緩釋膜； e、TGF-β 3緩釋組織工程滑膜鞘的制備 在無菌條件下取新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織，用無菌PBS溶液清洗三遍組織塊后，在超凈工作臺內(nèi)剪切成碎粒，將碎粒移至IOmL離心管內(nèi)，加入0.1%胰蛋白酶DMEM溶液，震蕩消化30分鐘，IOOOrpm離心5min，去上清液，加入0.1 %的II型膠原酶DMEM溶液，放置于37°C、體積分數(shù)為0.05的CO2的恒溫搖床內(nèi)消化2h，觀察組織碎片大部分被消化，液體混濁,離心,去上清液；用PBS沖洗I次，100目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，離心、去上清液；加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液5mL，充分吹打均勻后，移至無菌培養(yǎng)皿；放入CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；每三天換液一次，5 7天傳代； 將滑膜細胞懸液調(diào)整濃度為2xl05個/mL，用加樣器吸取細胞懸液IOOul均勻加入TGF- β 3殼聚糖緩釋膜的多孔層中，孵育3h，再向培養(yǎng)孔中加入含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)液，使得滑膜細胞貼附TGF- β 3殼聚糖緩釋膜多孔層生長，將片狀滑膜細胞-TGF- β 3殼聚糖緩釋膜復合物包繞于事先消毒好的硅膠管上，使其成管形結(jié)構(gòu)，得到載TGF- β 3的緩釋組織工程滑膜鞘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于:所述多孔層( 2)厚度為200-300um。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘，其特征在于由致密層(1)和多孔層(2)兩層組成，所述多孔層(2)呈網(wǎng)孔狀，該多孔層(2)內(nèi)載有含TGF-β3的殼聚糖微球以及滑膜細胞。本發(fā)明實現(xiàn)了殼聚糖支架的人工滑膜化。該種載TGF-β3的緩釋組織工程滑膜鞘既能實現(xiàn)TGF-β3的緩慢釋放，發(fā)揮TGF-β3的抗瘢痕形成的功效，使其緩慢持續(xù)釋放具有生物學活性的TGF-β3，又能利用存活滑膜細胞分泌透明質(zhì)酸等活性物質(zhì)，以期能達到肌腱損傷修復后防粘連的作用。該種材料可以作為一種理想的肌腱損傷修復后防粘連的理想材料，用于骨科中肌腱粘連的防治效果非常好。
文檔編號A61L27/54GK103239759SQ201310161098
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月3日
發(fā)明者熊雁, 蔣科, 王愛民, 張正治, 王子明, 鐘菁 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院