抗雞新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感疫苗組合物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組禽流感病毒株。該重組禽流感病毒株是通過遺傳重組方法，將流感病毒株和禽流感病毒株進行重組構建而得，對雞及雞胚無致病力，比野毒株更安全，可有效避免因滅活不完全造成的散度危險。本發(fā)明還涉及一種含有該重組禽流感病毒株的抗雞新城疫、傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感的疫苗組合物。該疫苗組合物不僅可預防雞新城疫、傳染性支氣管炎，對我國目前流行的大多數(shù)H9N2亞型禽流感病毒較好的交叉免疫性。因此，該疫苗組合物比目前商品化疫苗在H9N2亞型禽流感方面具有廣泛的交叉保護性。
【專利說明】抗雞新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感疫苗組合物及制備

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于畜牧類生物制藥【技術領域】，涉及一種重組禽流感病毒株，特別是涉及一種重組禽流感病毒株以及含有該毒株的抗雞新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感疫苗組合物。

【背景技術】
[0002]禽流感(Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起禽類及其他鳥類的一種感染和/或疾病綜合征，感染后的舍飼禽(包括家禽)可表現(xiàn)出臨診癥狀、呼吸系統(tǒng)疾病、產(chǎn)蛋量下降、致死率很高的急性出血性疾病，也可表現(xiàn)為亞臨診癥狀、輕的呼吸系統(tǒng)感染到無癥狀帶毒等多種流行形式。其中H9N2亞型禽流感，我國自1994年首次報道從雞群中分離到H9N2亞型禽流感病毒以來，該亞型禽流感病毒已在我國廣泛分布和流行，并且在家禽中不斷變化。目前H9N2亞型禽流感是持續(xù)危害我國及世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要禽類傳染病之一。我國目前主要流行的H9N2禽流感病毒屬于h9.4.2分支，h9.4.2分可分為六個亞分支，其中流行范圍較廣的為第I亞分支在華東、華北、西北和西南地區(qū)流行，其次為第IV亞分支在華中地區(qū)流行。
[0003]目前，對于家禽H9N2亞型禽流感感染的預防主要是使用H9N2亞型禽流感病毒制備的全病毒油乳劑滅活疫苗。我國有多種不同廠家研制和生產(chǎn)H9N2亞型禽流感滅活疫苗，在我國大范圍應用。疫苗的廣泛使用使H9亞型禽流感的流行得到了有效控制，但禽群感染仍時有發(fā)生，甚至出現(xiàn)在免疫雞群，特別是近年來呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢。目前商品化的H9亞型禽流感滅活疫苗或H9亞型禽流感相關聯(lián)苗，均為油乳劑滅活疫苗。由于禽流感存在高度變異，因此，目前商品化疫苗免疫后對H9亞型禽流感的保護效果較差。同時，目前的商品化疫苗所使用的H9亞型疫苗抗原大多為滅活的野毒，即全病毒抗原，存在因滅活不完全而造成散毒危險。
[0004]因此，目前存在的問題是需要提供一株新的疫苗株，并基于該疫苗株研制新型H9亞型禽流感疫苗或H9亞型禽流感相關聯(lián)苗，免疫后對H9亞型禽流感的保護效果較好，且不存在因滅活不完全造成散毒危險，以用于預防H9亞型禽流感及H9亞型禽流感相關疾病。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種重組禽流感病毒(RAIV)株。該重組禽流感病毒株是通過遺傳重組方法，將流感病毒株和禽流感病毒株進行重組構建而得，對雞及雞胚無致病力，比野毒株更安全，可有效避免因滅活不完全造成的散度危險。
[0006]本發(fā)明還提供了該重組禽流感病毒株在制備防治動物和人類H9N2亞型流感的疫苗中的應用。
[0007] 本發(fā)明還進一步提供了一種含有該重組禽流感病毒株的抗新城疫、傳染性支氣管炎和H9亞型禽流感的疫苗組合物，該組合物不僅可預防新城疫、傳染性支氣管炎，對我國目前流行的大多數(shù)H9N2亞型禽流感病毒較好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亞型禽流感方面具有廣泛的交叉保護性。
[0008]為此，本發(fā)明提供了一種重組禽流感病毒株，其具有禽流感病毒(AIV)的2個表面基因以及流感病毒(IV)的6個內(nèi)部基因。
[0009]本發(fā)明中，所述禽流感病毒的2個表面基因分別為HA基因和NA基因。所述流感病毒的6個內(nèi)部基因分別為PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。
[0010]根據(jù)本發(fā)明，所述禽流感病毒可以為禽流感(H9N2亞型)病毒A/Chicken/Hubei/Cl/2007 (H9N2)株、禽流感(H9N2 亞型)病毒 A/Chicken/Shanghai/F/98 (H9N2)株、禽流感(H9N2亞型)病毒A/Chicken/Hunan/S933/2008 (H9N2)株、禽流感病毒為禽流感病毒(H9亞型)SZ株。
[0011]在一個優(yōu)選實施例中，所述禽流感病毒為禽流感病毒(H9亞型)SZ株(Avianinfluenza virus (H9subtype) strain SZ),其保藏編號為:CCTCC NO:V201240,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC);地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號,武漢大學；保藏日期:2012年9月16日。
[0012]本發(fā)明中所述用語“禽流感(H9N2亞型)病毒”亦稱為H9N2亞型禽流感病毒。
[0013]本發(fā)明中所述用語“禽流感病毒(H9亞型)SZ株(Avian influenzavirus (H9subtype) strain SZ)”亦稱為禽流感病毒H9亞型SZ株或H9亞型禽流感病毒SZ株。
[0014]同樣,本發(fā)明中所述用語“重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株(Avian influenzavirus (H9 subtype) strain SZ)”亦稱為重組禽流感病毒H9亞型SZ-1株或重組H9亞型禽流感病毒SZ-1株。
[0015]本發(fā)明中所述用語“禽流感毒(H9亞型)YZG4株”亦稱為禽流感病毒(H9亞型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4)或禽流感病毒 H9 亞型 YZG4 株或H9亞型禽流感病毒YZG4株，用于本發(fā)明中的攻毒保護試驗。
[0016]禽流感毒(H9亞型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，其保藏編號為:CCTCC NO:V201227，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC);地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號，武漢大學；保藏日期:2012年6月14日。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，所述流感病毒可以為流感病毒A/Harbin/LM/2009 (HlNl)株、流感病毒A/Taiwan/126/2009 (HlNl)株及流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株。優(yōu)選所述流感病毒為流感病毒 A/PR/8/34 (HlNl)株。
[0018]本發(fā)明中，所述重組禽流感病毒株為重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株。所述重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株是通過遺傳重組方法，將流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)和H9N2亞型禽流感流行株禽流感病毒(H9亞型)SZ株進行重組獲得，并通過PCR和血清學方法對獲得的重組病毒進行了鑒定。
[0019]具體地說，本發(fā)明中所述重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株是利用禽流感病毒(H9亞型)SZ株、流感病毒為流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株和人工自然重組技術構建的構建2:6
重組病毒株。
[0020]本發(fā)明中所述用語“構建2:6重組病毒株”是指采用人工自然重組技術將禽流感病毒的2個表面基因和流感病毒的6個內(nèi)部基因進行重組構建的重組禽流感病毒株。具體地說，是指采用人工自然重組技術將禽流感病毒的2個表面基因，如HA基因和NA基因，以及流感病毒的6個內(nèi)部基因，如PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因進行重組構建的重組禽流感病毒株。
[0021]本發(fā)明所提供的重組禽流感病毒株，具有與HA和NA基因供體毒株禽流感病毒(H9亞型)SZ株一致的抗原性，不僅能夠完全抵御同源毒株的攻擊，而且意外地發(fā)現(xiàn)對我國目前流行的H9N2禽流感病毒異源毒株的攻擊也可產(chǎn)生較好的免疫保護，具有廣泛的交叉保護性。本發(fā)明所提供的重組禽流感病毒株的6個內(nèi)部基因來自供體株流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株，意外地發(fā)現(xiàn)具有比流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株更優(yōu)異的雞胚高滴度生長特性，而且出人意料地，還發(fā)現(xiàn)本發(fā)明人工重組的重組禽流感病毒株對雞及雞胚完全無致病力，比野毒株更安全，可有效避免因滅活不完全造成的散毒危險。簡而言之，該重組禽流感病毒株對我國目前流行的H9N2禽流感病毒具有廣泛的交叉免疫性、高滴度雞胚適應性、對雞及雞胚無致病力。
[0022]本發(fā)明中所述用語“雞新城疫(NewCastledisease, ND)”,是指由副粘病毒引起的高度接觸性傳染病，又稱為新城疫(ND)。
[0023]本發(fā)明中所述用語“雞新城疫病毒(NDV)”，亦稱為新城疫病毒(NDV)，屬于副粘病毒科，副粘病毒屬，核酸為單鏈RNA。
[0024]同樣，本發(fā)明中所述用語“雞新城疫病毒(NDV)株”，亦稱為新城疫病毒(NDV)株。
[0025]本發(fā)明中所述用語“雞傳染性支氣管炎Infect1usbronchitis, IB”,是指由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV )引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病毒性疾病，又稱為傳染性支氣管炎(IB)。
[0026]本發(fā)明中所述用語“雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)”，亦稱為傳染性支氣管炎病毒(IBV),是一種冠狀病毒，有多個血清型，而且新的毒株不斷出現(xiàn)。
[0027]同樣，本發(fā)明中所述用語“雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)株”，亦稱為傳染性支氣管炎病毒(IBV)株。
[0028]本發(fā)明還提供了根據(jù)本發(fā)明所述的重組禽流感病毒株在制備防治動物和人類H9N2亞型流感的疫苗中的應用。
[0029]本發(fā)明還進一步提供了一種含有本發(fā)明所述的重組禽流感病毒株的抗新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感疫苗組合物，其中，還包括雞新城疫病毒(NDV)株和傳染性支氣管炎病毒(IBV)株。
[0030]根據(jù)本發(fā)明，所述新城疫病毒株為雞新城疫病毒(NDV) LaSota株。所述傳染性支氣管炎病毒株為傳染性支氣管炎病毒(IBV) M41株。所述重組禽流感病毒株為重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株。
[0031]在本發(fā)明的一個實施例中，在所述疫苗組合物中，NDV LaSota株滅活濃縮液含量為10%~31.05% (體積)。優(yōu)選在所述疫苗組合物中，NDV LaSota株滅活濃縮液含量為10%~20% (體積)。更為優(yōu)選地，在所述疫苗組合物中，NDV LaSota株滅活濃縮液含量為10.35% (體積)。
[0032]在本發(fā)明的另一個實施例中，在所述疫苗組合物中，IBV M41株滅活濃縮液含量為10%~31.05%(體積)。優(yōu)選在所述疫苗組合物中，IBV M41株滅活濃縮液含量為10%~20%(體積)。更為優(yōu)選地，在所述疫苗組合物中，IBV M41株滅活濃縮液含量為10.35% (體積)。
[0033]在本發(fā)明又一實施例中，在所述疫苗組合物中，重組禽流感病毒(RAIV) (H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液含量為10%~31.05% (體積)。優(yōu)選在所述疫苗組合物中，重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液含量為10%~20% (體積)。更為優(yōu)選地，在所述疫苗組合物中，重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液含量為10.35% (體積)。
[0034]本發(fā)明還進一步提供了一種根據(jù)本發(fā)明上文所述的疫苗組合物的制備方法，其包括:
[0035]步驟A:制備生產(chǎn)用毒種:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株毒種稀釋后，再分別接種于SPF雞胚，孵育，分別收獲NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的生產(chǎn)用毒種；
[0036]步驟B:制備制苗用病毒液:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株生產(chǎn)用毒種稀釋后，再分別接種易感雞胚，孵育，收獲制苗用病毒液；
[0037]步驟C:制苗用病毒液的濃縮、滅活:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株制苗用病毒液進行濃縮、滅活，分別獲得NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液；
[0038]步驟D:制備疫苗組合物:將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液與吐溫-80混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂酸鋁制成的油相進行混合乳化，制成疫苗組合物。
[0039]根據(jù)本發(fā)明方法，在步驟C中，所述濃縮、滅活是將NDV LaSota株、IBV M41株與重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的制苗用病毒液分別進行濃縮后，再用終濃度為0.05%~0.30% (體積)甲醛溶液，在35~37°C條件下，滅活12~20小時。上述滅活過程優(yōu)選在濃縮后，采用0.20% (體積)甲醛溶液，在37°C條件下，滅活16小時。
[0040]本發(fā)明中所用術語“滅活濃縮液”，是指已滅活的濃縮病毒液或濃縮抗原。
[0041]在本發(fā)明的一個實施例中，在步驟A之前還包括構建重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的步驟。
[0042]本發(fā)明所提供的抗雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)疫苗組合物優(yōu)選為一種三聯(lián)滅活疫苗，可預防對雞新城疫、雞傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感，尤其對我國目前流行的H9N2禽流感病毒具有廣泛的交叉免疫性。
[0043]本發(fā)明所提供的重組禽流感病毒株HA效價與野毒相比，可提高2倍左右，以此為疫苗株生產(chǎn)疫苗，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本，提高疫苗質(zhì)量。本發(fā)明所提供的重組禽流感病毒株，對雞及雞胚無致病力，比野毒株更安全，可有效避免因滅活不完全造成的散毒危險。
[0044]進一步來說，利用本發(fā)明的人工重組的重組禽流感病毒株作為疫苗株構建的抗雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)疫苗組合物，不僅可預防雞新城疫、雞傳染性支氣管炎，對我國目前流行的H9N2亞型禽流感病毒較好的交叉免疫性。因此，比目前商品化疫苗在H9N2亞型禽流感方面具有廣泛的交叉保護性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1是實施例2中重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M和NS基因的RT-PCR擴增；
[0046]圖1中附圖標記的含義如下:1~8泳道:重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株利用PR8的8對特異性鑒別引物擴增的PCR產(chǎn)物；M:DNA Marker2000 ; 10~17泳道:重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株利用禽流感病毒(H9亞型)SZ株的8對特異性鑒別引物擴增的PCR產(chǎn)物。
[0047]圖2是實施例3中重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株和野生型禽流感病毒(H9亞型)SZ株在最佳培養(yǎng)溫度37°C測定的生長曲線。
[0048]mmm
[0049]禽流感病毒(H9亞型)SZ 株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain SZ),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年9月16日，保藏編號:CCTCC NO:V201240o
[0050]禽流感毒(H9亞型)YZG4株(Avian influenza virus (H9 subtype) strain YZG4),由普萊柯生物工程股份有限公司分離、鑒定，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱=CCTCC ；地址:湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號武漢大學)進行保藏，保藏日期:2012年6月14日，保藏編號:CCTCC NO:V201227o

【具體實施方式】
[0051]本發(fā)明是以下技術方案來實現(xiàn)的，首先是通過遺傳重組方法，將流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株和禽流感病毒(H9亞型)SZ株進行重組，構建重組禽流感病毒株，并通過PCR和血清學方法對獲得的重組病毒進行鑒定，獲得重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株。
[0052]然后，應用所獲得的重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株來制備防治動物和人類H9N2亞型流感的疫苗。
[0053]在一個具體的技術方案中，將重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株與NDV LaSota株、IBV M41株三病毒株作為抗原制備抗雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感疫苗組合物，其包括以下具體實施步驟:
[0054]步驟B:制備生產(chǎn)用毒種:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株毒種稀釋后，再分別接種于SPF雞胚，孵育，分別收獲NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的生產(chǎn)用毒種；
[0055]步驟C:制備制苗用病毒液:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株生產(chǎn)用毒種稀釋后，再分別接種易感雞胚，孵育，收獲制苗用病毒液；
[0056]步驟D:制苗用病毒液的濃縮、滅活:分別將NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株制苗用病毒液濃縮3倍，然后用終濃度為0.05%~0.30%(體積)甲醛溶液，35~37°C，滅活12~20小時，分別獲得NDV LaSota株、IBV M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液；
[0057]步驟E:制備疫苗組合物:將NDV LaSota株滅活濃縮液10%~31.05% (體積)、IBVM41株滅活濃縮液10%~31.05% (體積)和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液10%~31.05% (體積)與吐溫_80，4% (體積)混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂酸鋁制成的油相按照1:2的比例進行混合乳化，制成疫苗組合物。
[0058]在一個優(yōu)選實施方式中，在步驟E中，將NDV LaSota株滅活濃縮液10% (體積)、IBV M41株滅活濃縮液10% (體積)和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液10%(體積)與吐溫_80，4% (體積)混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂酸鋁制成的油相按照1:2的比例進行混合乳化，制成疫苗組合物。
[0059]在另一個優(yōu)選實施方式中，在步驟E中，將NDV LaSota株滅活濃縮液20% (體積)、IBV M41株滅活濃縮液20% (體積)和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液20%(體積)與吐溫_80，4% (體積)混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂酸鋁制成的油相按照1:2的比例進行混合乳化，制成疫苗組合物。
[0060]在又一優(yōu)選實施方式中，在步驟E中，將NDV LaSota株滅活濃縮液10.35%(體積)、IBV M41株滅活濃縮液10.35% (體積)和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液10.35% (體積)與吐溫-80，4% (體積)混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂酸鋁制成的油相按照1:2的比例進行混合乳化，制成疫苗組合物。
[0061]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結合實施例來詳細說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0062]實施例
[0063]實施例1:禽流感病毒(H9亞型)SZ株的分離與鑒定與免疫原性分析
[0064]1.樣品
[0065]由普萊柯生物工程股份有限公司進行分離和鑒定。
[0066]2.病毒分離
[0067]將從山東采集的雞拭子樣品，3000rpm離心5分鐘后，按0.2ml/胚的劑量，無菌操作以尿囊腔途徑接種10日齡SPF(無特定病原體,Specefic pathogen Free, SPF)雞胚。置37°C繼續(xù)孵育。每日照蛋，棄去24小時內(nèi)死亡的雞胚，檢測孵育48~72小時死亡及72小時存活的所有雞胚。
[0068]3.病毒鑒定
[0069](I)紅細胞凝集實驗
[0070]按照常規(guī)方法測定收獲的雞胚液的HA效價，HA效價為1:256。
[0071](2)病毒亞型鑒定
[0072]將該毒株分別與禽流感H1-H16的16種血凝素(H)分型血清進行HI試驗，與N1-N9的9種神經(jīng)氨酸酶(N)分型血清進行NI試驗，進行病毒的H和N亞型的鑒定。鑒定結果見表1，該毒株為H9N2亞型禽流感病毒。
[0073]表1毒株亞型鑒定結果

【權利要求】
1.一種重組禽流感病毒株，其含有禽流感病毒的2個表面基因以及流感病毒的6個內(nèi)部基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組禽流感病毒株，其特征在于: 所述禽流感病毒的2個表面基因分別為HA基因和NA基因； 所述流感病毒的6個內(nèi)部基因分別為PB2基因、PBl基因、PA基因、NP基因、M基因和NS基因。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的重組禽流感病毒株，其特征在于:所述禽流感病毒為禽流感病毒(H9亞型)SZ株，其保藏編號為:CCTCC NO:V201240 ； 所述流感病毒為流感病毒A/PR/8/34 (HlNl)株； 所述重組禽流感病毒株為重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株。
4.根據(jù)權利要求1到3中任意一項所述的重組禽流感病毒株在制備防治動物和人類H9N2亞型流感的疫苗中的應用。
5.一種含有權利要求1到3中任意一項所述的重組禽流感病毒株的抗雞新城疫、傳染性支氣管炎和禽流感疫苗組合物，其特征在于，還包括雞新城疫病毒株和傳染性支氣管炎病毒株。
6.根據(jù)權利要求5所述的疫苗組合物，其特征在于: 所述雞新城疫病毒株為雞新城疫病毒LaSota株； 所述傳染性支氣管炎病毒株為傳染性支氣管炎病毒M41株； 所述重組禽流感病毒株為重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株。
7.根據(jù)權利要求5或6所述疫苗組合物，其特征在于:在所述疫苗組合物中，雞新城疫病毒LaSota株滅活濃縮液的含量為10%~31.05% (體積)；傳染性支氣管炎病毒M41株滅活濃縮液的含量為10%~31.05% (體積);重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液的含量為10%~31.05% (體積)。
8.根據(jù)權利要求7所述疫苗組合物，其特征在于:在所述疫苗組合物中，雞新城疫病毒LaSota株滅活濃縮液的含量為10%~20% (體積);傳染性支氣管炎病毒M41株滅活濃縮液的含量為10%~20% (體積);重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液的含量為10%~20% (體積)。
9.根據(jù)權利要求8所述疫苗組合物，其特征在于:在所述疫苗組合物中，雞新城疫病毒LaSota株滅活濃縮液的含量為10.35% (體積)；傳染性支氣管炎病毒M41株滅活濃縮液的含量為10.35% (體積);重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株滅活濃縮液的含量為10.35% (體積)。
10.根據(jù)權利要求5到9中任意一項所述的疫苗組合物的制備方法，其包括: 步驟A:制備生產(chǎn)用毒種:分別將雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株毒種稀釋后，再分別接種于SPF雞胚，孵育，分別收獲雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的生產(chǎn)用毒種； 步驟B:制備制苗用病毒液:分別將雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株生產(chǎn)用毒種稀釋后，再分別接種易感雞胚，孵育，收獲制苗用病毒液；步驟C:制苗用病毒液的濃縮、滅活:分別將雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株制苗用病毒液進行濃縮、滅活，分別獲得雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液； 步驟D:制備疫苗組合物:將雞新城疫病毒LaSota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和重組禽流感病毒(H9亞型)SZ-1株的滅活濃縮液與吐溫-80混合制成水相，然后再與由白油、司本-80、硬脂 酸鋁制成的油相進行混合乳化，制成疫苗組合物。
【文檔編號】A61P31/14GK104164408SQ201310181203
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2013年5月15日 優(yōu)先權日:2013年5月15日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司