專利名稱：用于制備抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的重組表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的重組表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
豬痕(Classical swine fever, CSF)是由豬痕病毒(Classical swine fevervirus, CSFV)引起豬的一種以急性出血和發(fā)熱為主要特征的烈性傳染病，是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要傳染病之一。自然條件下，豬是唯一易感動(dòng)物，死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前CSF的主要流行區(qū)有:(1)東南亞疫區(qū)，由于控制措施不力，疫情仍然較重；
(2)中南美洲疫情穩(wěn)定區(qū)，疫病流行逐年減少；(3)歐洲特別是西歐屬疫情活躍區(qū)，雖然采取了嚴(yán)密的控制措施，仍經(jīng)常爆發(fā)，是近年來CSF流行的中心。在我國，CSF流行呈現(xiàn)典型和非典型共存、持續(xù)感染和隱性感染共存、免疫耐受和帶毒綜合征共存等，疫苗接種仍是防控CSF的主要措施。一些發(fā)達(dá)國家，如美國、加拿大及一些歐盟成員國等采取嚴(yán)格防疫措施和剔除CSF感染豬凈化豬群的方法控制和消滅CSF，成果雖顯著，但經(jīng)濟(jì)損失較大。早期的CSF滅活疫苗因免疫期短、產(chǎn)生免疫保護(hù)力慢、生產(chǎn)成本高且繁殖CSF強(qiáng)毒潛在散毒危險(xiǎn)等缺陷，自1982年起我國已停止該類疫苗的生產(chǎn)。CSF弱毒疫苗能夠?qū)SF強(qiáng)毒的攻擊提供保護(hù)，在CSF流行的地區(qū)，仍是控制該病的重要措施之一。盡管CSF弱毒疫苗能產(chǎn)生有效保護(hù)，但在長期免疫接種的脅迫下CSFV可能出現(xiàn)抗原變異，同時(shí)CSF細(xì)胞弱毒疫苗難以剔除牛病毒性腹瀉病毒的污染，還可能與野毒重組或自然突變而造成毒力返強(qiáng)，并可通過胎盤感染造成胎兒死亡，先天性感染仔豬出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象。此外，由于CSF弱毒疫苗干擾CSF的血清診斷，難以區(qū)分CSF野毒感染豬與免疫豬，同時(shí)疫苗保存和使用不當(dāng)以及疫苗免疫不能覆蓋所有易感豬群，均會(huì)導(dǎo)致免疫失敗，而且弱毒苗在接種后至少15d內(nèi)能夠在淋巴器官(主要是扁桃體)內(nèi)一定程度的復(fù)制，這期間利用標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法難以將其與野毒區(qū)分開來，不利于鑒別診斷，歐盟已禁止使用CSF弱毒疫苗，而是采用撲殺感染豬和CSF血清陽性豬的措施以控制和消滅CSF。然而采用撲殺政策所需人力、物力和資金巨大，發(fā)展中國家更是難以承受，這促使人們研究和開發(fā)新型CSF疫苗來防控該病。目前利用反向遺傳學(xué)技術(shù)改造缺失E2或Erns基因的突變病毒株成為可能，這種缺失突變株只能在反式提供缺失蛋白的感受態(tài)細(xì)胞系上生長，將其作為疫苗安全性好，但此類疫苗一個(gè)值得關(guān)注的焦點(diǎn)是突變疫苗株與野毒株之間存在發(fā)生重組的可能性。在重組病毒疫苗的研制中，利用CSFV-E2糖蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的特性，構(gòu)建了重組痘苗病毒、腺病毒和偽狂犬病毒等，在臨床上都能夠誘導(dǎo)有效的免疫保護(hù)，但所用病毒載體存在生物安全隱患。為了克服CSF弱毒疫苗的固有缺陷，又研發(fā)了 CSF亞單位標(biāo)記疫苗，其中最有效的CSF亞單位疫苗也是基于CSFV-E2糖蛋白研制，疫苗免疫動(dòng)物后僅產(chǎn)生抗E2蛋白抗體，而野毒感染的豬卻同時(shí)能夠產(chǎn)生抗Erns蛋白的抗體，利用現(xiàn)有的ELISA抗體檢測方法能夠加以區(qū)分，彌補(bǔ)了經(jīng)典弱毒疫苗的不足，但是其保護(hù)效率還有待于進(jìn)一步的評估。
豬瘟疫苗的設(shè)計(jì)是多樣的，使我們難以確認(rèn)哪一種是最好的選擇。在不同的研究中，疫苗劑量、免疫次數(shù)、免疫途徑、免疫攻毒之間的時(shí)間間隔均不相同，攻毒用的毒株、病毒毒力、攻毒劑量與途徑以及用來評估疫苗效果的標(biāo)準(zhǔn)也不相同。結(jié)合豬瘟病毒主要經(jīng)消化道黏膜系統(tǒng)侵入機(jī)體引起動(dòng)物發(fā)病的特點(diǎn)，研制能有效地刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答繼而誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫應(yīng)答的黏膜免疫疫苗，對疫病防治具有重要意義。理想的黏膜疫苗可以促進(jìn)抗原和免疫系統(tǒng)之間的有效接觸，誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，產(chǎn)生長期的免疫保護(hù)作用，且穩(wěn)定、無毒性。針對基因工程減毒病毒和細(xì)菌的應(yīng)用而帶來的環(huán)境和安全問題，發(fā)展了以乳酸菌為代表的非致病性活菌載體。乳酸菌作為外源基因表達(dá)宿主菌，其優(yōu)越性主要表現(xiàn)在:
①乳酸菌能在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)定植，對維持微生態(tài)平衡具有重要作用不具有致病性，是公認(rèn)的安全級微生物，易構(gòu)建成食品級基因克隆及表達(dá)系統(tǒng)，有效提高基因工程產(chǎn)品的安全性;③同腸胃外免疫途徑相比，經(jīng)黏膜免疫，可以誘發(fā)IgA產(chǎn)生4免疫方法簡單、安全；⑥具有免疫佐劑作用、固有免疫原性及抗膽汁酸能力。因此，乳酸菌作為免疫接種的口服疫苗載體極具開發(fā)潛力。乳酸菌在誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答時(shí)或經(jīng)過小腸上皮的微皺裙細(xì)胞(microfold cell, M細(xì)胞)，或者通過樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)進(jìn)入固有層，激活Th2淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生白介素IL-5，激活B細(xì)胞，分泌IgA，形成黏膜表面抗體slgA，同時(shí)可提高免疫活性因子如IL-2、IFN-α的分泌，阻止致病微生物的吸附和入侵，而且可將特異性抗原分子攜帶并分泌到腸道，穿過腸壁進(jìn)入黏膜下層，引起細(xì)胞免疫和體液免疫。

因此，本發(fā)明依據(jù)CSFV主要經(jīng)黏膜感染為出發(fā)點(diǎn)，以阻止病原感染的第一道防線為指導(dǎo)思想，利用乳酸菌作為傳遞抗原的載體進(jìn)行抗CSF基因工程乳酸菌免疫制劑的制備。本發(fā)明以豬瘟病毒主要免疫保護(hù)性抗原E2蛋白作為免疫原，胸腺肽為免疫增強(qiáng)劑，構(gòu)建了具有抗豬瘟病毒功能的轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑能有效地刺激黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生局部免疫應(yīng)答，進(jìn)而引起全身性系統(tǒng)免疫反應(yīng)，可作為預(yù)防豬瘟的口服疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗豬瘟病毒感染的轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法。本發(fā)明根據(jù)豬瘟病毒主要經(jīng)腸道黏膜感染入侵機(jī)體的特點(diǎn)，利用常用乳酸菌一保加利亞乳桿菌{Lactobacillus bulgaricus)作為介導(dǎo)黏膜免疫傳遞疫苗抗原的安全級活菌載體，以胸腺肽T α I作為免疫增強(qiáng)劑，豬瘟病毒主要免疫保護(hù)性抗原E2蛋白作為免疫原，研發(fā)了具有抗豬瘟病毒感染的轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑，通過口服免疫，可達(dá)到預(yù)防豬瘟的目的。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種用于制備抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌的重組表達(dá)載體pYG-Τ α 1-Ε2，如序列表SeqN0.1所示。本發(fā)明還具有如下特征:1、一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑，其特征在于，將以胸腺肽Tα I作為免疫增強(qiáng)齊U，豬瘟病毒主要免疫保護(hù)性抗原Ε2蛋白作為免疫原，構(gòu)成的重組表達(dá)載體pYG-Τα 1-Ε2電轉(zhuǎn)化入乳酸菌中。本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征:
2、一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，用于胸腺肽TaI基因PCR擴(kuò)增引物對，
上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示，
下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。3、一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，用于豬瘟病毒E2蛋白基因PCR擴(kuò)增引物對，
上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示，
下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。4、一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，包括如下步驟:
(I)參照Genbank中發(fā)布的胸腺肽(Τ α I)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物對，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。(2)根據(jù)豬瘟病毒Ε2蛋白基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對，上引物E-F:如序列表SeqN0.4所示,下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。(3)進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)分別擴(kuò)增T α I基因及Ε2基因 (4)構(gòu)建重組表達(dá)載體pYG-Τ α 1- Ε2。(5)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因乳酸菌
5、一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，經(jīng)口服免疫，能有效地刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，可作為預(yù)防豬瘟的口服疫苗。6、如上所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，所述步驟(3)采用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增T α I基因的具體步驟如下:將混合液在70°C加熱5min，25 °〇退火 5min，37°C延伸 30min，最后 70°C加熱 10 min。所述混合液組成如下:
權(quán)利要求
1.一種用于制備抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌的重組表達(dá)載體pYG-Τα 1-E2，其特征在于，如序列表Seq N0.1所示。
2.一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑，其特征在于，將以胸腺肽Ta I作為免疫增強(qiáng)齊U，豬瘟病毒主要免疫保護(hù)性抗原E2蛋白作為免疫原，構(gòu)成的重組表達(dá)載體pYG-Ta 1-E2電轉(zhuǎn)化入乳酸菌中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，用于胸腺肽Tal基因PCR擴(kuò)增引物對，其特征在于， 上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示， 下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，用于豬瘟病毒E2蛋白基因PCR擴(kuò)增引物對，其特征在于， 上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示， 下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)、參照Genbank中發(fā)布的胸腺肽(Τα I)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物對，上引物T-F:如序列表Seq N0.2所示；下引物T-R:如序列表Seq N0.3所示； (2)、根據(jù)豬瘟病毒Ε2蛋白基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對，上引物E-F:如序列表Seq N0.4所示，下引物E-R:如序列表Seq N0.5所示； (3)、進(jìn)行常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)分別擴(kuò)增Tα I基因及Ε2基因； (4)、構(gòu)建重組表達(dá)載體PYG-Tα 1- Ε2 ； (5)、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因乳酸菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑，其特征在于，用于預(yù)防豬瘟的口服疫苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)采用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Ta I基因的具體步驟如下:將混合液在70°C加熱5min，25°C退火5min，37°C延伸30min，最后70°C加熱10 min ;所述混合液組成如下:根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)采用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Ta I基因的具體步驟如下:將混合液在70°C加熱5min，25°C退火 5min，37°C延伸 30min，最后 70°C加熱 10 min ； 所述混合液組成如下:
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)采用常規(guī)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)擴(kuò)增Ε2基因的具體步驟如下:采用TIANampVirus RNA Kit提取豬瘟病毒基因組RNA，經(jīng)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板PCR擴(kuò)增豬瘟病毒E2蛋白基因，將混合液在94°C 45s，60.9°C退火45s，72°C延伸60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10 min，所述混合液組成如下
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(4)重組表達(dá)載體pYG-Τα 1-Ε2的構(gòu)建方法具體步驟如下先將PCR產(chǎn)物胸腺肽(Ta I)基因經(jīng)ifeMl I ,Kpn I酶切，利用膠回收試劑盒回收純化目的基因片段，將純化后的目的基因克隆入表達(dá)載體PYG的及麗Y I、Kpn I位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYG_T a I ;再將PCR產(chǎn)物豬瘟病毒E2蛋白基因經(jīng)治μ I ,Xho I酶切，利用膠回收試劑盒回收純化目的基因片段，將純化后的目的基因克隆入重組質(zhì)粒PYG-Ta I的治M I ,Xho I位點(diǎn)，將鑒定正確的重組表達(dá)載體命名為PYG-T a 1-E2。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的制備方法，其特征在于所述的步驟(5)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因乳酸菌的乳酸菌菌株為保加利亞乳桿菌bulgaricus );采用電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因乳酸菌，電轉(zhuǎn)化條件為100 Ω、2. 5kV、25 μ F。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑的重組表達(dá)載體。該重組表達(dá)載體命名為pYG-Tα1-E2，如序列表SeqNo.1所示。本發(fā)明還涉及一種抗豬瘟病毒轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑，依據(jù)豬瘟病毒主要經(jīng)腸道黏膜感染途徑入侵機(jī)體，繼而引發(fā)動(dòng)物疾病，增強(qiáng)機(jī)體特異性黏膜免疫，是阻止病原入侵的首要防線，利用乳酸菌作為介導(dǎo)黏膜免疫傳遞疫苗抗原的安全級活菌載體，以豬瘟病毒主要免疫保護(hù)性抗原E2蛋白作為免疫原，胸腺肽為免疫增強(qiáng)劑，構(gòu)建了具有抗豬瘟病毒功能的轉(zhuǎn)基因乳酸菌制劑。相比于傳統(tǒng)豬瘟疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/14GK103215298SQ20131018551
公開日2013年7月24日 申請日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者徐義剛, 李丹丹, 劉忠梅, 吳巖, 李蘇龍, 劉新亮 申請人:黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心