一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：（1）胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的分離；和（2）胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。其中，步驟（1）使用了trypLETM酶溶液分兩步處理胎盤組織；步驟（2）使用無血清培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）圖譜分析為完全母體來源，經(jīng)染色體核型檢查，細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細(xì)胞純度鑒定，細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定為合格。因此，本發(fā)明方法獲得的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞不含異種蛋白，可以滿足臨床使用的需要，尤其適合母親自己使用，也為建立優(yōu)良的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞庫提供了技術(shù)保障。
【專利說明】一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)的方法，特別是指一種一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、制備的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有以下特點:1)造血支持作用。作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分一基質(zhì)細(xì)胞系的干/祖細(xì)胞，MSCs與造血干細(xì)胞共同移植可促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的植入。2)免疫調(diào)控。MSCs不表達(dá)⑶80，⑶86，HLA-DR等協(xié)同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，對于預(yù)防和治療異基因造血細(xì)胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統(tǒng)疾病有重要意義。3)基因治療。由于MSCs體外擴(kuò)增、增殖能力強(qiáng)，可以作為基因操作的干細(xì)胞平臺，加之MSC具有對腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景。4)多向分化潛能。在體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于組織工程。
[0003]目前，從胎盤、臍帶獲得間充質(zhì)干細(xì)胞常用多步多酶消化法，如:盧國輝等《盧國輝，張世忠，陳強(qiáng)，等.人胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及其多向分化潛能的實驗研究.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2011; 31 (2):262-265》采用雙酶消化加密度梯度離心法從足月胎盤底蛻膜中分離出呈克隆樣貼壁生長細(xì)胞，表達(dá)典型的MSCs表面抗原，但由于胎盤組織比較復(fù)雜，同時存在母體和胎兒的細(xì)胞，盧國輝等并未檢測所得到的為母體細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于一種對細(xì)胞損傷小、更快的得到完全來自母體的胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0006]一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征是由下述步驟組成:
[0007](I)胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的分離:取胎盤小心剝離底蛻膜組織，先用機(jī)械方法處理成小于0.5-1平方厘米的小片，用組織塊1-5倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.3-0.5小時，后清洗去除消化液，該步目的為了去除小組織塊表面可能粘連的胎兒組織。我們再將第一步消化后的殘留組織塊，再用組織塊1-5倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.5-1小時，得到消化后的混合液，將混合液用濾網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞為主的懸液；將細(xì)胞懸液離心；通過分兩步處理，我們可以得到很純的母體細(xì)胞。
[0008](2)胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng):將上述細(xì)胞按0.5-2X IOVcm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。所用培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%融合時，用trypLE?消化，按分種率1:2—1:10接種到新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。經(jīng)過數(shù)次傳代，間充質(zhì)干細(xì)胞得到純化，可以將細(xì)胞作為原代傳代細(xì)胞庫凍存到液氮中長期保存。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0010]本發(fā)明提供一種對細(xì)胞損傷小、更快的得到完全來自母體的胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比至少有以下優(yōu)點:
[0011]I)本發(fā)明的方法更加簡便快捷，并能獲得完全來自母體的細(xì)胞:
[0012]本發(fā)明的方法只使用了二步消化的方法，更加方便和快捷，較盧國輝等的多步多酶消化法的方法簡單，且能得到完全來自母體的細(xì)胞。
[0013]由于胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜(也稱叢密絨毛膜)和底蛻膜構(gòu)成。羊膜:構(gòu)成胎盤的胎兒部分，是胎盤的最內(nèi)層，羊膜是附著在絨毛膜板表面的半透明膜；葉狀絨毛膜:構(gòu)成胎盤的胎兒部分，占妊娠胎盤的主要部分；底蛻膜:構(gòu)成胎盤的母體部分，占妊娠足月胎盤很小部分，底蛻膜表面覆蓋一層來自固定絨毛的滋養(yǎng)層細(xì)胞與底蛻膜共同形成絨毛間隙的底，稱為蛻膜板，從此板向絨毛膜方向伸出一些蛻膜間隔，一般不超過胎盤全層厚度的2/3，將胎盤母體面分成肉眼可見的20個左右母體葉。
[0014]由于胎盤結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使用現(xiàn)有技術(shù)的多步多酶消化法會導(dǎo)致分離過程污染母體或胎兒的細(xì)胞，獲得的異源細(xì)胞可能會引起人體免疫反應(yīng)等問題，而本發(fā)明的方法則可以獲得來源單一的組織干細(xì)胞，如本發(fā)明后續(xù)實施例所示，通過使用短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)分析，(稱DNA指紋圖譜，能靈敏的檢測出細(xì)胞交叉污染)，可以證明即使在分離如胎盤這樣多重來源組織細(xì)胞，本發(fā)明的方法也可以獲得完全來自母體的細(xì)胞。
[0015]2)本發(fā)明采用trypLE?進(jìn)行消化組織，trypLE?消化細(xì)胞不需要用血清中和，對細(xì)胞損傷小，能最大可能的 保護(hù)間充質(zhì)干細(xì)胞，不受損傷；，使其具有更高活率，如本發(fā)明后續(xù)實施例所示，本發(fā)明方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞可以更加有效進(jìn)行成脂、成骨誘導(dǎo)分化。
[0016]3)本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增方法中使用了無血清培養(yǎng)基，而現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞為采用含2-20%血清的培養(yǎng)基，具有導(dǎo)致血清源性污染，批次間差異大、某些殘留的異種蛋白可能引起人體免疫反應(yīng)等風(fēng)險。
[0017]而本發(fā)明采用的無血清培養(yǎng)基(Serum Free Medium, SFM)是全部用已知成分組配的不加血清的合成培養(yǎng)基，為在含有細(xì)胞所需營養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入適宜的促細(xì)胞生長因子，在保證細(xì)胞良好生長和提高細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量的同時，可避免血清批次間的質(zhì)量變動，避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染，因此，特別適合在制藥生產(chǎn)的中的用途。
[0018]最后，本發(fā)明方法獲得的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞不含異種蛋白，可以滿足臨床使用的需要，尤其適合母親自己使用，也為建立優(yōu)良的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞庫提供了技術(shù)保障。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0020]圖2為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞STR圖譜分析；
[0021]圖3為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0022]圖4為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化圖；
[0023]圖5為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化圖；[0024]圖6為人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞抑制Y -干擾素分泌的能力檢測結(jié)果圖。【具體實施方式】[0025]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0026]實施例1人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及原代傳代細(xì)胞庫凍存
[0027](I)用磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)沖洗胎盤后,小心分離胎盤底蛻膜部分,再用PBS反復(fù)沖洗，去除殘留的血液，剪碎至小于0.5-1平方厘米的小塊；
[0028](2)根據(jù)組織塊的總體積加入I倍體積的trypLE? (Invitrogen, USA)混合酶溶液37°C消化組織塊0.3小時，在消化過程中用轉(zhuǎn)子攪拌；然后清洗去除消化液，再將第一步消化后的殘留組織塊，再用組織塊2倍體積的trypLE?酶溶液37°C消化組織塊0.5小時，得到消化后的消化液，
[0029](3)步驟(2)獲得的消化液用篩網(wǎng)過濾，先后用100目及200目的濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織；
[0030](4)離心，獲得細(xì)胞:離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為1500g/min離心15min，獲得人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0031](5)將上述人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞按I-2X IOVcm2接種于塑料培養(yǎng)瓶，采用無血清培養(yǎng)基(L0NZA)，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3_5天后換液，棄去非貼壁細(xì)胞，以后每3-4天半量換液。待細(xì)胞80%融合，trypLE?消化，按1:3傳代。
[0032](6)將P2代細(xì)胞用trypLE?消化，計數(shù)，用配制好細(xì)胞凍存保護(hù)液按3X IO6細(xì)胞/ml濃度重懸細(xì)胞，分裝入凍存管凍存；
[0033](7)取部分凍存細(xì)胞，用本領(lǐng)域所熟知的方法進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)圖譜分析，染色體核型檢查，細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細(xì)胞純度鑒定，細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定，將所有項目合格的原代傳代細(xì)胞庫長期凍存?zhèn)溆谩?br> [0034]結(jié)果:我們獲得的細(xì)胞形態(tài)為均一的長梭形(圖1)，進(jìn)行短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)圖譜分析，確認(rèn)為母體來源細(xì)胞(圖2，以同一來源胎兒源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為對照(圖2左半部分)，證明得到的胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞為母體來源細(xì)胞(圖2右半部分))，將細(xì)胞進(jìn)行流式檢測分析，其流式表型符合間充質(zhì)干細(xì)胞特征(圖3)。
[0035]因此，可以確認(rèn)獲得了一種母體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0036]實施例2人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增和制劑制備
[0037](I)從實施例1獲得的合格的原代傳代細(xì)胞庫取出含3X IO6細(xì)胞的凍存管，在37°C解凍復(fù)蘇細(xì)胞；
[0038](2)用無血清培養(yǎng)基(LONZA)按2X IOVcm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞到80-90%融合時按1:3傳代，經(jīng)過3次傳代；
[0039](3)在第三次傳代細(xì)胞融合度達(dá)90%時，用trypLE?消化細(xì)胞，計數(shù)，用配制好細(xì)胞保護(hù)液按合適濃度重懸細(xì)胞，分裝入無菌容器中，密封后，放置在合適環(huán)境保存。
[0040](4)取部分細(xì)胞重懸液制劑用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人事熟知的方法進(jìn)行細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細(xì)胞純度檢查，細(xì)胞活力檢測、內(nèi)毒素檢測、相關(guān)殘留物檢測。
[0041]結(jié)果:獲得的細(xì)胞無細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物污染，細(xì)胞純度檢查，細(xì)胞活力檢測、內(nèi)毒素檢測、相關(guān)殘留物檢測均合格。
[0042]實施例3人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂和成骨誘導(dǎo)分化
[0043](I)成骨分化檢測:選取第4代胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化離心后制成單細(xì)胞懸液，按2 X IO4/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合達(dá)70%時更換成骨培養(yǎng)基(Hyclone公司)，然后每3d換液I次,21d后菌素紅染色檢測成骨情況。
[0044](2)成脂分化檢測:選取第4代胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞，常規(guī)消化離心后制成單細(xì)胞懸液，按2 X IO4/孔接種于24孔板，待細(xì)胞融合達(dá)70%時更換成脂培養(yǎng)基(Hyclone公司)。然后每3d換液I次，21d后油紅O染色檢測成脂情況。
[0045]結(jié)果:成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)，隨著時間的延長，脂滴逐漸增大融合，培養(yǎng)3周時，可見融合成團(tuán)的脂滴充滿整個細(xì)胞，經(jīng)油紅O染色可見被染成紅色的脂滴(圖4)。成骨誘導(dǎo)后培養(yǎng)3周以上，細(xì)胞基質(zhì)礦化物逐漸出現(xiàn)，形成多層小結(jié)結(jié)構(gòu)，可見明顯鈣化結(jié)節(jié)，經(jīng)茜素紅染色后呈深紅色(圖5)。由圖可以看出，本發(fā)明獲得細(xì)胞更加有活力，具有更佳的成脂和成骨誘導(dǎo)分化能力。
[0046]實施例4人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞對活化淋巴細(xì)胞的Y-干擾素分泌抑制試驗
[0047]經(jīng)供者授權(quán)同意后，無菌條件下采集健康供者外周靜脈血10ml，分離單個核細(xì)胞備用。將融合度為80-90%的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞以銫源照射20Gy，以2X IO4/孔和5 X IO3/孔兩種濃度接種于96孔板，在37°C，體積分?jǐn)?shù)5%C02，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，待細(xì)胞貼壁后每孔加入IX IO5人外周血單個核細(xì)胞，2 μ L植物血凝素(10mg/L)與人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)。72h后1600r/min離心lOmin，采集上清。ELISA檢測培養(yǎng)上清中Y-干擾素水平。
[0048]結(jié)果:經(jīng)檢測人胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞在1:5和1:20的濃度時均可以明顯抑制活化淋巴細(xì)胞分泌Y-干擾素的能力，在1:5時抑制率在75%。(圖6)。
[0049]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的分離:取胎盤組織，先用機(jī)械方法處理成組織塊小片，用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊，清洗去除消化液后，再用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊，得到消化后的消化液，過濾后將細(xì)胞懸液離心，即獲得胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞； (2)胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng):將上述步驟(I)獲得的細(xì)胞按0.5-2X IOVcm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，置于37°C、飽和濕度、5%的C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)到80-90%融合時，用trypLE?消化，按分種率1:2—1:10接種到新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)；經(jīng)過數(shù)次傳代后，將細(xì)胞作為原代傳代細(xì)胞庫，凍存到液氮中長期保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中胎盤組織為來自母體的底脫膜部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中使用機(jī)械方法獲得組織塊小片的大小為小于0.5-1平方厘米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中第一次用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊的處理時間為0.3-0.5小時；第二次用trypLE?酶溶液37°C消化組織塊的處理時間為0.5-1小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中過濾方法為濾網(wǎng)過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述濾網(wǎng)的目數(shù)為100目-200目。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中傳代次數(shù)為1-5代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中凍存所用的凍存保護(hù)液含5-10%的DMSO和1-10%的人血清白蛋白和適量DMEM/F12，也可以使用商業(yè)化的凍存保護(hù)液。
10.一種如權(quán)利要求1-9任意一項所述的方法獲得的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)圖譜分析為母體來源；經(jīng)染色體核型檢查，細(xì)菌、真菌和病毒的病原微生物檢查，細(xì)胞純度鑒定，細(xì)胞生物學(xué)功能鑒定為合格。
12.如權(quán)利要求1-9任意一項所述的方法獲得的胎盤源母體間充質(zhì)干細(xì)胞在組織工程、制備治療免疫系統(tǒng)疾病的藥物以及組織再生修復(fù)中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K35/50GK103451150SQ201310196516
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月24日
【發(fā)明者】韓之海, 王濤 申請人:北京漢氏聯(lián)合生物技術(shù)有限公司