專利名稱：結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法。
背景技術(shù)：
組織工程學(xué)的提出為眾多具有組織缺陷和器官功能衰竭病人的治療帶來了希望，因其能夠避免組織或器官移植過程中資源有限、排斥反應(yīng)以及并發(fā)癥等問題而受到越來越廣泛的關(guān)注。組織工程學(xué)的研究領(lǐng)域涉及材料學(xué)、工程學(xué)及生命科學(xué)。細(xì)胞、支架和生長(zhǎng)信息構(gòu)成了組織工程學(xué)的三個(gè)基本要素，其中支架材料的開發(fā)對(duì)推動(dòng)組織工程學(xué)的發(fā)展具有至關(guān)重要的作用，也是組織工程學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，它的開發(fā)具有廣泛的應(yīng)用前景和潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益。理想的組織工程支架應(yīng)具有良好的生物相容性和生物可降解性，并具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)提供足夠的空間和物質(zhì)交換通道，同時(shí)要求支架具有可塑性及一定的機(jī)械強(qiáng)度，為新生組織的生長(zhǎng)提供支撐。不同組織的生長(zhǎng)對(duì)支架孔徑范圍有不同的要求，如骨組織要求支架具有100-400 μ m結(jié)構(gòu)的泡孔，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)需要20-100 μ m的孔結(jié)構(gòu)，而一般更小孔徑的泡孔則成為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及細(xì)胞代謝廢物傳遞的通道。現(xiàn)有的制備多孔材料的方法，主要包括纖維粘結(jié)法、溶劑澆鑄/顆粒濾浙以及相分離法等。采用傳統(tǒng)方法制備的支架材料在材料成型、孔大小、孔隙率及生物相容性等方面取得了可喜的進(jìn)展，然而由于大多數(shù)制備過程均涉及大量有機(jī)溶劑的使用，因而限制了其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來，隨著超臨界流體技術(shù)研究的深入，利用超臨界二氧化碳(SC-CO2)發(fā)泡技術(shù)制備多孔組織工程支架越來越受到重視。利用SC-CO2制備多孔材料時(shí)，SC-CO2先擴(kuò)散溶解進(jìn)入聚合物基質(zhì)，由于SC-CO2的增塑作用會(huì)降低聚合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度σρ，使其低于實(shí)驗(yàn)溫度；隨后因 系統(tǒng)泄壓或升溫導(dǎo)致體系熱力學(xué)失穩(wěn)，大量氣核在聚合物基質(zhì)內(nèi)形成并生長(zhǎng)；隨著CO2從聚合物中擴(kuò)散出來，聚合物基質(zhì)的Tg不斷上升，當(dāng)Tg高于實(shí)驗(yàn)溫度時(shí)，聚合物基質(zhì)固化，即得到聚合物的多孔結(jié)構(gòu)。利用SC-CO2發(fā)泡法制備多孔材料具有諸多優(yōu)勢(shì):(1)制備過程可以完全避免有機(jī)溶劑的使用，簡(jiǎn)化了后續(xù)操作，是一種綠色工程技術(shù)；(2) SC-CO2具有很好的傳質(zhì)性能，能迅速溶入聚合物基質(zhì)并均勻分布，且SC-CO2的性質(zhì)可以隨著壓力和溫度的變化方便調(diào)節(jié)；(3) SC-CO2具有較低的臨界溫度(31.06 0C)和降低聚合物Tg的能力，可避免生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子的變性失活；(4)可以根據(jù)需要結(jié)合其他傳統(tǒng)聚合物處理方法進(jìn)行材料預(yù)處理，脫除有機(jī)溶劑殘留。因此，采用超臨界發(fā)泡法制備多孔支架用于組織工程領(lǐng)域的前景是可以預(yù)期的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法。
結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法包括如下步驟:
1)選用氯化鈉或海藻糖作為致孔劑，利用篩網(wǎng)篩分得到50-400ym粒徑的顆粒，與聚合物粉末經(jīng)物理震蕩混合后壓片形成致孔劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量為10-90%的圓柱形模片；
2)將圓柱形模片置于超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)的高壓釜內(nèi)，通入二氧化碳，在溫度為35-75 °C、壓力為8-30 MPa以及平衡時(shí)間大于2 h的條件下使二氧化碳達(dá)到超臨界狀態(tài)，超臨界二氧化碳和圓柱形模片充分接觸并使超臨界二氧化碳在圓柱形模片中達(dá)到溶解平衡，最終以0.05-0.20 MPa/s速率泄壓，在圓柱形模片內(nèi)形成孔徑小于20 μ m的泡孔，得到經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片；
3)將經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片浸泡于去離子水中，室溫震蕩脫鹽處理72 h，用冷凍干燥的方法除去支架中殘留的水分，致孔劑顆粒洗脫后留下的印跡形成孔徑50-400 μ m的大孔，得到具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架；
所述超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)包括CO2鋼瓶、冷卻器、流量計(jì)、高壓泵、恒溫預(yù)熱器、高壓釜、可控電加熱夾套、壓力表和自動(dòng)背壓閥；C02鋼瓶與冷卻器、流量計(jì)、高壓泵、恒溫預(yù)熱器、高壓釜、自動(dòng)背壓閥順次相連，高壓釜外設(shè)有可控電加熱夾套，高壓釜上部與壓力表相連。所述的聚合物為聚酯類聚合物，聚酯類聚合物為聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。

本發(fā)明采用生物可降解聚合物作為支架材料，添加致孔劑并結(jié)合SC-CO2對(duì)聚合物的塑化作用形成雙孔結(jié)構(gòu)，獲得具有連通孔道的多孔支架材料。其中致孔劑洗脫印跡產(chǎn)生的50-100 μ m結(jié)構(gòu)的大孔有利于表皮細(xì)胞在支架上的黏附生長(zhǎng)，100-400 μ m結(jié)構(gòu)的大孔有利于成骨細(xì)胞在支架上的黏附生長(zhǎng)，而由聚合物在SC-CO2中發(fā)泡產(chǎn)生的孔徑小于20 μ m泡孔則成為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞的通道。本發(fā)明具有不使用有機(jī)溶劑、操作條件溫和、操作工藝簡(jiǎn)單并且通過過程參數(shù)的調(diào)節(jié)能夠很好地控制泡孔結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)示意 圖2為實(shí)施例1中所制得的具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架截面的電子掃描顯微鏡照片； 圖3為實(shí)施例2中所制得的具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架截面的電子掃描顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式如圖1所示，結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法包括如下步驟:
1)選用氯化鈉或海藻糖作為致孔劑，利用篩網(wǎng)篩分得到50-400ym粒徑的顆粒，與聚合物粉末經(jīng)物理震蕩混合后壓片形成致孔劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量為10-90%的圓柱形模片；
2)將圓柱形模片置于超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)的高壓釜內(nèi)，通入二氧化碳，在溫度為35-75 °C、壓力為8-30 MPa以及平衡時(shí)間大于2 h的條件下使二氧化碳達(dá)到超臨界狀態(tài)，超臨界二氧化碳和圓柱形模片充分接觸并使超臨界二氧化碳在圓柱形模片中達(dá)到溶解平衡，最終以0.05-0.20 MPa/s速率泄壓，在圓柱形模片內(nèi)形成孔徑小于20 μ m的泡孔，得到經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片；
3)將經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片浸泡于去離子水中，室溫震蕩脫鹽處理72 h，用冷凍干燥的方法除去支架中殘留的水分，致孔劑顆粒洗脫后留下的印跡形成孔徑50-400 μ m的大孔，得到具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架；
所述超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)包括CO2鋼瓶1、冷卻器2、流量計(jì)3、高壓泵4、恒溫預(yù)熱器5、高壓釜6、可控電加熱夾套7、壓力表8和自動(dòng)背壓閥9 ；C02鋼瓶I與冷卻器2、流量計(jì)
3、高壓泵4、恒溫預(yù)熱器5、高壓釜6、自動(dòng)背壓閥9順次相連，高壓釜6外設(shè)有可控電加熱夾套7，高壓釜6上部與壓力表8相連。所述的聚合物為聚酯類 聚合物，聚酯類聚合物為聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。實(shí)施例1:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備
首先將PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末與NaCl顆粒(200 μ m)以60% (NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PLGA-NaCl圓柱形模片置于高壓釜內(nèi)，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算機(jī)分別設(shè)定為35 °(:和15 MPa, CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以
0.20 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2發(fā)泡處理后，打開高壓釜取出PLGA-NaCl樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，NaCl洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PLGA支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察大孔孔徑為200 μ m,小孔孔徑5-15 Mm。比重法測(cè)得總孔隙率為69.83 ±2.86%。具備雙孔結(jié)構(gòu)PLGA支架截面的掃面電子顯微鏡照片如圖2所示
實(shí)施例2:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備首先將PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末與NaCl顆粒(200 μ m)以80% (NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PLGA-NaCl圓柱形模片置于高壓釜內(nèi)，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算機(jī)分別設(shè)定為35 °(:和15 MPa, CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以
0.20 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2發(fā)泡處理后，打開高壓釜取出PLGA-NaCl樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，NaCl洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PLGA支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察大孔孔徑為200 μ m，小孔孔徑5-15 Mm0比重法測(cè)得總孔隙率為80.76± 1.83 %。具備雙孔結(jié)構(gòu)PLGA支架截面的掃面電子顯微鏡照片如圖3所示。實(shí)施例3:聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備
首先將PLGA (乳酸:乙醇酸=85:15，分子量200 kDa)粉末與海藻糖顆粒(400 μ m)以90% (海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PLGA-海藻糖圓柱形模片置于高壓釜內(nèi)，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算機(jī)分別設(shè)定為45 °(:和15 MPa7CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2發(fā)泡處理后，打開高壓釜取出PLGA-海藻糖樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，海藻糖洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PLGA支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察大孔孔徑為400 μ m,小孔孔徑5-20 Mm0比重法測(cè)得總孔隙率為90.76 + 1.83 %。實(shí)施例4:聚乳酸(PLA)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備
首先將PLA (分子量200 kDa)粉末與NaCl顆粒(200 μ m)以10% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PLA-NaCl圓柱形模片置于高壓釜中，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算機(jī)分別設(shè)定為45 0C和8 MPa, CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以0.05 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2發(fā)泡處理后，打開高壓釜取出PLA-NaCl樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，NaCl洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PLA支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察:大孔孔徑為200 μ m，小孔孔徑15-25 Mm。比重法測(cè)得總孔隙率為65.54±2.43 %。實(shí)施例5:聚乙醇酸(PGA)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備
首先將PGA (分子量200 kDa)粉末與NaCl顆粒(50 μ m)以10% (NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PGA-NaCl圓柱形模片置于高壓釜中，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算 機(jī)分別設(shè)定為45 °(:和30 MPa, CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2*泡處理后，打開高壓釜取出PGA-NaCl樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，NaCl洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PGA支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察:大孔孔徑為50 μ m,小孔孔徑3-5Mm。比重法測(cè)得總孔隙率為85.78± 1.74 %。實(shí)施例6:聚己內(nèi)酯(PCL)雙孔結(jié)構(gòu)支架的制備
首先將PCL (分子量200 kDa)粉末與NaCl顆粒(200 μ m)以80% (NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例在震蕩器中進(jìn)行物理混合，利用壓片機(jī)形成圓柱形模片。將PCL-NaCl圓柱形模片置于高壓釜中，用冷卻槽將CO2鋼瓶流出的氣體CO2冷卻成液體，CO2由高壓泵輸送至高壓釜，高壓釜內(nèi)溫度和壓力由計(jì)算機(jī)分別設(shè)定為75 °(:和15 MPa, CO2在高壓釜中達(dá)到超臨界狀態(tài)，系統(tǒng)平衡2h。平衡結(jié)束后，關(guān)閉CO2鋼瓶、冷卻槽、高壓泵，并以0.20 MPa/s的速率快速泄壓使體系達(dá)到熱不穩(wěn)定狀態(tài)，CO2在聚合物基質(zhì)內(nèi)成核生長(zhǎng)形成泡孔。經(jīng)SC-CO2發(fā)泡處理后，打開高壓釜取出PCL-NaCl樣片，將該樣片浸泡于去離子水中脫鹽處理72 h，隨后用冷凍干燥機(jī)脫除樣片中剩余的水分，NaCl洗脫印跡即得到大孔。最終得到具有兩種孔結(jié)構(gòu)并且大孔間相互連通的PCL支架，經(jīng)掃描電子顯微鏡觀察:大孔孔徑為200 μ m,小孔孔徑25-45Mffl0比重法測(cè)得總孔隙率為68.92±3.23 %。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法，其特征在于包括如下步驟 1)選用氯化鈉或海藻糖作為致孔劑，利用篩網(wǎng)篩分得到50-400ym粒徑的顆粒，與聚合物粉末經(jīng)物理震蕩混合后壓片形成致孔劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量為10-90%的圓柱形模片； 2)將圓柱形模片置于超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)的高壓釜內(nèi)，通入二氧化碳，在溫度為35-75 °C、壓力為8-30 MPa以及平衡時(shí)間大于2 h的條件下使二氧化碳達(dá)到超臨界狀態(tài)，超臨界二氧化碳和圓柱形模片充分接觸并使超臨界二氧化碳在圓柱形模片中達(dá)到溶解平衡，最終以O(shè). 05-0. 20 MPa/s速率泄壓，在圓柱形模片內(nèi)形成孔徑小于20 μ m的泡孔，得到經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片； 3)將經(jīng)超臨界二氧化碳發(fā)泡處理后的聚合物-致孔劑樣片浸泡于去離子水中，室溫震蕩脫鹽處理72 h，用冷凍干燥的方法除去支架中殘留的水分，致孔劑顆粒洗脫后留下的印跡形成孔徑50-400 μ m的大孔，得到具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架； 所述超臨界二氧化碳發(fā)泡系統(tǒng)包括CO2鋼瓶(I)、冷卻器(2)、流量計(jì)(3)、高壓泵(4)、恒溫預(yù)熱器(5)、高壓釜(6)、可控電加熱夾套(7)、壓力表(8)和自動(dòng)背壓閥(9) ;0)2鋼瓶(I)與冷卻器(2)、流量計(jì)(3)、高壓泵(4)、恒溫預(yù)熱器(5)、高壓釜(6)、自動(dòng)背壓閥(9)順次相連，高壓釜(6)外設(shè)有可控電加熱夾套(7)，高壓釜(6)上部與壓力表(8)相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法，其特征在于所述的聚合物為聚酯類聚合物，聚酯類聚合物為聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己內(nèi)酯。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合超臨界二氧化碳發(fā)泡技術(shù)制備具有雙孔結(jié)構(gòu)組織工程支架的方法。引入商品致孔劑與聚合物粉末經(jīng)過物理混合后壓片；將該模片置于高壓釜內(nèi)，于超臨界二氧化碳中保壓一段時(shí)間后，通過快速泄壓使聚合物基質(zhì)中產(chǎn)生大量發(fā)泡核心并且泡核生長(zhǎng)形成泡孔；最后將致孔劑顆粒洗脫形成相互連通的具有雙孔結(jié)構(gòu)的多孔支架。本發(fā)明具有操作條件溫和、操作工藝簡(jiǎn)單、過程穩(wěn)定的特點(diǎn)，支架制備過程中不涉及有機(jī)溶劑的使用，可應(yīng)用于多孔組織工程支架的制備。
文檔編號(hào)A61L27/50GK103254459SQ20131020322
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者關(guān)怡新, 劉倩倩, 杜哲, 唐川, 辛新, 陳傳鑫, 姚善涇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)