與trb3蛋白特異性結(jié)合的多肽，其篩選方法、鑒定和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了與TRB3蛋白特異性結(jié)合的多肽，其篩選方法、鑒定和用途，具體涉及涉及與人偽激酶tribbles3(TRB3)特異性結(jié)合的三條多肽序列，具有下列氨基酸序列：B1：Ser-Leu-Ser-Gin-Met-Leu-Ser-Met，A2:Gly-G1y-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys,B3：lie-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-lie，該多狀是通過表面等離子共振（Biacore)的方法篩選出來，具有與TRB3特異性結(jié)合，并能阻斷TRB3和P62蛋白結(jié)合的能力；同時該肽段的衍生物Pep2-Bl，Pep2-A2,Pep2-B3可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。因此本發(fā)明及其衍生物可以作為TRB3新的抑制劑，并可應(yīng)用于開發(fā)抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的疫苗或藥物。
【專利說明】與TRB3蛋白特異性結(jié)合的多肽，其篩選方法、鑒定和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種能與人偽激酶tribbles3 (TRB3)結(jié)合并且阻斷其與P62蛋白結(jié) 合的多肽，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥在全球是導(dǎo)致死亡的"頭號殺手"。轉(zhuǎn)移是癌癥致死的主要原因，90%以上的 癌癥患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，抗腫瘤轉(zhuǎn)移在腫瘤治療中顯得尤為重要。腫瘤的侵襲 和轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜的多基因調(diào)控過程，涉及一系列侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)和功能異 常。對這些基因的作用機(jī)制及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的闡明，將為轉(zhuǎn)移性癌癥的分子診斷和個 體化治療奠定基礎(chǔ)。
[0003] TRB3 (Tribbles Homologue3)是Tribbles同源蛋白家族成員之一，最早在果蠅中 被鑒定到，并發(fā)現(xiàn)該蛋白能抑制有絲分裂，調(diào)節(jié)發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖、遷移及形態(tài)形成。 在哺乳動物中，有三種Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3,它們都是假激酶蛋白家族 成員。這三種蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（Kinase like domain, KD)，但卻缺乏 ATP的結(jié)合位點和催化殘基，因此沒有激酶活性。盡管如此，Tribbles蛋白卻具有接頭蛋 白樣的功能，參與多種蛋白復(fù)合體的組裝。在哺乳動物Tribbles家族成員中，TRB3的研究 最為深入，其相互作用蛋白包括轉(zhuǎn)錄因子、泛素連接酶、細(xì)胞膜上II型BMP受體以及MAPK、 PI3K信號通路成員。通過與這些蛋白相互作用，TRB3參與了糖脂代謝、脂肪細(xì)胞分化、凋 亡、應(yīng)激和膠原表達(dá)等的調(diào)控。近來，多種證據(jù)表明，三種Tribbles家族同源蛋白在腫瘤的 發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要的調(diào)節(jié)作用。TRBl和TRB2參與了髓樣白血病的發(fā)生；TRB3在 多種腫瘤細(xì)胞系和人腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。我們的前期研究結(jié)果表明，TRB3在腫瘤的發(fā) 展過程中發(fā)揮重要的促進(jìn)作用。體外和體內(nèi)實驗均顯示，利用TRB3序列特異性shRNA干擾 腫瘤細(xì)胞內(nèi)TRB3表達(dá)能顯著降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力以及在動物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，大大 提高荷瘤動物的生存率。這些結(jié)果提示TRB3是一種促腫瘤轉(zhuǎn)移基因，可能是治療腫瘤的一 個潛在靶點。
[0004] 近年來，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點之一。自噬能清除 細(xì)胞內(nèi)冗余、錯誤折疊蛋白以及損傷細(xì)胞器防止氧自由基堆積，維持基因組穩(wěn)定性，抑制腫 瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移。自噬被還認(rèn)為是另一種形式的程序性細(xì)胞死亡。我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)TRB3 的過度表達(dá)能降低自噬關(guān)鍵性抑制因子mTOR蛋白水平，并抑制多個自噬相關(guān)蛋白，例如II 型LC3、BecI ine-1、PI3K3C表達(dá)增多，進(jìn)而造成自噬相關(guān)貨車蛋白P62產(chǎn)生堆積，證明腫瘤 細(xì)胞內(nèi)TRB3表達(dá)能誘導(dǎo)自噬受到抑制。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的TRB3主要與P62蛋 白發(fā)生相互作用，進(jìn)而阻斷其他泛素化蛋白與P62蛋白的結(jié)合，造成自噬通路被抑制，誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。因此，研究和開發(fā)TRB3蛋白的抑制劑，或者阻斷其與P62蛋白結(jié) 合的物質(zhì)，具有很好的抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展的成藥前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是靶向治療與TRB3相關(guān)的的多肽，該多肽氨基酸序列 如序列SN1、SN2、SN3所示：
[0006] SN I ：Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-Met,
[0007] SN2 ：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys,
[0008] SN3 :Ile-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-IIe。
[0009] 本發(fā)明的氨基酸序列而在其他位置出現(xiàn)氨基酸替換，缺失或添加，且能與TRB3特 異性結(jié)合的寡肽序列。
[0010] 本發(fā)明的多肽及其衍生物用于靶向治療與TRB3相關(guān)的疾病。
[0011] 本發(fā)明的多肽及其衍生物用于制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的腫 瘤選自肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病。
[0012] 本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：由于TRB3蛋白表達(dá)水平在多種腫瘤疾病中明顯 升高，其過度表達(dá)可以與自噬相關(guān)蛋白P62結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞的自噬活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的肽段可以與TRB3特異性結(jié)合，并且阻斷其與P62蛋白的相互作 用，使得腫瘤細(xì)胞的自噬水平恢復(fù)正常，因此其適應(yīng)癥在于治療肝癌，肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌 和白血病等癌癥疾病。
[0013] 術(shù)語及簡稱
[0014] ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗
[0015] BSA牛血清白蛋白
[0016] Transwell -種實驗技術(shù)，研究腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的能力。
[0017] Matrigel基底膜基質(zhì)，在室溫條件下，Matrigel聚合形成具有生物學(xué)活性的三維 基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，研究腫瘤細(xì)胞形態(tài)、生化功能、 遷移、侵染和基因表達(dá)等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1 :表面等離子共振方法驗證不同濃度的多肽BI, A2和B3與蛋白TRB3的動力 學(xué)結(jié)合曲線。其中左圖為Bl和TRB3的結(jié)合曲線，中間圖A2和TRB3的結(jié)合曲線，右圖為B3 和TRB3的結(jié)合曲線。
[0019] 圖2 :酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)驗證多肽B1，A2或B3與蛋白TRB3的結(jié)合直方圖。 其中陽性對照為P62蛋白，陰性對照為牛血清白蛋白BSA
[0020] 圖3 :競爭酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)驗證多肽B1，A2或B3競爭TRB3和P62蛋白結(jié) 合的直方圖。其中對照為TRB3與P62的結(jié)合直方圖，Bl、A2、B3分別代表加入多肽BI, A2 或B3后TRB3與P62的結(jié)合直方圖。
[0021] 圖4 :免疫共沉淀的方法驗證在細(xì)胞水平多肽Bl、A2、B3的衍生物P印2-B1、 P印2-A2、P印2-B3對蛋白TRB3和P62相互作用的影響。
[0022] 圖5 :細(xì)胞劃痕實驗驗證在細(xì)胞水平多肽Bl、A2、B3的衍生物P印2-B1、P印2-A2、 P印2-B3對肝癌細(xì)胞劃痕后的運(yùn)動能力的影響。圖5從左到右依次為對照組，P印2-B1、 P印2-A2、P印2-B3多肽加藥組。
[0023] 圖6:Transwell實驗驗證多肽B1、A2、B3的衍生物P印2-BUP印2-A2、P印2-B3對 肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。圖6從左到右依次為對照組，P印2-B1，P印2-A2, P印2-B3多肽 加藥組。
[0024] 圖7:Matrigel膠三維培養(yǎng)實驗驗證多肽Bl、A2、B3的衍生物P印2-B1、 P印2-A2、P印2-B3對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響。圖7從左到右依次為對照組， P印2-B1，P印2-A2, P印2-B3多肽加藥組。
[0025] 圖8:細(xì)胞生長實驗驗證多肽B1、A2、B3的衍生物P印2-B1、P印2-A2、P印2-B3 對肝癌細(xì)胞H印G2,白血病細(xì)胞K562,結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8,肺癌細(xì)胞A549和乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231生長的影響。
[0026] 圖9 :裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證多肽Bl的衍生物P印2-B1在體 內(nèi)對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力的影響。其中左圖為皮下種瘤實驗的結(jié)果，右圖為實驗性肺 轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果。
[0027] 圖10 :裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證多肽Bl的衍生物P印2-B1在 體內(nèi)對肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力的影響。其中左圖為皮下種瘤實驗的結(jié)果，右圖為實驗性 肺轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果。
[0028] 圖11 :裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證多肽Bl的衍生物P印2-B1在 體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力的影響。其中左圖為皮下種瘤實驗的結(jié)果，右圖為實驗 性肺轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果。
[0029] 圖12 :裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證多肽Bl的衍生物P印2-B1在 體內(nèi)對乳腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移能力的影響。其中左圖為皮下種瘤實驗的結(jié)果，右圖為實驗 性肺轉(zhuǎn)移實驗的結(jié)果。
[0030] 圖13 :裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證多肽Bl的衍生物P印2-B1在 小鼠體內(nèi)對白血病細(xì)胞全身浸潤的影響。

【具體實施方式】
[0031] 以下通過多肽篩選，鑒定及應(yīng)用優(yōu)選實施例并結(jié)合附圖具體說明本發(fā)明的各個方 面和特征。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，這些實施例只是用于說明目的，而不限制本發(fā)明的 范圍。本發(fā)明的保護(hù)范圍只受權(quán)利要求書的限制。在不背離權(quán)利要求書范圍的條件下。本 領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明的各個方面進(jìn)行各種修改和改進(jìn)，這些修改和改進(jìn)也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0032] 另外，需要注意的是，除非特別指明，下面實施例中所用的各種材料和試劑都是本 領(lǐng)域中常用的材料和試劑，可以通過常規(guī)的商業(yè)途徑獲得；所用方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的常規(guī)方法或按照廠商所建議的條件。
[0033] 實施例1用表面等離子共振的方法篩選與TRB3蛋白結(jié)合的肽段。
[0034] 首先將P62蛋白分段截短成不同的多肽片段，用多肽固相合成儀進(jìn)行肽段合成， 此過程由北京賽百盛基因有限公司進(jìn)行。
[0035] 實施例整個篩選過程在表面等離子共振儀Biacore T200中進(jìn)行。
[0036] 篩選方法如下：
[0037] 1.將純化的蛋白TRB3(購自RD公司）通過氨基偶聯(lián)到CM5芯片上(購自GE公司）， 10 μ L/min的流速洗去未結(jié)合的蛋白，并且平衡芯片表面2小時。
[0038] 2.將不同濃度的250 μ L多肽片段（200, 50, 12.5, 6· 25nM)自動進(jìn)樣，整個過程在 25°C進(jìn)行。所使用的緩沖液為 HBS-EP 緩沖液（0. 01MHEPES, 0. 15M NaCl, 3mM EDTA, 0. 005% 表面活性劑）。
[0039] 3.用Biacore T200自帶分析軟件模擬不同濃度多肽與TRB3的結(jié)合曲線，得出圖 1中的三條與TRB3蛋白結(jié)合能力較強(qiáng)的肽段BI, A2, B3。
[0040] BI：Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-Met,
[0041] A2 ：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys,
[0042] B3 ：IIe-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-Ile,
[0043] 圖1中的橫坐標(biāo)為反應(yīng)時間，單位為秒?？v坐標(biāo)為反應(yīng)芯片表面與多肽的反應(yīng)強(qiáng) 度，單位為RU。結(jié)果表明從P62蛋白結(jié)構(gòu)域中截取的肽段中，B1，A2和B3肽段與TRB3蛋白 有較高的親和力。
[0044] 實施例2ELISA方法驗證肽段BI, A2和B3與蛋白TRB3的結(jié)合。
[0045] 具體操作步驟如下：
[0046] 1.將人TRB3蛋白及牛血清白蛋白（BSA)用PBS稀釋至10 μ g/ml，每孔添加 100 μ 1，4°C包被96孔ELISA板過夜。
[0047] 2.用含有0. l%Tween_20PBS洗三次。用200μ 1封閉液（10%牛血清PBS)包板， 37°C 包被 2h。
[0048] 3.倒掉包被液，對應(yīng)加入1 μ g/ml多肽B1，A2和B3溶液200 μ 1，同時設(shè)置陽性對 照孔，加入200μ1 lyg/ml Ρ62蛋白溶液，37°C孵育lh。
[0049] 4.用含有0. l%Tween_20PBS洗五次。每孔加入100 μ 1用封閉液I :4000稀釋后 的抗M13單克隆抗體，室溫孵育lh。
[0050] 5.用含有0. l%Tween-20PBS洗六次。配制底物顯色液（lOOmmol/L乙酸鈉，PH6. 0， 每50ml緩沖液加入10μ 130%過氧化氫，100μ g/mlTMB),每孔加入100μ 1,室溫孵育5min。 每孔加入50 μ 10. IM稀硫酸，終止反應(yīng)。
[0051] 6.結(jié)果以樣品孔的OD45tl值繪制柱狀圖，見圖2。
[0052] 結(jié)果表明BI, Α2和Β3肽段與TRB3蛋白有較高的親和力。
[0053] 實施例3競爭ELISA的方法驗證肽段BI, Α2和Β3可以競爭TRB3與Ρ62蛋白的結(jié) 合。
[0054] 具體操作步驟如下：
[0055] 1.將人TRB3蛋白及牛血清白蛋白（BSA)用PBS稀釋至10 μ 1/ml，每孔添加 100 μ 1，4°C包被96孔ELISA板過夜。
[0056] 2.用含有0· l%Tween-20PBS洗三次。用200μ 1封閉液（10%牛血清PBS)包板， 37°C 包被 2h。
[0057] 3.倒掉包被液，對應(yīng)加入1 μ g/ml P62蛋白溶液200μ 1，37°C孵育lh。
[0058] 4.用含有0. l%Tween-20PBS洗五次。每孔加入100 μ 1用封閉液稀釋的辣根過氧 化氫酶標(biāo)記的多肽BI, A2和B3,室溫孵育lh。
[0059] 5.用含有0. l%Tween-20PBS洗六次。配制底物顯色液（100mmol/L乙酸鈉，PH6. 0， 每50ml緩沖液加入10 μ 130%過氧化氫，100 μ g/mlTMB),每孔加入100 μ 1,室溫孵育5min。 每孔加入50 μ 10. IM稀硫酸，終止反應(yīng)。
[0060] 6.結(jié)果以樣品孔的OD45tl值繪制柱狀圖，見圖3。
[0061] 結(jié)果表明BI, A2和B3肽段可以競爭P62蛋白與TRB3蛋白的結(jié)合。
[0062] 實施例4免疫共沉淀的方法驗證肽段P印2-Β1，Ρ印2-A2和P印2-B3可以在細(xì)胞水 平競爭蛋白P62與蛋白TRB3的結(jié)合。
[0063] 將肽段BI, A2和B3連接上細(xì)胞穿膜肽P印2 (序列為HLYVSPW)，組成新的衍生物 P印2-B1，P印2-A2和P印2-B3,此肽段由賽百盛基因技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，純度>98%。
[0064] 免疫共沉淀試劑如下：
[0065] 裂解液 A 液：0· 6057g Tris 堿，I. 7532g NaCl，0. 1017g MgCl2 · 6Η20,0· 0742g EDTA，IOmL甘油，10mL10%NP40,加去離子水至150mL，用HCl調(diào)pH值至7. 6,定容至191mL， 充分混勻，0. 45 μ m濾膜過濾，4° C儲存。
[0066] 裂解液 B 液：200μ?2Μβ-磷酸甘油，4mL2.5M NaF，2mL100mM NaV03,2mL100mM PMSF，200 μ LlM DTT，lmg/mL 的 Leu、P印、Apr 各 200 μ L，總體積共 9mL。母液于-20° C 儲 存。使用前，將B液中各成分的母液解凍，分別按上述組成比例加入A液中并混勻。
[0067] Protein A/G Plus-Agarose 購自美國 Santa cruz 公司。
[0068] 具體操作步驟如下：
[0069] L將肝癌!fepG2細(xì)胞鋪90mm大皿，待細(xì)胞貼壁后加入lmg/ml的多肽P印2-B1， P印2-A2和P印2-B3,孵育12小時后收集細(xì)胞。
[0070] 2.以免疫共沉淀裂解液裂解細(xì)胞，收獲細(xì)胞總蛋白約4-10mg，將各組蛋白調(diào)整至 相同濃度。每組蛋白各取200 μ g，留作細(xì)胞裂解液Input作為對照。
[0071] 3.剩余蛋白加入2yg P62抗體或者與P62抗體種屬相同的Normal IgG，同時加 入 10μ L Protein A/G Plus-Agarose 充分重懸，4° C 緩慢旋轉(zhuǎn)搖動過夜。4° C、3000rpm 離心5min,小心吸除上清，寧可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0. 5mL免疫共沉淀 洗液，混勻，冰浴靜置lmin，4° C、3000rpm離心30sec，小心吸除上清。重復(fù)洗滌5次，最后 一次離心前靜置5min。小心吸除上清，加入20-30 μ L2 X SDS凝膠加樣緩沖液，混勻，95° C 變性3min，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴冷卻。12000rpm室溫離心2min，上清即為沉淀的蛋白樣品，取部 分或全部進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0072] 結(jié)果如圖4所不，細(xì)胞芽I旲膚將膚段BI、A2、B3帶入細(xì)胞后可以明顯抑制TRB3蛋 白與P62蛋白的結(jié)合。
[0073] 實施例5細(xì)胞劃痕實驗驗證肽段P印2-Β1，Ρ印2-A2和P印2-B3可以抑制腫瘤細(xì)胞 劃痕后的愈合。
[0074] 具體操作步驟如下：
[0075] 1.先用記號筆在6孔板背后，用直尺比著劃橫線，橫穿過孔。
[0076] 2.在孔中加入約5 X IO5個HepG2肝癌細(xì)胞，待過夜后細(xì)胞貼壁
[0077] 3.第二天用槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，槍頭要垂直，不要傾斜。
[0078] 4.用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基，同時加入1 μ g/ml的多 膚Pep2_Bl，Pep2_A2, Pep2_B2。
[0079] 5.放入37°C 5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24小時后取樣拍照，實驗結(jié)果見圖5。
[0080] 結(jié)果顯示肽段P印2-B1，P印2-A2, P印2-B3可以抑制腫瘤細(xì)胞劃痕后的愈合能力。
[0081] 實施例6Transwell實驗驗證肽段P印2-B1，P印2-A2和P印2-B3可以抑制腫瘤細(xì) 胞的侵襲和遷移。
[0082] 具體操作步驟如下：
[0083] 1.準(zhǔn)備transwell小室：將Matrigel放在冰上而后放入冰箱中隔夜使其解凍， 將聚碳酸酯膜用指甲油粘在transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室上，風(fēng)干，在膜內(nèi)加入MatrigellO μ 1 (lmg/ml)，置于超凈臺中風(fēng)干，形成一個基質(zhì)屏障膜。
[0084] 2.準(zhǔn)備細(xì)胞懸液：取對數(shù)生長期的H印G2細(xì)胞，無血清DMEM制成5 X IOVml單細(xì) 胞懸液。
[0085] 3.在24孔板中加入含10%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，每孔600 μ 1，將細(xì)胞懸液 加入transwel 1小室中，每小室90 μ 1，給藥組加入多肽P印2-Β1，P印2-Α2和P印2-Β3,將小 室浸于24孔板的完全培養(yǎng)液中，37°C，5%C02孵箱內(nèi)孵育12小時，取出小室，濾膜用多聚甲 醛固定20min，用雙蒸水洗三遍，結(jié)晶紫染液染色lh，雙蒸水洗三遍，棉簽輕輕擦去上層細(xì) 胞，雙蒸水洗三遍，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。
[0086] 典型圖如圖六所示，結(jié)果表明多肽P印2-B1，P印2-A2和P印2-B3可以明顯抑制腫 瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。
[0087] 實施例7Matrigel三維培養(yǎng)實驗驗證多肽P印2-Β1，Ρ印2-A2和P印2-B3可以抑制 腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
[0088] 具體操作步驟如下：
[0089] 1.收集對數(shù)生長期的IfepG2細(xì)胞，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，制成1000細(xì)胞/ml的細(xì)胞 懸液。
[0090] 2.從-20°c冰箱取出Matrigel，融化后取200 μ 1迅速加入24孔板中的孔，使其快 速鋪滿孔的底部。
[0091] 3.帶齊凝固后加入Iml細(xì)胞懸液，同時加入lyg/ml多肽P印2-Β1，P印2-Α2和 Pep2_B3 〇
[0092] 4.然后移培養(yǎng)板于C02培養(yǎng)箱中37 °C進(jìn)行培養(yǎng)。
[0093] 5.培養(yǎng)7-10天后，對細(xì)胞集落進(jìn)行結(jié)晶紫染色，用顯微鏡拍照。
[0094] 細(xì)胞克隆集落典型圖如圖7所示，結(jié)果顯示多肽P印2-B1，P印2-A2和P印2-B3可 以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。
[0095] 實施例8細(xì)胞計數(shù)實驗驗證肽段P印2-Β1，Ρ印2-A2和P印2-B3可以抑制腫瘤細(xì)胞 的生長。
[0096] 具體操作步驟如下：
[0097] 1.收集對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞H印G2,肺癌細(xì)胞A549,結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8,乳腺癌 細(xì)胞MDA-MB231和白血病細(xì)胞K562,調(diào)整細(xì)胞濃度，制成15萬/ml的細(xì)胞懸液。
[0098] 2.將Iml細(xì)胞懸液加入12孔板進(jìn)行培養(yǎng)，12小時后換成新的培養(yǎng)基，并且加入 1 μ g/ml 的多肽 P印2-B1，P印2-A2 和 P印2-B3。
[0099] 3.每隔一天進(jìn)行傳代一次，并且計數(shù)，培養(yǎng)一周后繪制出生長曲線。
[0100] 實驗結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明多肽P印2-B1，P印2-A2和P印2-B3可以明顯抑制 多種腫瘤細(xì)胞的生長。
[0101] 實施例9裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證肽段Pep2-Bl，P印2-A2和 P印2-B3對肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制。
[0102] 1.裸鼠皮下腫瘤生長模型
[0103] 實驗耗材及試劑：滅菌EP管I. 5ml，15ml離心管，槍頭，濾網(wǎng)（100目），脫脂棉球， 鑷子數(shù)把，酒精棉球，無菌ImL注射器，500ml燒杯(滅菌，用前照紫外)，PBS (過濾），胰酶， 血清。
[0104] 實驗動物及分組：4_6周齡雄性裸鼠20只（購自北京維通利華實驗動物有限公 司），隨機(jī)分為兩組：HepG2組10只，P印2-B1給藥組10只。細(xì)胞制備：將貼壁培養(yǎng)的熒光 素酶標(biāo)記的H印G2細(xì)胞用胰酶消化，到達(dá)胰酶消化時間后(此時細(xì)胞狀態(tài)應(yīng)為單細(xì)胞且剛 好貼壁不掉)，吸掉胰酶。用含有1%血清的PBS按2ml/皿終止，將細(xì)胞吹下，移至15ml離 心管中，1200轉(zhuǎn)離心5min。棄上清，PBS重懸，過100目濾網(wǎng)一次；細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃 度至 2. 5xl07/ml。
[0105] 瘤細(xì)胞接種：200 μ 1細(xì)胞懸液接種于裸鼠左上腹部近腋下皮下。
[0106] 腫瘤生長觀察：皮下注射腫瘤細(xì)胞后一周用多肽進(jìn)行治療（5mg/kg體重，每周兩 次)，活體成像儀每周一次觀測腫瘤生長狀態(tài)。
[0107] 2.裸鼠尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移模型
[0108] 實驗耗材及試劑：滅菌EP管，槍頭，濾網(wǎng)（200目），針頭（4號)，脫脂棉球，鑷子數(shù) 把，酒精棉球，無菌250 μ L注射器，PBS (過濾），胰酶，血清。
[0109] 實驗動物及分組：4_6周齡雄性裸鼠20只（購自北京維通利華實驗動物有限公 司），隨機(jī)分為兩組，IfepG2組10只，P印2-Β1給藥組10只。
[0110] 細(xì)胞制備同皮下種瘤模型。
[0111] 瘤細(xì)胞注射：100 μ 1細(xì)胞懸液尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)。
[0112] 腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移觀察：尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞后一周用多肽進(jìn)行治療（5mg/kg體 重，每周兩次)，活體成像儀每周一次觀測腫瘤轉(zhuǎn)移狀態(tài)。
[0113] 實驗六周后，肝癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移狀況見圖9,其中圖9左為肝癌細(xì)胞在小鼠體 內(nèi)瘤體大小的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。圖9右為肝癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn) 移的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。結(jié)果顯示Pep-Bl能明顯抑制肝癌 細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長和肺轉(zhuǎn)移。
[0114] 實施例10裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證肽段P印2-B1可以抑制肺 癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
[0115] 材料和方法同實施例9,所不同之處在于所用腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞A549。實驗六 周后，肺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移狀況見圖10,其中圖10左為肺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)瘤體大小的 典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。圖10右為肝癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移的典型圖， 模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。結(jié)果顯示Pep-Bl能明顯抑制肺癌細(xì)胞在小鼠體 內(nèi)的生長和肺轉(zhuǎn)移。
[0116] 實施例11裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證肽段P印2-B1可以抑制結(jié) 腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
[0117] 材料和方法同實施例9,所不同之處在于所用腫瘤細(xì)胞為結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8。實驗 六周后，結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移狀況見圖11，其中圖10左為結(jié)腸癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)瘤體 大小的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。圖11右為結(jié)腸癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移 的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。結(jié)果顯示Pep-Bl能明顯抑制結(jié)腸癌 細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長和肺轉(zhuǎn)移。
[0118] 實施例12裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證肽段P印2-B1可以抑制乳 腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。
[0119] 材料和方法同實施例9,所不同之處在于所用腫瘤細(xì)胞為乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231。實驗六周后，乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移狀況見圖12,其中圖12左為乳腺癌細(xì) 胞在小鼠體內(nèi)瘤體大小的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。圖12右為乳腺 癌細(xì)胞肺部轉(zhuǎn)移的典型圖，模型為不給藥組，Pep2-Bl為多肽給藥組。結(jié)果顯示Pep-Bl能 明顯抑制乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長和肺轉(zhuǎn)移。
[0120] 實施例13裸鼠皮下種瘤實驗和實驗性肺轉(zhuǎn)移實驗驗證肽段P印2-B1可以抑制白 血病細(xì)胞的浸潤。
[0121] 材料和方法同實施例9,所不同之處在于所用實驗動物為NOD-SCID小鼠(購自北 京維通利華實驗動物有限公司），所用腫瘤細(xì)胞為白血病細(xì)胞K562。實驗六周后，白血病細(xì) 胞對小鼠全身浸潤狀況見圖13,其中圖13左為不給藥的模型組，Pep2-Bl為多肽給藥組。 結(jié)果顯示Pep-Bl能明顯抑制白血病細(xì)胞對小鼠的全身浸潤。
【權(quán)利要求】
1. 如序列SNl、SN2、SN3所示的多肽，其特征在于，氨基酸序列如下： SNl :Ser-Leu-Ser-Gln-Met-Leu-Ser-Met， SN2 ：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys, SN3 :1le-Gly-Ala-Ala-Leu-Asp-Thr-IIe〇
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的多肽，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述氨基酸序列而在其他位置 出現(xiàn)氨基酸替換，缺失或添加，且能與TRB3特異性結(jié)合的寡肽序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的與TRB3特異性結(jié)合的多肽及其衍生物，其特征在于，用于靶 向治療與TRB3相關(guān)的疾病。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1和2中任一項所述的多肽在制備預(yù)防和/或治療腫瘤藥物中的應(yīng) 用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的應(yīng)用，所述的腫瘤選自肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、白血病。
【文檔編號】A61P35/00GK104211765SQ201310206907
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】胡卓偉, 李珂, 花芳, 呂曉希, 余嬌嬌 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所