一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物，包括難溶性多糖和血液成分，血液成分是全血或血衆(zhòng)，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。本發(fā)明通過(guò)將血液成分與難溶性多糖混合，使血液成分在難溶性多糖表面均勻分散地發(fā)生凝血反應(yīng)，使凝血過(guò)程中產(chǎn)生的凝血因子被難溶性多糖表面吸附，并保持較高的促凝血活性，從而得到凝血效果極好的復(fù)合止血材料。本發(fā)明制備難溶性多糖復(fù)合物的方法簡(jiǎn)單，使用便利、安全，可廣泛用于創(chuàng)傷和手術(shù)止血。與其他醫(yī)用材料、醫(yī)療器械組合，可制成創(chuàng)可貼、輸液貼、自粘敷料、片劑和膠囊芯料、手術(shù)包、急救包等，同時(shí)利用其吸附性能等特點(diǎn)吸附抗菌素和止痛藥等于其中，從而得到更好的療效。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù) 合物及其制備方法，以及包含該復(fù)合物的止血材料。

【背景技術(shù)】
[0002] 止血是緊急救生的關(guān)鍵步驟。開(kāi)發(fā)能夠在很短的時(shí)間內(nèi)（3分鐘)就能控制住像主 動(dòng)脈流血這樣的緊急情況的止血材料，可以為進(jìn)一步的醫(yī)療救治贏得寶貴的時(shí)間，大大降 低出血、創(chuàng)傷等導(dǎo)致的死亡。
[0003]目前已經(jīng)有將難溶性多糖應(yīng)用于止血的報(bào)道，其中多使用的主要有殼聚 糖（CN202020720U，CN102526795A)、纖維素（CN100348272C，CN1109756A)和淀粉 (CN102178691B)。殼聚糖是甲殼素經(jīng)過(guò)脫乙?；笾频玫奶烊痪坳?yáng)離子多糖，殼聚糖分子 具有凝血、抑菌、促進(jìn)傷口愈合等多種作用，是一類(lèi)生物相容性好、易生物降解、無(wú)免疫原 性、無(wú)刺激性的多功能高分子材料。目前應(yīng)用于外出血的市場(chǎng)容量最大的止血材料之一是 美國(guó)HemCon公司的殼聚糖止血帶HemCon Bandage ,其主要成分便是殼聚糖材料。殼聚糖 促進(jìn)凝血的機(jī)理是活化血小板加速凝血反應(yīng)。同時(shí)殼聚糖材料具有極強(qiáng)的粘性，能夠粘附 在傷口的表面形成覆蓋物，阻止傷口出血，在創(chuàng)傷、手術(shù)止血治療中展現(xiàn)出十分光明的應(yīng)用 前景。但是殼聚糖材料由于只活化血小板，對(duì)凝血通道的活化作用不明顯，因而凝血效果 有限。因此研究人員不得不尋找開(kāi)發(fā)凝血效果更好的殼聚糖基凝血材料。把凝血酶負(fù)載 到殼聚糖材料表面是提高殼聚糖材料凝血效果的有效方法。例如中國(guó)專(zhuān)利CN101053669A， CN102526795A報(bào)道將凝血酶負(fù)載到殼聚糖材料表面，增強(qiáng)了材料的凝血效果。但是由于 殼聚糖表面基團(tuán)與凝血酶的作用，導(dǎo)致凝血酶的活性下降。另外由于殼聚糖與凝血酶的相 互作用力較弱，因而凝血酶的吸附量不高。同時(shí)由于凝血酶價(jià)格昂貴（牛凝血酶價(jià)格約 30, 000元/克），大大限制了其負(fù)載到殼聚糖表面作為止血的應(yīng)用。
[0004] 綜上所述殼聚糖負(fù)載凝血酶止血材料存在以下的缺陷：1)凝血酶價(jià)格昂貴（牛 凝血酶價(jià)格約30, 000元/克）；2)將凝血酶負(fù)載到殼聚糖材料表面的方法，使得兩者相互 作用力弱，不能實(shí)現(xiàn)凝血酶和止血材料的有效結(jié)合，負(fù)載的凝血酶容易脫落，用于傷口止血 時(shí)，脫落的凝血酶可能進(jìn)入到血管導(dǎo)致血栓；3)凝血酶負(fù)載到殼聚糖表面后有較大的活性 損失，因而產(chǎn)品難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。
[0005] 與殼聚糖材料相比，纖維素和淀粉材料的生物相容性更好，對(duì)血小板的活化作用 更弱，止血效果相對(duì)更差。目前針對(duì)纖維素的止血?jiǎng)饕菍?duì)纖維素進(jìn)行修飾或者負(fù)載凝 血酶，由于負(fù)載凝血酶的價(jià)格昂貴，且負(fù)載過(guò)程中凝血酶活力損失較大，因而難以商業(yè)化。 而針對(duì)淀粉的止血?jiǎng)?，主要是利用淀粉的?qiáng)吸水性以及負(fù)載凝血酶，因而也面臨著凝血酶 活力損失和價(jià)格昂貴的問(wèn)題。
[0006] 為了制得止血效果好、并且能具有商業(yè)化前景的難溶性多糖止血材料，有必要解 決在止血材料中有效地引入凝血酶的技術(shù)和成本問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物及其 制備方法，以及包含該復(fù)合物的止血材料。
[0008] 本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案： 一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括難溶性多糖和血液成分， 所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0009] 本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物中，血液成分中存在的無(wú)機(jī)離子(如鈣離子、鎂離子 等）導(dǎo)致凝血反應(yīng)被激發(fā)，原位發(fā)生凝血反應(yīng)生成凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白 質(zhì)；同時(shí)，血液成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖 維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發(fā)生交聯(lián)，生成網(wǎng)狀的纖維蛋白，難 溶性多糖表面被網(wǎng)狀的纖維蛋白包裹，根據(jù)酶與底物的特異性識(shí)別作用，生成的凝血酶等 促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋 白上，而不會(huì)被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。這保證了本發(fā)明的難溶 性多糖復(fù)合物高效的凝血效率。并且本發(fā)明難溶性多糖復(fù)合物材料兼具活化的凝血因子和 難溶性多糖的特性，可廣泛用于創(chuàng)傷和手術(shù)止血，具有極大的優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物，可以?xún)H由難溶性多糖和血液成分組成，所述的 血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0011] 此外，本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物還可以進(jìn)一步包括外加的能促進(jìn)激發(fā)凝血反應(yīng) 的無(wú)機(jī)離子，也就是所述的難溶性多糖復(fù)合物由難溶性多糖、血液成分和外加的無(wú)機(jī)離子 組成，所述的外加的無(wú)機(jī)離子可以選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。 通過(guò)外加的無(wú)機(jī)離子，可以起到進(jìn)一步促進(jìn)凝血反應(yīng)的效果。優(yōu)選的，所述的外加的無(wú)機(jī)離 子在血液成分中的濃度為2mM?10mM。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0013] 進(jìn)一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0014] 本發(fā)明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；本發(fā)明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖與經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0015] 但本發(fā)明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團(tuán)修飾的、對(duì)凝血無(wú)抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發(fā)明。
[0016] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物中，所述的全血可以是人或動(dòng)物的全血。所述的 血漿為純的血漿，或者包含血細(xì)胞的血漿，所述的血細(xì)胞選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血 小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動(dòng)物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無(wú)機(jī)離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發(fā) 明。
[0017] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物中，所述的復(fù)合物中難溶性多糖與血液成分以任 意比例混合，優(yōu)選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質(zhì)量比為1:8?1:1。
[0018] 本發(fā)明還提供二種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物的制備方法： 方法一包括如下步驟： 1) 將難溶性多糖與血液成分混合，制得難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料，所述的血液 成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述的混合溫 度為5?37°C，所述的混合時(shí)間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復(fù) 合物。
[0019] 上述方法中，所述步驟1)中的難溶性多糖與血液成分混合，血液成分中存在的無(wú) 機(jī)離子(如鈣離子、鎂離子等）導(dǎo)致凝血反應(yīng)被激發(fā)，原位發(fā)生凝血反應(yīng)生成凝血因子FXa、 凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)；同時(shí)，血液成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促 進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發(fā)生交 聯(lián)，生成網(wǎng)狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面被網(wǎng)狀的纖維蛋白包裹，根據(jù)酶與底物的特異性 識(shí)別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)被包裹在難溶性多糖表面的纖 維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋白上，而不會(huì)被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并 保持較高的活性。
[0020] 上述方法中，所述步驟1)中，難溶性多糖與血液成分的混合比例為任意比例，優(yōu) 選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質(zhì)量比為1:8?1:1。
[0021] 作為優(yōu)選，上述方法中，所述步驟1)中，所述的全血可以是人或動(dòng)物的全血；所述 的血漿為純的血漿，或者包含血細(xì)胞的血漿，所述的血細(xì)胞選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 血小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動(dòng)物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無(wú)機(jī)離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發(fā) 明。
[0022] 更優(yōu)選的，所述步驟1)中，所述的血漿為添加鈣離子的血漿。
[0023] 上述方法中，所述步驟1)中的混合方式可以是聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次 抽吸等方式將所述的難溶性多糖與血液成分混合。
[0024] 作為優(yōu)選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0025] 進(jìn)一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0026] 本發(fā)明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發(fā)明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖與經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0027] 但本發(fā)明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團(tuán)修飾的、對(duì)凝血無(wú)抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發(fā)明。
[0028] 上述方法中，所述步驟2)中的干燥方法可以是真空干燥或冷凍干燥，所述的真空 干燥溫度可以是20°C?38°C，時(shí)間為0. 5?5 h。
[0029] 方法二包括如下步驟： 1) 將難溶性多糖、血液成分、無(wú)機(jī)離子混合，制得難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料；所 述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述 的混合溫度為5?37°C，所述的混合時(shí)間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復(fù) 合物。
[0030] 上述方法中，所述步驟1)中的加入無(wú)機(jī)離子的目的是促進(jìn)啟動(dòng)凝血通道，促進(jìn)凝 血反應(yīng)的發(fā)生，所述的無(wú)機(jī)離子選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種，所 述的無(wú)機(jī)離子可以來(lái)自包括上述離子的可溶性無(wú)機(jī)鹽，所述的外加的無(wú)機(jī)離子在血液成分 中的濃度為2mM?10mM。
[0031] 上述方法中，所述步驟1)中的難溶性多糖、血液成分、無(wú)機(jī)離子混合，促進(jìn)凝血反 應(yīng)的激發(fā)，原位發(fā)生凝血反應(yīng)生成凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)；同時(shí)，血液 成分中的纖維蛋白原被凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，生 成的纖維蛋白單體在難溶性多糖的表面發(fā)生交聯(lián)，生成網(wǎng)狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面 被網(wǎng)狀的纖維蛋白包裹，根據(jù)酶與底物的特異性識(shí)別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等 促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋 白上，而不會(huì)被血漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。
[0032] 上述方法中，所述步驟1)中，難溶性多糖與血液成分的混合比例為任意比例，優(yōu) 選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質(zhì)量比為1:8?1:1。
[0033] 作為優(yōu)選，上述方法中，所述步驟1)中，所述的全血可以是人或動(dòng)物的全血。所述 的血漿為純的血漿，或者包含血細(xì)胞的血漿，所述的血細(xì)胞選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 血小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動(dòng)物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無(wú)機(jī)離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發(fā) 明。
[0034] 上述方法中，所述步驟1)中的混合方式可以是聲波、攪拌、渦旋或用注射器多次 抽吸等方式將所述的難溶性多糖與血液成分混合。
[0035] 作為優(yōu)選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0036] 進(jìn)一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0037] 本發(fā)明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發(fā)明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖與經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0038] 但本發(fā)明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團(tuán)修飾的、對(duì)凝血無(wú)抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發(fā)明。
[0039] 上述方法中，所述步驟2)中的干燥方法可以是真空干燥或冷凍干燥，所述的真空 干燥溫度可以是20°C?38°C，時(shí)間為0. 5?5 h。
[0040] 方法一或方法二的步驟完成后，還可以將制得的具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合 物磨碎、滅菌保存，可以更方便地做成止血材料。
[0041] 所述的滅菌采用Co-60射線滅菌。
[0042] 本發(fā)明還提供一種用于止血的材料，所述的止血材料包含本發(fā)明所述的難溶性多 糖復(fù)合物作為有效成分，或者還包含醫(yī)學(xué)上可接受的其他輔料或其他藥物。
[0043] 本發(fā)明還提供一種用于止血的材料，其特征在于：所述的止血材料可以是單獨(dú)的 難溶性多糖復(fù)合物，也可以是包含難溶性多糖復(fù)合物和輔料，也可以是包含難溶性多糖復(fù) 合物和其他藥物，還可以是包含難溶性多糖復(fù)合物、輔料和其他藥物，所述的輔料包括聚乙 二醇、聚丙三醇、碳酸鈣等，所述輔料的優(yōu)選的重量百分?jǐn)?shù)為〇?80% ;所述的其他藥物可以 是具有消炎、止痛、抗菌功能的藥物，例如慶大霉素、氧氟沙星等。
[0044] 所述的止血材料的劑型可以是軟膏、糊膏、霜膏、止血貼、止血紗布、止血微球等。
[0045] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1、反應(yīng)條件溫和、操作簡(jiǎn)便易行，原料廉價(jià)易得。殼聚糖、纖維素、淀粉等以及動(dòng)物血漿 的價(jià)格都非常便宜。
[0046] 2、通過(guò)將難溶性多糖-血漿復(fù)合，凝血活化后的促凝因子在材料的表面保持了較 高的活性，使得難溶性多糖-血漿復(fù)合材料具有極好的效果。
[0047] 3、所得的難溶性多糖-血漿復(fù)合物，保持了難溶性多糖本身生物相容性好的特 性。有利于應(yīng)用于各種創(chuàng)傷和手術(shù)止血。同時(shí)利用材料本身的吸附性能等，可以吸附抗菌 素、止痛藥于其中，復(fù)合用藥。
[0048] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所制備的材料在創(chuàng)傷、手術(shù)止血治療中有明顯優(yōu)勢(shì)。 由于動(dòng)物血漿很便宜（約2元/kg)，通過(guò)將動(dòng)物血漿與高分子多糖材料混合，1元價(jià)格的 動(dòng)物血漿與高分子多糖材料復(fù)合得到的具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物的止血效果與 10, 000元牛凝血酶所起到的作用相當(dāng)，可以大大降低止血材料的成本。由于血漿在難溶性 多糖復(fù)合物的表面凝血，使得促凝的活化后凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)吸附 在難溶性多糖復(fù)合物的表面。由于這種吸附作用，使它們不會(huì)被抗凝血酶抑制，從而在難溶 性多糖復(fù)合物的表面保持很高的活性。而單獨(dú)將血凝塊凝血時(shí)，由于血凝塊形成過(guò)程中產(chǎn) 生的凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)很快就被抗凝血酶等抑制劑結(jié)合，失去了促 凝的活性，因而，單獨(dú)的血凝塊促凝效果微弱。難溶性多糖復(fù)合物中的高分子多糖可以激 發(fā)血液成分中的血小板促進(jìn)凝血反應(yīng)，而表面活化的凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋 白質(zhì)可以直接活化血液成分中的凝血因子酶原，大大的加速凝血反應(yīng)，起到快速止血的作 用。并且難溶性多糖復(fù)合物保持了高分子多糖材料良好的生物相容性，因而不會(huì)引起組織 反應(yīng)，也不會(huì)引起傷口感染，使用非常安全，無(wú)嚴(yán)重毒副作用。同時(shí)利用高分子多糖材料的 吸附性能，可將其他藥物如消炎、止痛、抗菌藥等吸附于其中，得到更好的療效。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1為本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物的形成過(guò)程示意圖。
[0050] 圖2為本發(fā)明的殼聚糖/血漿復(fù)合物與自然凝血、殼聚糖、血凝塊的體外凝血效果 比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。
[0051] 圖3為本發(fā)明的殼聚糖/血漿復(fù)合物、殼聚糖/全血復(fù)合物與自然凝血、游離凝血 酶、云南白藥、殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得 到。
[0052] 圖4為本發(fā)明的不同比例殼聚糖/血漿復(fù)合物(分別按1:0. 5，1:1，1:2，1:4， 1:8的質(zhì)量比混合）與自然凝血、殼聚糖的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得 到。
[0053] 圖5為本發(fā)明的纖維素/血漿復(fù)合物、纖維素/全血復(fù)合物與自然凝血、游離凝 血酶、纖維素、纖維素/凝血酶復(fù)合材料的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得 到。
[0054] 圖6為本發(fā)明的不同比例淀粉/血漿復(fù)合物(分別按1:1，1:2，1:4的質(zhì)量比混 合）與自然凝血、淀粉的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。
[0055] 圖7為本發(fā)明的木質(zhì)素/血漿復(fù)合物、瓊脂糖/血漿復(fù)合物與自然凝血、木質(zhì)素、 瓊脂糖的體外凝血效果比較圖，誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。
[0056] 圖8為本發(fā)明的氨基化殼聚糖/血漿復(fù)合物、巰基化殼聚糖/血漿復(fù)合物、羧基化 殼聚糖/血漿復(fù)合物與自然凝血、氨基化殼聚糖、巰基化殼聚糖、羧基化殼聚糖的體外凝血 效果比較圖。誤差線由三組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 本發(fā)明提供一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括難溶性 多糖和血液成分，所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿 的高分子多糖。
[0058] 本發(fā)明中難溶性多糖復(fù)合物的形成過(guò)程示意圖如圖1所示。本發(fā)明的難溶性多糖 復(fù)合物中，血液成分中存在的無(wú)機(jī)離子(如鈣離子、鎂離子等）導(dǎo)致凝血反應(yīng)被激發(fā)，原位發(fā) 生凝血反應(yīng)生成凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)；同時(shí)，血液成分中的纖維蛋白 原被凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，生成的纖維蛋白單體 在難溶性多糖的表面發(fā)生交聯(lián)，生成網(wǎng)狀的纖維蛋白，難溶性多糖表面被網(wǎng)狀的纖維蛋白 包裹，根據(jù)酶與底物的特異性識(shí)別作用，生成的凝血因子FXa、凝血酶等促進(jìn)凝血的蛋白質(zhì) 被包裹在難溶性多糖表面的纖維蛋白牢牢吸附，并均勻地分散在纖維蛋白上，而不會(huì)被血 漿中抗凝血酶等抑制劑抑制，并保持較高的活性。這保證了本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物高 效的凝血效率。并且本發(fā)明難溶性多糖復(fù)合物材料兼具活化的凝血因子和難溶性多糖的特 性，可廣泛用于創(chuàng)傷和手術(shù)止血，具有極大的優(yōu)點(diǎn)。
[0059] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物，可以?xún)H由難溶性多糖和血液成分組成，所述的 血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖。
[0060] 此外，本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物還可以包括外加的能促進(jìn)激發(fā)凝血反應(yīng)的無(wú)機(jī) 離子，也就是所述的難溶性多糖復(fù)合物由難溶性多糖、血液成分和外加的無(wú)機(jī)離子組成，所 述的外加的無(wú)機(jī)離子可以選自鈣離子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。通過(guò)外加 的無(wú)機(jī)離子，可以起到進(jìn)一步促進(jìn)凝血反應(yīng)的效果。優(yōu)選的，所述的外加的無(wú)機(jī)離子在血液 成分中的濃度為2mM?10mM。
[0061] 作為優(yōu)選，所述的難溶性多糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它 們的混合物。
[0062] 進(jìn)一步地，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高 分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種。
[0063] 本發(fā)明所述的難溶性多糖，可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖，所述的高 分子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種；也可 以是經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分子多糖，所述的改性的高分子多糖選自羧基改性的高分子多 糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一種或任意多種，所述的高分 子多糖可以選自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。本發(fā)明所 述的難溶性多糖還可以是天然的未經(jīng)化學(xué)處理的高分子多糖與經(jīng)化學(xué)處理的改性的高分 子多糖的混合物。
[0064] 但本發(fā)明所述的難溶性多糖并不限于此，所有其他基團(tuán)修飾的、對(duì)凝血無(wú)抑制作 用的難溶性多糖材料均適用于本發(fā)明。
[0065] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物中，所述的全血可以是人或動(dòng)物的全血。所述的 血漿為純的血漿，或者包含血細(xì)胞的血漿，所述的血細(xì)胞選自紅細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血 小板中的任意一種或任意多種。所述的血漿可以是動(dòng)物血漿(例如豬、兔、牛、雞、鴨的血 漿)，也可以是人的血漿。所述的血漿可以是抗凝血漿或者不添加抗凝劑的血漿，所述的血 漿還可以是添加無(wú)機(jī)離子(例如鈣離子、鎂離子、鍶離子）的血漿。各種血漿均適用于本發(fā) 明。
[0066] 本發(fā)明所述的難溶性多糖復(fù)合物中，所述的復(fù)合物中難溶性多糖與血液成分以任 意比例混合，優(yōu)選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質(zhì)量比為1:8?1:1。
[0067] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，實(shí)施例和對(duì)比實(shí)施例中以豬的全血、 血漿為例，來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的難溶性多糖復(fù)合物的制備方法和凝血效果，以人或者其他動(dòng)物 的全血、血漿為原料制備難溶性多糖復(fù)合物的方法、凝血效果的規(guī)律均相同。凝血效果以凝 血時(shí)間計(jì)，凝血時(shí)間越短，凝血效果越好。
[0068] 對(duì)比實(shí)施例1 自然凝血效果的測(cè)定：在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小 時(shí)。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，取40ul的0. 2M CaCl2溶液加入到10ml的離心管中，然后加入2ml恒溫 的全血，全血凝固的時(shí)間記為自然凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次 記錄的平均值，得到自然凝血時(shí)間為9. 6min，其凝血效果見(jiàn)圖2?圖8。
[0069] 對(duì)比實(shí)施例2 殼聚糖凝血效果的測(cè)定：取50mg殼聚糖(分子量15萬(wàn)?20萬(wàn)）加入到10ml的離心管 中，在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。然后加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為殼聚糖的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定 凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平均值，得到殼聚糖的凝血時(shí)間為4. 1 min，由此 可見(jiàn)殼聚糖的凝血效果一般，其凝血效果見(jiàn)圖2和圖4。
[0070] 對(duì)比實(shí)施例3 血凝塊凝血效果的測(cè)定：將l〇〇ul血漿置于試管中，加入10ul鈣離子，放置半小時(shí)待其 凝血。然后干燥，攪碎；在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察干燥后血凝塊的凝血效果，全血凝固 時(shí)的時(shí)間記為血凝塊的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平 均值，得到血凝塊的凝血時(shí)間為2. 3 min，其凝血效果一般，見(jiàn)圖2。
[0071] 實(shí)施例1 殼聚糖/血漿復(fù)合物的制備：將50mg殼聚糖材料(分子量15萬(wàn)?20萬(wàn)）與100ul抗 凝血漿混合(按1:2的質(zhì)量比)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時(shí)，得到殼聚糖/ 血漿復(fù)合材料，將其在30°C真空干燥5h，得到殼聚糖/血漿復(fù)合物。
[0072] 殼聚糖/血漿復(fù)合物凝血效果的測(cè)定：將殼聚糖/血漿復(fù)合物磨碎，在25°C進(jìn)行 體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。取50mg殼聚糖/血漿復(fù)合物，然后加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為 殼聚糖/血漿復(fù)合物的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平 均值，得到殼聚糖/血漿復(fù)合物的凝血時(shí)間為1 min，其凝血效果較好，見(jiàn)圖2。由此可見(jiàn)， 殼聚糖與添加鈣離子的血漿復(fù)合之后凝血效果大大提高。
[0073] 制得的殼聚糖/血漿復(fù)合物分別與對(duì)比實(shí)施例1-3的自然凝血、殼聚糖、血凝塊的 體外凝血效果比較圖見(jiàn)圖2,由圖2可知，殼聚糖/血漿復(fù)合物的凝血效果優(yōu)于殼聚糖和血 凝塊的凝血效果，更優(yōu)于自然凝血的效果。
[0074] 實(shí)施例2 殼聚糖/全血復(fù)合物的制備：將50mg殼聚糖(分子量15萬(wàn)?20萬(wàn))與100ul全血混合 (按1:2的質(zhì)量比)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時(shí)，得到殼聚糖/全血復(fù)合材 料，將其在30°C真空干燥5h，得到殼聚糖/全血復(fù)合物。
[0075] 殼聚糖/全血復(fù)合物凝血效果的測(cè)定：將殼聚糖/全血復(fù)合物磨碎，在25°C進(jìn)行 體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。取50mg殼聚糖/全血復(fù)合物，然后加 入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為 殼聚糖/全血復(fù)合物的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平 均值，得到殼聚糖/全血復(fù)合物的凝血時(shí)間為1. 1 min，其凝血效果較好，見(jiàn)圖3。
[0076] 對(duì)比實(shí)施例4 游離凝血酶凝血效果的測(cè)定：在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫 半小時(shí)。取凝血酶（Sigma T4648凝血酶，生產(chǎn)商Sigma-Aldrich公司）配制成lmg/ml溶 液，取l〇〇ul進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)。然后加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血， 考察其凝血效果，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為殼聚糖/全血復(fù)合物的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝 血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平均值，得到凝血酶的凝血時(shí)間為〇. 67 min，其凝血 效果很好，見(jiàn)圖3。
[0077] 對(duì)比實(shí)施例5 殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料的制備：參考中國(guó)專(zhuān)利CN 102526795A的方法，將5g殼聚糖 分散于30ml蒸餾水中；將凝血酶溶于pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液，得到質(zhì)量濃度為0. 1 % 的凝血酶（Sigma T4648凝血酶，生產(chǎn)商Sigma-Aldrich公司)溶液10ml ;然后將二者按體積 比3:1混合，制得殼聚糖與凝血酶的重量比例為500:1的混合溶液40mL。在攪拌的條件下， 加入0. 5g丙三醇和lg甘露醇，并逐滴加入質(zhì)量濃度5%的氯化鈣溶液50ul，混合均勻，再 于攪拌狀態(tài)下，逐滴加入體積濃度1 %戊二醛溶液250ul進(jìn)行交聯(lián)，然后傾入適當(dāng)形狀的模 具中，放置2小時(shí)，待形成凝膠后，-20°C冷凍24小時(shí)，再于-40°C真空冷凍干燥36小時(shí)，倒 模、磨碎、封裝。得到固定凝血酶的殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料。
[0078] 殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料凝血效果的測(cè)定：在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù) 先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。取50mg該殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料，加入40ul的0. 2M CaCl2， 最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為殼聚糖/凝血酶復(fù)合材 料的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平均值，得到殼聚糖/ 凝血酶復(fù)合材料的凝血時(shí)間為2. 2 min,與對(duì)比實(shí)施例4游離凝血酶的凝血效果對(duì)比，固定 凝血酶的殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料的凝血效果降低，說(shuō)明凝血酶固定后凝血效果降低，見(jiàn) 圖3。
[0079] 對(duì)比實(shí)施例6 云南白藥凝血效果的測(cè)定：在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)，將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半 小時(shí)。取云南白藥(產(chǎn)品批號(hào)ZA12041)粉末0. lg，加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml 恒溫的全血，考察其凝血效果，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為云南白藥的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝 血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平均值，得到云南白藥的凝血時(shí)間為4. 2 min，其促 凝效果一般，見(jiàn)圖3。
[0080] 實(shí)施例1制得的殼聚糖/血漿復(fù)合物、實(shí)施例2制得的殼聚糖/全血復(fù)合物與對(duì) 比實(shí)施例1的自然凝血、對(duì)比實(shí)施例4-6的游離凝血酶、云南白藥、殼聚糖/凝血酶復(fù)合材 料的凝血效果比較圖見(jiàn)圖3,由圖3可知，殼聚糖/血液成分復(fù)合物(殼聚糖/血漿復(fù)合物、 殼聚糖/全血復(fù)合物）的凝血效果與游離凝血酶相差不大，并且大大優(yōu)于商業(yè)化的止血產(chǎn) 品，如云南白藥，也優(yōu)于固定了凝血酶的殼聚糖/凝血酶復(fù)合材料，由于本發(fā)明制備方法簡(jiǎn) 單，原料低廉，因而前景十分廣闊。
[0081] 實(shí)施例3 不同比例的殼聚糖/血漿復(fù)合物的制備：將50mg殼聚糖(分子量15萬(wàn)?20萬(wàn)）分別 與 25111、50111、100111、200111、400111 抗凝血漿混合(分別按1:0.5，1:1，1:2，1:4，1:8的 質(zhì)量比混合)，加入鈣離子使其濃度為5mM，25°C混合半小時(shí)，分別制得殼聚糖/25ul血漿復(fù) 合材料、殼聚糖/50ul血漿復(fù)合材料、殼聚糖/lOOul血漿復(fù)合材料、殼聚糖/200ul血漿復(fù) 合材料、殼聚糖/400ul血漿復(fù)合材料，將上述血漿復(fù)合材料分別在30°C真空干燥，分別制 得殼聚糖/25ul血漿復(fù)合物、殼聚糖/50ul血漿復(fù)合物、殼聚糖/lOOul血漿復(fù)合物、殼聚糖 /200ul血漿復(fù)合物、殼聚糖/400ul血漿復(fù)合物。
[0082] 不同比例的殼聚糖/血漿復(fù)合物凝血效果的測(cè)定：在25°C進(jìn)行體外凝血實(shí)驗(yàn)， 將全血預(yù)先在25°C水浴恒溫半小時(shí)。上述血漿復(fù)合物分別各取50mg，加入40ul的0. 2M CaCl2，最后加入2ml恒溫的全血，考察其凝血時(shí)間，全血凝固時(shí)的時(shí)間記為殼聚糖/血漿復(fù) 合物的凝血時(shí)間。將上述測(cè)定凝血時(shí)間的步驟重復(fù)三次，取三次記錄的平均值，分別得到不 同比例的殼聚糖/血漿復(fù)合物的凝血時(shí)間數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。
[0083] 表1不同比例的殼聚糖/血漿復(fù)合物的凝血時(shí)間數(shù)據(jù)

【權(quán)利要求】
1. 一種具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的復(fù)合物包括難溶性多 糖和血液成分，所述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的 高分子多糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的難溶性多糖復(fù)合物 中還進(jìn)一步包括無(wú)機(jī)離子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的無(wú)機(jī)離子選自鈣離 子、鎂離子、鍶離子中的任意一種或任意多種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的難溶性多 糖選自天然的高分子多糖、改性的高分子多糖或者它們的混合物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的改性的高分子多糖 選自羧基改性的高分子多糖、氨基改性的高分子多糖、巰基改性的高分子多糖中的任意一 種或任意多種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的高分子多糖選 自纖維素、木質(zhì)素、淀粉、殼聚糖、瓊脂糖中的任意一種或任意多種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的難溶性多糖復(fù)合物，其特征在于：所述的復(fù)合物中 難溶性多糖與血液成分以任意比例混合，優(yōu)選的混合比例為難溶性多糖：血液成分的質(zhì)量 比為1:8?1:1。
8. 權(quán)利要求1所述的具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括 如下步驟： 1) 將難溶性多糖與血液成分混合，制得難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料，所述的血液 成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述的混合溫 度為5?37°C，所述的混合時(shí)間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復(fù) 合物。
9. 權(quán)利要求2所述的具有止血功能的難溶性多糖復(fù)合物的制備方法，其特征在于包括 如下步驟： 1) 將難溶性多糖、血液成分、無(wú)機(jī)離子混合，制得難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料，所 述的血液成分是全血或血漿，所述的難溶性多糖是不溶于全血或血漿的高分子多糖；所述 的混合溫度為5?37°C，所述的混合時(shí)間為10?60min ; 2) 將上述難溶性多糖-血液成分復(fù)合材料干燥，制得具有止血功能的難溶性多糖復(fù) 合物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于：所述的無(wú)機(jī)離子選自鈣離子、鎂離 子、鍶離子中的任意一種或任意多種。
11. 一種用于止血的材料，其特征在于：所述的止血材料包含權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述 的難溶性多糖復(fù)合物作為有效成分，或者還包含醫(yī)學(xué)上可接受的輔料或其他藥物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的止血材料，所述的止血材料的劑型選自軟膏、糊膏、霜膏、 止血貼、止血紗布、止血微球。
【文檔編號(hào)】A61K9/06GK104208096SQ201310222368
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月4日
【發(fā)明者】范杰, 李云龍, 廖曉峰, 尚小強(qiáng), 陳昊 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)