人ilk基因治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了單獨的人ILK基因；以及人ILK基因與人EGFR基因作為協(xié)同施藥靶標(biāo)，在制備或篩選腫瘤治療藥物中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了ILK基因小干擾RNA、ILK基因干擾慢病毒載體、ILK基因干擾慢病毒，并公開了他們在與EGFR基因協(xié)同治療腫瘤中的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的慢病毒載體、慢病毒能夠特異性抑制人ILK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，本發(fā)明的ILK基因干擾慢病毒能單獨、或者與EGFR基因干擾慢病毒協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
【專利說明】人ILK基因治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及單獨的人ILK基因；以及人ILK基因和人 EGFR基因協(xié)同治療腫瘤的用途及其相關(guān)藥物。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前腫瘤的基因治療已經(jīng)取得了蓬勃快速的發(fā)展，但是迄今為止，仍然存在很多 需要解決的問題。目前用于腫瘤基因治療的基因太少，能抑制腫瘤生長的基因為數(shù)不多，急 需提供更多可利用的基因。另外，由于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程是一個多基因參與、涉 及多條信號通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此單個基因治療或單一治療方法往往療效有限。因此， 未來基因治療發(fā)展的重點將在于挖掘并鑒定在臨床上有重要價值的基因，探索多個具有不 同抗腫瘤作用機理的基因聯(lián)合治療以及將多基因靶向藥物聯(lián)合治療等。
[0003] 整合素連接激酶（integrin-linked kinase, ILK)是一種相對分子質(zhì)量為 59X 103、非受體的Ser/Thr蛋白激酶，同細(xì)胞中多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)（Duxbury MS，Ito Hj Benoit Ej et al. RNA interference demonstrates a novel role for integrin-1 inked kinase as a determinant of pancreatic adenocarcinoma cell gemcitabine chemoresistance. Clin Cancer Res. 2005Mayl; 11 (9) : 3433-8. )?有研究表明：ILK 具 有介導(dǎo)整合素胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)的功能，它能偶聯(lián)整合素和生長因子受體，參與介導(dǎo)細(xì)胞 與基底膜的跨膜信號傳導(dǎo)，調(diào)控生長因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)、fct信號通路以及整合蛋白， 調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附。生長增殖、分化、黏著和侵襲及組織的纖維化等。體外實驗表明，ILK 與許多腫瘤的形成、凋亡、黏附、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（Persad S, Dedhar S. The role of integrin-linked kinase(ILK)in cancer progression. Cancer Metastasis Rev.2003Dec;22(4):375-84.)。
[0004] 表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor, EGFR) EGFR 是一種跨膜 蛋白質(zhì)，屬于ErbB受體家族成員，其配體（EGF、TGF-a等）與EGFR胞外段結(jié)合使之二聚 化，由此導(dǎo)致胞內(nèi)段酪氨酸激酶活化以及一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，血管 生成，轉(zhuǎn)移并抑制細(xì)胞凋亡(梁后杰，鄒嵐.EGFR靶向藥物治療晚期結(jié)直腸癌最新進(jìn)展.中 國處方藥2009; 84:58-61.)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。大量研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因在多種腫瘤組 織中過表達(dá)或異?；罨?，從而使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。EGFR已成為經(jīng)臨床 驗證的多種類型腫瘤的治療祀點（Ciardiello F, Tortora G. EGFR antagonists in cancer treatment. N Engl J Med2008;358:1160-1174. )〇
[0005] RNAi是利用雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，已成為研究 基因功能的一種新興的有效手段，并有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具（Izquierdo M.Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther. 2005; 12(3) :217-27.)。慢病毒（Ientivirus)載體是高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，主要用于 感染對常規(guī)方法轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞，如原代細(xì)胞等。慢病毒顆?？赏瑫r感染增殖和非增 殖的細(xì)胞，且感染比較穩(wěn)定、持久。運用慢病毒載體，可實現(xiàn)特定基因的高表達(dá)，也可以表 達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA (short hairpin RNA，shRNA)以 RNA 干擾（RNA interference，RNAi)方式 下調(diào)某基因的表達(dá)。本發(fā)明擬采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究ILK基因在與EGFR基因協(xié) 同抑制腫瘤細(xì)胞增殖中的功能，為惡性腫瘤的非手術(shù)臨床治療提供理論依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于公開了 ILK基因作為癌癥治療的靶標(biāo)，治療腫瘤的用途及其相 關(guān)藥物；以及將ILK基因和EGFR基因共同作為癌癥治療的靶標(biāo)，通過同時沉默ILK基因和 EGFR基因的表達(dá)，實現(xiàn)協(xié)同治療腫瘤的用途，及其腫瘤治療藥物。
[0007] 本發(fā)明以RNA干擾為手段，研究了單獨的ILK基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用，以 及，ILK基因與EGFR基因在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的協(xié)同作用，公開了一種抑制或降低腫瘤細(xì) 胞生長、增殖、分化和/或存活的方法，該方法包括：向腫瘤細(xì)胞施用一種能夠特異性抑制 ILK基因和/或EGFR基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯，或能夠特異性抑制ILK蛋白和/或EGFR蛋白表達(dá) 的活性的物質(zhì)，以此來抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、分化或存活。
[0008] 本發(fā)明第一方面，公開了分離的人ILK基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在 制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0009] 本發(fā)明中，所述人ILK基因作為針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備或篩選腫瘤 治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進(jìn)一步的，所述針對腫瘤細(xì)胞的作用祀標(biāo)為RNA干擾作 用靶標(biāo)。
[0010] 所述將分離的人ILK基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容：其 一，將人ILK基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物；其 二，將人ILK基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物。
[0011] 所述將ILK基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療 藥物具體是指：將ILK基因作為RNA干擾作用的靶標(biāo)，來研制針對腫瘤細(xì)胞的藥物或制劑， 從而提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ILK基因的表達(dá)水平。
[0012] 所述將ILK基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療 藥物具體是指：將ILK基因作為作用對象，對藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn) 人ILK基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的ILK基因小分子干擾RNA (SiRNA)即是以人ILK基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的 藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將ILK基因及其蛋白作為作用對象。
[0013] 所述將ILK基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將ILK基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項腫瘤 診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。
[0014] 所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制ILK基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制 ILK蛋白的表達(dá)或活性的分子，從而降低腫瘤細(xì)胞中ILK基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì) 胞的增殖、生長、分化和/或存活的目的。
[0015] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ILK基因的表達(dá)相關(guān)的任意一種腫瘤； 更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：肺癌或結(jié)腸癌。
[0016] 本發(fā)明第一方面，還公開了分離的人ILK基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤治 療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。
[0017] 本發(fā)明中，所述人ILK基因和人EGFR基因作為針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制 備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。進(jìn)一步的，所述針對腫瘤細(xì)胞的作用祀標(biāo) 為RNA干擾作用靶標(biāo)。
[0018] 所述將分離的人ILK基因和人EGFR基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方 面的內(nèi)容：其一，將人ILK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng) 用于制備腫瘤治療藥物；其二，將人ILK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞 的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物。
[0019] 所述將人ILK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用 于制備腫瘤治療藥物具體是指：將ILK基因和人EGFR基因共同作為RNA干擾作用的靶標(biāo)， 研制能同時針對兩種基因的腫瘤治療藥物或制劑，從而提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ILK基因和 人EGFR基因的表達(dá)水平；或者，將ILK基因和人EGFR基因分別作為RNA干擾作用的靶標(biāo)， 來研制分別針對兩種基因的腫瘤治療藥物，從而獲得能提高或降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)ILK基因和 人EGFR基因表達(dá)水平的腫瘤治療藥物或制劑。
[0020] 所述將人ILK基因和人EGFR基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用 于篩選腫瘤治療藥物具體是指：將人ILK基因和人EGFR基因同時作為作用對象，對藥物進(jìn) 行篩選，以找到可以分別影響(抑制或促進(jìn)）人ILK基因表達(dá)的藥物和影響(抑制或促進(jìn)）人 EGFR基因表達(dá)的藥物，然后作為腫瘤治療備選組合物藥物；或者找到可以同時影響(抑制 或促進(jìn)）人ILK基因和人EGFR基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如本發(fā)明所述的 ILK基因小分子干擾RNA( siRNA)、基因干擾核酸構(gòu)建體、慢病毒，以及EGFR基因小分子干擾 RNA (siRNA)、基因干擾核酸構(gòu)建體、慢病毒，均是以ILK基因和EGFR基因分別為作用對象 篩選獲得的；當(dāng)它們共同使用時，存在協(xié)同作用的效果，比單一一種物質(zhì)的使用效果更好； 可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。除此之外，諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將 人ILK基因和人EGFR基因及其蛋白作為作用對象。
[0021] 所述將人ILK基因和人EGFR基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將ILK基因表達(dá)產(chǎn) 物和人EGFR基因表達(dá)產(chǎn)物作為腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷試劑的制備。
[0022] 本發(fā)明的所述腫瘤治療藥物為能夠特異性抑制人ILK基因和/或人EGFR基因的 轉(zhuǎn)錄或翻譯，或能夠特異性抑制人ILK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)或活性的分子，從而 降低腫瘤細(xì)胞人ILK基因和/或人EGFR基因的表達(dá)水平，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、 分化、存活的目的。
[0023] 本發(fā)明制備或篩選的腫瘤治療藥物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂類、 小分子化學(xué)藥(例如抑制劑)、抗體藥、多肽、蛋白或干擾慢病毒。
[0024] 所述核酸分子包括但不限于：反義寡核苷酸、雙鏈RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸內(nèi) 切酶ΠΙ制備的小干擾RNA (esiRNA)或者短發(fā)夾RNA (shRNA)。
[0025] 所述腫瘤治療藥物的施用量為足夠降低人ILK基因和人EGFR基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯， 或者足夠降低人ILK蛋白和人EGFR蛋白的表達(dá)或活性的劑量。以使人ILK基因和人EGFR 基因的表達(dá)至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0026] 本發(fā)明中，當(dāng)人ILK基因和人EGFR基因作為協(xié)同施藥靶標(biāo)進(jìn)行腫瘤治療和藥物篩 選時，是通過RNA干擾的方法，以人ILK基因和EGFR基因作為RAN干擾的靶基因，降低這兩 個基因的表達(dá)水平。
[0027] 所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人ILK基因和人EGFR基因的表達(dá)相關(guān)的 任一種腫瘤；更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自：肺癌或結(jié)腸癌。
[0028] 采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法是通過單獨降低人ILK基因的表達(dá)水平 抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的，或者通過同時降低人ILK基因和人EGFR基因的表 達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療的目的。具體的，治療時，將能有效降低人ILK基因 表達(dá)水平的物質(zhì)；或者，將能有效降低人ILK基因和人EGFR基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患 者。
[0029] 本發(fā)明第二方面公開了一種降低腫瘤細(xì)胞中ILK基因表達(dá)的分離的核酸分子，所 述核酸分子包含：
[0030] b) ILK基因雙鏈RNA，所述ILK基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與ILK基因 雜交的核苷酸序列；或者
[0031] c) ILK基因 shRNA，所述ILK基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與ILK基因雜交 的核苷酸序列。
[0032] 較優(yōu)的，所述ILK基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互 補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與ILK基因的靶序列基本相同。
[0033] 較優(yōu)的，所述ILK基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈 片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述 正義鏈片段的序列與ILK基因的靶序列基本相同。
[0034] 更優(yōu)的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0035] 更優(yōu)的，所述ILK基因的靶序列，為SEQ ID NO: 1所示序列。
[0036] 所述ILK基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默ILK基因表達(dá)時，與所述siRNA 互補結(jié)合的mRNA片段所對應(yīng)的ILK基因中的片段。
[0037] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0038] 進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。
[0039] 最優(yōu)的，ILK基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示，具體為 5' -CGAAGCUCAACGAGAAUCA-3'。SEQ ID NO :9 所示的 ILK 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 1所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計的針對人ILK基因的小干擾RNA中的一條鏈，該第 一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源ILK基因表達(dá)的作用。
[0040] 最優(yōu)的，所述ILK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所不，具體為： 5, -gaCGAAGCUCAACGAGAAUCA CUCGAG UGAUUCUCGUUGAGCUUCGUC-3，。
[0041] 本發(fā)明第三方面，公開了一種ILK基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼前述分離的核 酸分子中的ILK基因 shRNA的基因片段，能表達(dá)所述ILK基因 shRNA。
[0042] 更優(yōu)的，所述ILK基因干擾核酸構(gòu)建體為ILK基因干擾慢病毒載體。
[0043] 所述ILK基因干擾慢病毒載體是將編碼前述ILK基因 shRNA的DNA片段克隆入已 知載體獲得，所述已知載體多為慢病毒載體，所述ILK基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝 成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄出所述shRNA，通過酶切加工等步驟， 最終獲得所述ILK基因小干擾RNA，用于特異性沉默ILK基因的表達(dá)。
[0044] 編碼所述ILK基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 1所示序列及其互 補序列。
[0045] 進(jìn)一步的，所述ILK基因干擾慢病毒載體還含有啟動子序列和/或編碼腫瘤細(xì) 胞中可被檢測的標(biāo)記物的核苷酸序列；較優(yōu)的，所述可被檢測的標(biāo)記物如綠色熒光蛋白 (GFP)0
[0046] 進(jìn)一步的，所述慢病毒載體可以選自：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.1-CMV-Ne。、 pLKO.1-Ne。、 pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任一。
[0047] 本發(fā)明第四方面，公開了一種ILK基因干擾慢病毒，由前述ILK基因干擾核酸構(gòu)建 體中的ILK基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
[0048] 本發(fā)明的慢病毒藥物可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生針對ILK基因的小分子干擾RNA，從 而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。該ILK基因干擾慢病毒可用于制備預(yù)防或治療腫瘤的藥物。
[0049] 本發(fā)明第五方面，公開了一種用于治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物，其有效物質(zhì) 含有前述降低腫瘤細(xì)胞中ILK基因表達(dá)的分離的核酸分子、ILK基因干擾核酸構(gòu)建體、ILK 基因干擾慢病毒中的至少一種。
[0050] 較優(yōu)的，所述治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物，其有效成分還包括降低腫瘤細(xì)胞 中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子、EGFR基因干擾核酸構(gòu)建體、以及EGFR基因干擾慢病 毒中的至少一種。
[0051] 更優(yōu)的，所述ILK基因干擾核酸構(gòu)建體為ILK基因干擾慢病毒載體。
[0052] 進(jìn)一步的，所述降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子為：
[0053] I) EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR 基因雜交的核苷酸序列；或者
[0054] 2) EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列。
[0055] 優(yōu)選的，所述EGFR基因雙鏈RNA包含第一鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈 互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0056] 優(yōu)選的，所述EGFR基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義 鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所 述正義鏈片段的序列與EGFR基因的靶序列基本相同。
[0057] 更優(yōu)選的，所述shRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列可選自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、 UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0058] 更優(yōu)選的，所述EGFR基因的靶序列，為SEQ ID NO: 2所示序列。
[0059] 所述EGFR基因的靶序列即為siRNA用于特異性沉默EGFR基因表達(dá)時，與所述 siRNA互補結(jié)合的mRNA片段所對應(yīng)的EGFR基因中的片段。
[0060] 所述雙鏈RNA第一鏈和第二鏈的長度均為15-27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
[0061] 進(jìn)一步的，所述雙鏈RNA為小干擾RNA (siRNA)。
[0062] 最優(yōu)選的，EGFR基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :10所示，具體為 5' -GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3'。SEQ ID NO :10 所示的 EGFR 基因 siRNA 的第一鏈為以 SEQ ID NO: 2所示的序列為RNA干擾靶序列設(shè)計的針對人EGFR基因的小干擾RNA中的一條鏈， 該第一鏈與第二鏈組成的siRNA能夠起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源EGFR基因表達(dá)的作 用。
[0063] 最優(yōu)選的，所述EGFR基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 12所示，具體為： 5, -GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3，。
[0064] 當(dāng)用作治療腫瘤的藥物時，是將安全有效量的雙鏈RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺 乳動物。具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之 內(nèi)的。
[0065] 較優(yōu)的，所述EGFR基因干擾核酸構(gòu)建體為含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表達(dá)所述EGFR基因 shRNA。
[0066] 更優(yōu)的，所述EGFR基因干擾核酸構(gòu)建體為EGFR基因干擾慢病毒載體。
[0067] 優(yōu)選的，所述EGFR基因干擾慢病毒由EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì) 粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
[0068] 更優(yōu)的，所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編碼前述分EGFR基因 shRNA的基因 片段，能表達(dá)所述EGFR基因 shRNA。
[0069] 編碼所述EGFR基因 shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO: 2所示序列及其 互補序列。
[0070] 本發(fā)明的藥物組合物中，特異性沉默ILK基因表達(dá)，以及特異性沉默EGFR基因表 達(dá)的有效成分發(fā)揮了協(xié)同治療的作用；本發(fā)明實施例記載，雙基因敲減后的癌細(xì)胞生長抑 制率明顯大于單基因敲減組的加和，表明特異性沉默ILK基因表達(dá)的物質(zhì)與特異性沉默 EGFR基因表達(dá)的物質(zhì)協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0071] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述藥物或藥物組合物含有1?99wt%所述小干擾RNA、shRNA、 基因干擾核酸構(gòu)建體和/或基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
[0072] 制備藥物時，通常將有效成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或 藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為 賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅 菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶 纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水等。制劑還可包括：濕潤劑、乳化劑、防腐劑（如羥基苯 甲酸甲酯和丙酯）、甜味劑等。
[0073] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的siRNA或者包含該小干擾RNA序列的核酸構(gòu) 建體、慢病毒能夠特異性抑制人ILK基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能單獨，或者與EGFR靶向 慢病毒協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。本發(fā)明 中的ILK基因即可以作為單獨的腫瘤治療靶標(biāo)，也可以作為EGFR基因協(xié)同治療靶標(biāo)，在腫 瘤治療中具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0074] 圖 I :GV115 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0075] 圖 2 :GV113 質(zhì)粒 DNA 圖譜
[0076] 圖3 :ILK shRNA質(zhì)粒鑒定圖
[0077] 1# :陰性對照（ddH20) ;2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0078] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0079] 4# ?8# :ILK shRNAl-5 號轉(zhuǎn)化子鑒定
[0080] 圖4 :EGFR shRNA質(zhì)粒鑒定圖
[0081] 1# :陰性對照（ddH20)
[0082] 2# :陰性對照（空載自連對照組）
[0083] 3# :Marker 自上而下依次為 5kb，3kb，2kb，I. 5kb，lKb，750bp，500bp，250bp，IOObp
[0084] 4# ?8# :EGFR shRNAl-5 號轉(zhuǎn)化子鑒定
[0085] 圖5 :表示ILK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時浸染人肺癌H1299細(xì)胞5 天后，顯著抑制細(xì)胞增殖
[0086] 圖6 :表示ILK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同時浸染人結(jié)腸癌RKO細(xì)胞5 天后，顯著抑制細(xì)胞增殖

【具體實施方式】
[0087] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制 本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條 件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京：科學(xué)出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。
[0088] 實施例1針對人ILK基因和EGFR基因 RNAi慢病毒的制備
[0089] 1.構(gòu)建慢病毒載體
[0090] 1)構(gòu)建針對人ILK基因和EGFR基因的慢病毒載體
[0091] 從Genbank調(diào)取ILK(NM_004517)和EGFR基因（NM_201282)信息；利用上海吉凱基 因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計軟件Genechem設(shè)計針對ILK基因和EGFR基因的有效的siRNA 靶點。初步篩選得到具有明顯抑制ILK基因表達(dá)功能的siRNA靶點序列（SEQ ID N0.1)和 明顯抑制EGFR基因表達(dá)功能的siRNA靶點序列（SEQ ID NO. 2)。通過Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 BLAST分析，確定其不對任何其它基因產(chǎn)生干擾作用。
[0092] 表IsiRNA靶點序列

【權(quán)利要求】
1. 分離的人ILK基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用 途。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述人ILK基因作為針對腫瘤細(xì)胞的作用靶 標(biāo)應(yīng)用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者制備腫瘤診斷藥物。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)為RNA干擾作 用靶標(biāo)。
4. 分離的人ILK基因和人EGFR基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷 藥物中的用途。
5. -種降低腫瘤細(xì)胞中ILK基因表達(dá)的分離的核酸分子，所述核酸分子包含： a) ILK基因雙鏈RNA，所述ILK基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與ILK基因雜交 的核苷酸序列；或者 b) ILK基因 shRNA，所述ILK基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與ILK基因雜交的核 苷酸序列。
6. 如權(quán)利要求5所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述ILK基因雙鏈RNA包含第一 鏈和第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈互補共同形成RNA二聚體，并且所述第一鏈的序列 與ILK基因的靶序列基本相同；所述ILK基因 shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連 接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互 補，并且所述正義鏈片段的序列與ILK基因的靶序列基本相同。
7. 如權(quán)利要求6所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述ILK基因的靶序列為SEQ ID NO: 1所示序列。
8. 如權(quán)利要求5-7任一權(quán)利要求所述的分離的核酸分子，其特征在于，所述雙鏈RNA 為小干擾RNA，并且ILK基因小干擾RNA第一鏈的序列如SEQ ID NO :9所示；所述ILK基因 shRNA的序列如SEQ ID NO: 11所示。
9. 一種ILK基因干擾核酸構(gòu)建體，含有編碼權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要求所述分離的核 酸分子中的ILK基因 shRNA的基因片段，能表達(dá)所述ILK基因 shRNA。
10. 如權(quán)利要求9所述的核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述ILK基因干擾核酸構(gòu)建體為 ILK基因干擾慢病毒載體。
11. 一種ILK基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求10所述ILK基因干擾核酸構(gòu)建體中的ILK 基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
12. -種治療肺癌或結(jié)腸癌的藥物組合物，其有效成分含有權(quán)利要求5-8任一權(quán)利要 求所述降低腫瘤細(xì)胞中ILK基因表達(dá)的分離的核酸分子、權(quán)利要求9-10任一權(quán)利要求所述 ILK基因干擾核酸構(gòu)建體、以及權(quán)利要求11所述ILK基因干擾慢病毒中的至少一種。
13. 如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物的有效成分還包 括降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表達(dá)的分離的核酸分子、EGFR基因干擾核酸構(gòu)建體、以及EGFR 基因干擾慢病毒中的至少一種。
14. 如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于，所述降低腫瘤細(xì)胞中EGFR基因表 達(dá)的分尚的核酸分子為： 1. EGFR基因雙鏈RNA，所述EGFR基因雙鏈RNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因 雜交的核苷酸序列；或者 2. EGFR基因 shRNA，所述EGFR基因 shRNA中含有能夠在嚴(yán)緊條件下與EGFR基因雜交 的核苷酸序列； 所述EGFR基因干擾核酸構(gòu)建體為含有編碼前述EGFR基因 shRNA的基因片段，能表達(dá) 所述EGFR基因 shRNA ; 所述EGFR基因干擾慢病毒由EGFR基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系 的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成；所述EGFR基因干擾慢病毒載體含有編碼前述分EGFR基因 shRNA的基因片段，能表達(dá)所述EGFR基因 shRNA。
【文檔編號】A61P35/00GK104225619SQ201310232216
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月9日
【發(fā)明者】朱向瑩, 孫琴, 楊敏, 沈浩, 金楊晟, 瞿紅花, 曹躍瓊 申請人:上海金鑒生物科技有限公司