動(dòng)物用的脂肪組織衍生干細(xì)胞的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及動(dòng)物用的脂肪組織衍生干細(xì)胞。本發(fā)明提供用于制造和使用脂肪衍生干細(xì)胞來(lái)治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的各種醫(yī)學(xué)病狀的組合物和方法。特定來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供可用于在非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中修復(fù)骨折和治療“干眼”病狀、急性腎衰竭和慢性腎衰竭的方法和組合物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】動(dòng)物用的脂肪組織衍生干細(xì)胞
[0001]相關(guān)申請(qǐng)案的交叉參考
[0002]本申請(qǐng)案是2011年2月14日申請(qǐng)的美國(guó)申請(qǐng)案12/997，067的部分延續(xù)案，所述美國(guó)申請(qǐng)案是2009年6月8日申請(qǐng)的國(guó)際申請(qǐng)案第PCT/US2009/046587號(hào)的國(guó)家階段，所述國(guó)際申請(qǐng)案根據(jù)35U.S.C.§ 119(e)主張2008年6月11日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/060, 701號(hào)和2009年4月9日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/168，148號(hào)的權(quán)益，所述每一專(zhuān)利的內(nèi)容都是全文以引用方式并入本文中。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本發(fā)明提供用于制造和使用脂肪衍生干細(xì)胞來(lái)治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的各種醫(yī)學(xué)病狀的組合物和方法，所述醫(yī)學(xué)病狀包括骨折、“干眼病狀”、慢性腎衰竭和急性腎衰竭。
【背景技術(shù)】
[0004]脂肪組織含有已從其分離出多潛能細(xì)胞的基質(zhì)血管成份(SVF)。這些細(xì)胞有多種名稱(chēng):經(jīng)加工脂肪抽吸物(PLA)細(xì)胞、脂肪組織衍生間葉干細(xì)胞、多潛能脂肪衍生干(MADS)細(xì)胞、脂肪組織衍生干細(xì)胞、脂肪組織衍生基質(zhì)細(xì)胞(ADSC、ATSC)、脂肪組織衍生成人干(ADAS)細(xì)胞、脂肪組織衍生成人基質(zhì)(ADAS)細(xì)胞和脂肪組織衍生細(xì)胞(ADC)。
[0005]ADSC具有與骨髓干細(xì)胞(BMSC)類(lèi)似的表型和基因表達(dá)譜。除了能自我更新和長(zhǎng)期生長(zhǎng)以外，ADSC還能分化成不同細(xì)胞類(lèi)型，包括脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)元和上皮細(xì)胞。因此，ADSC不僅逐漸被公認(rèn)為真正的成人干細(xì)胞，且對(duì)于未來(lái)的臨床應(yīng)用來(lái)說(shuō)還被認(rèn)為優(yōu)于其它類(lèi)型的成人干細(xì)胞。骨髓因供區(qū)發(fā)病而僅可以有效數(shù)量獲得，而脂肪組織通?？纱罅揩@得，尤其是在這個(gè)肥胖者越來(lái)越多的社會(huì)中。另外，無(wú)性系研究已確認(rèn)，骨髓中的BMSC數(shù)目為約25，000分之一到100，000分之一，而在經(jīng)加工脂肪抽吸物中ADSC的平均頻率是有核細(xì)胞的約2%。因此，Ig脂肪的ADSC產(chǎn)率為約5000個(gè)細(xì)胞，而B(niǎo)MSC產(chǎn)率為每毫升骨髓100-1000個(gè)細(xì)胞。
[0006]先前人們已嘗試將ADSC用于治療目的。例如，參見(jiàn)W02005/035742。然而，這些嘗試主要集中于ADSC在動(dòng)物環(huán)境中的自體使用。對(duì)于動(dòng)物診所，自體治療計(jì)劃對(duì)于獸醫(yī)和寵物主人二者來(lái)說(shuō)都耗時(shí)過(guò)久。業(yè)內(nèi)需要用于以有效且不引起所移植細(xì)胞排斥的方式治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(例如寵物和農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物)的組合物和方法。本文所述的本發(fā)明提供這些優(yōu)勢(shì)且還提供其它益處。
[0007]本文中所揭示的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)案、參考文獻(xiàn)和其它出版物都是全文以引用方式并入本文中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供用于制造和使用脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)的組合物和方法。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的各種醫(yī)學(xué)病狀的方法。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的尿失禁的方法，所述方法包含向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與有效量的脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)。非人類(lèi)哺乳動(dòng)物也可具有繼發(fā)癥狀，其中所述繼發(fā)癥狀為膀胱感染或尿液灼傷或膀胱感染和尿液灼傷二者。
[0009]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的炎性疾病的方法，所述方法包含向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與有效量的脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)。在一個(gè)實(shí)施例中，所述炎性疾病為關(guān)節(jié)炎。在另一個(gè)實(shí)施例中，所述關(guān)節(jié)炎為骨關(guān)節(jié)炎。
[0010]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供減輕有需要的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的疼痛的方法，所述方法包含向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與有效量的脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)。
[0011]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療有需要的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的糖尿病的方法，所述方法包含向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與有效量的脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)。
[0012]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療有需要的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的醫(yī)學(xué)病狀的方法，所述方法包含向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與有效量的脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)，其中所述醫(yī)學(xué)病狀為一種或一種以上選自由以下組成的群組的病狀:尿失禁、骨關(guān)節(jié)炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、傷口愈合、結(jié)瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴(kuò)張型心肌病、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全、股骨頭無(wú)血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)梗塞、關(guān)節(jié)炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良、骨折、“干眼”病狀、慢性腎衰竭和急性腎衰竭。
[0013]本發(fā)明提供對(duì)上述任一個(gè)方面的方法中所論述病狀的治療或緩解，其中ADSC對(duì)于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)是異種的。在一個(gè)方面中，所述治療為異種移植，且因ADSC治療所致的排斥或炎癥極弱。在上述任一方法中和本文中，非人類(lèi)哺乳動(dòng)物可為以下非限制性實(shí)例中的任一者:狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹和美洲駝。
[0014]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療醫(yī)學(xué)病狀的非人類(lèi)ADSC庫(kù)，其中所述ADSC對(duì)于ADSC的接受者來(lái)說(shuō)是異種的，且其中所述醫(yī)學(xué)病狀為一種或一種以上選自由以下組成的群組的病狀:尿失禁、骨關(guān)節(jié)炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、傷口愈合、結(jié)瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴(kuò)張型心肌病、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全、股骨頭無(wú)血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)梗塞、關(guān)節(jié)炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良、骨折、“干眼”病狀、慢性腎衰竭和急性腎衰竭。
[0015]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于治療醫(yī)學(xué)病狀的非人類(lèi)ADSC庫(kù)，其中所述ADSC對(duì)于ADSC的接受者來(lái)說(shuō)是同種的，且其中所述醫(yī)學(xué)病狀為一種或一種以上選自由以下組成的群組的病狀:尿失禁、骨關(guān)節(jié)炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、傷口愈合、結(jié)瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴(kuò)張型心肌病、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全、股骨頭無(wú)血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)梗塞、關(guān)節(jié)炎、肌營(yíng)養(yǎng)不良、骨折、“干眼”病狀、慢性腎衰竭和急性腎衰竭。任選地，以上任一 ADSC庫(kù)可包含羧甲基纖維素(CMC)。
[0016]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供組合物，其包含用于移植的經(jīng)純化非人類(lèi)ADSC群和CMC。在一個(gè)方面中，移植為異種移植，其中所述異種移植不會(huì)造成對(duì)組合物的任何顯著排斥。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1繪示關(guān)于生成產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用GFP(對(duì)照)、Pdxl或Pdx1-PV-16 (PV-16)轉(zhuǎn)導(dǎo)人類(lèi)ADSC。相差顯微術(shù)顯示，經(jīng)Pdxl和PV-16轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)和培養(yǎng)基中具有胰島素樣顆粒。免疫熒光顯微術(shù)顯示，經(jīng)Pdxl和PV-16轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的胰島素染色呈陽(yáng)性。使用DAPI核染色來(lái)定位細(xì)胞。
[0018]圖2繪示驗(yàn)證Pdxl和胰島素表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用GFP(對(duì)照)、Pdxl或Pdx 1-PV-16 (PV-16)轉(zhuǎn)導(dǎo)人類(lèi)和大鼠ADSC。通過(guò)西方墨點(diǎn)(western blotting,以β-肌動(dòng)蛋白充當(dāng)對(duì)照，圖Α)和RT-PCR(圖B)檢查Pdxl在這些細(xì)胞中的表達(dá)。通過(guò)ELISA進(jìn)一步檢查人類(lèi)ADSC的靜態(tài)胰島素產(chǎn)生(在具有23mM葡萄糖的DMEM中，圖C)。
[0019]圖3繪示檢查胰腺基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。人類(lèi)和大鼠ADSC未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)(C)或經(jīng)GFP或Pdxl轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過(guò)RT-PCR檢查這些細(xì)胞和大鼠尿道平滑肌細(xì)胞(RUSMC)中Pdxl、胰島素、胰高血糖素和NeuroD的表達(dá)(以b_肌動(dòng)蛋白充當(dāng)對(duì)照，圖A)。人類(lèi)和大鼠細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果分別展示于圖B(n=3)和圖C(n=5)中。星號(hào)指示Pdxl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞與未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞之間有顯著差異(P〈0.05)。
[0020]圖4繪示關(guān)于響應(yīng)葡萄糖濃度產(chǎn)生胰島素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在含有所示濃度的葡萄糖的緩沖液中培育Pdxl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。I小時(shí)后，通過(guò)ELISA評(píng)價(jià)緩沖液中胰島素的量。星號(hào)指示與OmM葡萄糖下的胰島素產(chǎn)生相比有顯著差異(P〈0.05)。
[0021]圖5顯示血糖水平(圖A)和體重(圖B)的變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將30只大鼠隨機(jī)等分成3組。第一組(對(duì)照)接受腹膜內(nèi)注射的20mM檸檬酸鹽緩沖液。第二組和第三組二者接受腹膜內(nèi)注射的60mg STZ (存于20mM檸檬酸鹽緩沖液中)/千克體重。I周后，第二組(鹽水)接受鹽水治療，而第三組(IPADSC)接受IPADSC治療。每周監(jiān)測(cè)所有大鼠的體重和禁食血糖水平。星號(hào)指示IPADSC治療與鹽水治療大鼠之間有顯著差異(P〈0.05)。
[0022]圖6繪示大鼠的毛皮外觀和白內(nèi)障程度的變化。
[0023]圖7顯示關(guān)于葡萄糖耐量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在治療后第7周結(jié)束時(shí)，禁食7小時(shí)的大鼠接受腹膜內(nèi)注射的Img葡萄糖/克體重。然后經(jīng)2小時(shí)以30分鐘間隔監(jiān)測(cè)從尾部靜脈獲得的樣品中的血糖水平。星號(hào)指示IPADSC治療與鹽水治療大鼠之間有顯著差異(P〈0.05)。
[0024]圖8顯示移植細(xì)胞的識(shí)別。在治療后第7周結(jié)束時(shí)，將大鼠處死并采集其腎用于組織學(xué)檢查。使用HE染色檢查囊下空間中移植細(xì)胞的存在。使用免疫熒光(IF)染色識(shí)別表達(dá)胰島素的細(xì)胞。20X照片中加方框的區(qū)域是注射部位并在各別100X照片中放大。100X照片中加方框的區(qū)域在各別400X照片中進(jìn)一步放大。注意IPADSC治療腎的囊下空間中的組織樣結(jié)構(gòu)。在鹽水治療腎中未見(jiàn)到所述結(jié)構(gòu)。IF照片取自3個(gè)IPADSC治療腎。注意胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的存在。
[0025]圖9繪示劑量效應(yīng)。將EdU以O(shè)、10、20和50 μ M添加到ADSC0通過(guò)核的DAPI染色(如果使用彩色照片，則其將為藍(lán)色)來(lái)識(shí)別細(xì)胞定位。通過(guò)阿列克薩594(Alexa594)來(lái)檢測(cè)EdU(如果使用彩色照片，則其將為紅色)。結(jié)果顯示，約50%的細(xì)胞經(jīng)EdU標(biāo)記(A，X 200)，不管 EdU 濃度如何(B, Ρ>0.05)。
[0026]圖10顯示時(shí)程研究的結(jié)果。用10 μ M EdU標(biāo)記ADSC，且然后在I天、4天、7天、14天和21天時(shí)拆分。結(jié)果顯示，陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞中的EdU信號(hào)隨時(shí)間而減小(Α，X 100 ；Β,Ρ〈0.01)。較高放大率(1000Χ)的第21天細(xì)胞顯示于圖C中。
[0027]圖11顯示通過(guò)在組織陣列中使用EdU活體內(nèi)標(biāo)記DNA的結(jié)果。向新生大鼠腹膜內(nèi)注射50yg存于PBS中的EdU/g體重。7h后采集主要組織用于制備組織陣列(表3)，然后對(duì)其進(jìn)行HE染色(A)或EdU染色⑶。EdU染色的組織陣列以20 X放大率顯示于圖C中。EdU標(biāo)記的皮膚試樣(圖C的6A)以200X放大率顯示于圖D中。通過(guò)核的DAPI染色(如果使用彩色照片，則其將為藍(lán)色)來(lái)識(shí)別細(xì)胞定位。通過(guò)阿列克薩594檢測(cè)EdU(如果使用彩色照片，則其將為紅色)。
[0028]圖12顯示追蹤所移植ADSC的結(jié)果。利用10 μ M EdU將大鼠ADSC標(biāo)記12小時(shí)，且然后自體注射到膀胱頸中(Α)。在4周后，通過(guò)對(duì)EdU(如果使用彩色照片，則其將為紅色)、α -平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA，如果使用彩色照片，則其將為綠色)和核(如果使用彩色照片，則其將為藍(lán)色)的染色來(lái)檢查組織切片。可在膀胱頸中觀察到EdU標(biāo)記細(xì)胞(B，X 20)。大部分EdU標(biāo)記細(xì)胞定位于結(jié)締組織中。少數(shù)EdU標(biāo)記細(xì)胞似乎已分化成平滑肌細(xì)胞(C，X 200)。
[0029]圖13顯示關(guān)于ADSC治療動(dòng)物中的較高排尿壓力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0030]圖14顯示EdU和SMA的共定位的結(jié)果。如果觀察彩色影像，則紅色信號(hào)為EdU，綠色信號(hào)為ASMA，且藍(lán)色信號(hào)為DAPI。上圖中每一圖像中的加方框區(qū)域都顯示于下圖中的相應(yīng)圖像中(X400)。
[0031]圖15繪示尿道中的彈性纖維。左圖:對(duì)照。右圖:已移植ADSC(X400)。
[0032]圖16顯示關(guān)于ADSC治療動(dòng)物中的較高排尿壓力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033]圖17顯示關(guān)于EdU和SMA的共定位的實(shí)驗(yàn)。如果觀察彩色影像，則紅色信號(hào)為EdU，綠色信號(hào)為ASMA，且藍(lán)色信號(hào)為DAPI。(a~c)定位于粘膜下層中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞。(d~h)定位于肌肉中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞(X200)。(A)粘膜下層中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞(X400)。(B)肌肉中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞(X400)。
[0034]圖18顯示關(guān)于ADSC在陰莖中的內(nèi)皮分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。用BrdU標(biāo)記ADSC并注射到大鼠的海綿體中。在4周后，通過(guò)免疫熒光顯微術(shù)檢查組織?？笲rdU和RECA-1抗體分別識(shí)別所注射的ADSC(如果使用彩色照片，則其將為綠色)和內(nèi)皮細(xì)胞(如果使用彩色照片，則其將為紅色)。重疊影像(BrdU/RECA)顯示，一些ADSC(如果使用彩色照片，則其將為黃色)的RECA-1染色也呈陽(yáng)性。另一使用相差影像的重疊影像(合并)顯示ADSC定位到竇內(nèi)皮。約5%的BrdU+細(xì)胞為RECA+，如通過(guò)計(jì)數(shù)剖面中10個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域來(lái)測(cè)定。
[0035]圖19顯示DMEM和EGM2中的細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)速率的比較。將兩個(gè)大鼠ADSC系RADSC-1和RADSC-2以相同密度(300，000個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿)接種到IOOmm培養(yǎng)皿中并在DMEM或EGM2中生長(zhǎng)3天。RADSC-1的細(xì)胞形態(tài)顯示于圖A中。兩個(gè)細(xì)胞系的生長(zhǎng)速率顯示于圖B中。
[0036]圖20顯示識(shí)別在EGM2中生長(zhǎng)的細(xì)胞中的內(nèi)皮標(biāo)記的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使RADSC-1和RADSC-2在DMEM(未經(jīng)誘導(dǎo))或EGM2 (經(jīng)誘導(dǎo))中生長(zhǎng)。然后針對(duì)內(nèi)皮標(biāo)記CD31、vffF和eNOS對(duì)其染色。如果觀察彩色影像，則綠色指示⑶31、vWF或eNOS的表達(dá)；藍(lán)色指示細(xì)胞核。初始放大率為200X。還分析細(xì)胞的基質(zhì)膠管形成(管)和LDL攝取。紅色指示LDL的存在，其呈與紅色熒光染料DiI偶聯(lián)的形式。兩個(gè)細(xì)胞系的結(jié)果類(lèi)似；僅顯示RADSC-1的結(jié)果。人類(lèi)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)充當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0037]圖21顯示一些圖解說(shuō)明內(nèi)皮分化的可逆性和可再誘導(dǎo)性的結(jié)果。使RADSC-1和RADSC-2在DMEM中生長(zhǎng)6天到10天 (第一輪DMEM);分析一半細(xì)胞的內(nèi)皮標(biāo)記。將另一半細(xì)胞轉(zhuǎn)換到EGM2，生長(zhǎng)6天(第一輪EGM2)，且分析一半細(xì)胞的內(nèi)皮標(biāo)記。將另一半細(xì)胞轉(zhuǎn)換到DMEM，生長(zhǎng)10天(第二輪DMEM)，且分析一半細(xì)胞的內(nèi)皮標(biāo)記。最后，將另一半細(xì)胞轉(zhuǎn)換到EGM2，生長(zhǎng)6天(第二輪EGM2)，且分析內(nèi)皮標(biāo)記。兩個(gè)細(xì)胞系的結(jié)果類(lèi)似；僅顯示RADSC-1的結(jié)果。如果觀察彩色影像，則綠色指示⑶31、vWF或eNOS的表達(dá)；且藍(lán)色指示細(xì)胞核。初始放大率為200X。紅色指示LDL的存在，其呈與紅色熒光染料DiI偶聯(lián)的形式。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0038]圖22顯示關(guān)于通過(guò)“減法”識(shí)別內(nèi)皮誘導(dǎo)因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使RADSC-1細(xì)胞在完全或部分補(bǔ)充的EGM2中生長(zhǎng)且然后分析LDL攝取。通過(guò)所省略因子來(lái)指示每一部分補(bǔ)充的EGM2 ;例如，“-FGF”表示無(wú)FGF2的EGM2。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0039]圖23顯示關(guān)于通過(guò)“加法”識(shí)別內(nèi)皮誘導(dǎo)因子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使RADSC-1細(xì)胞在EGM2、EBM2或補(bǔ)充有所示因子的EBM2中生長(zhǎng)，且然后分析LDL攝取。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0040]圖24顯示關(guān)于FGF2誘導(dǎo)內(nèi)皮標(biāo)記表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使RADSC-1細(xì)胞在DMEM、EGM2或補(bǔ)充有FGF2和維生素C的EBM2中生長(zhǎng)。然后針對(duì)內(nèi)皮標(biāo)記CD31、vffF和eNOS對(duì)其染色。如果觀察彩色影像，則綠色指示⑶31、vWF或eNOS的表達(dá)；且藍(lán)色指示細(xì)胞核。初始放大率為200X。還分析細(xì)胞的基質(zhì)膠管形成(管)。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0041]圖25顯示關(guān)于FGFR抑制劑對(duì)內(nèi)皮分化的效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。使RADSC-1細(xì)胞在存在或不存在FGFR抑制劑HH73074的情形下EGM2或在補(bǔ)充有FGF2和維生素C的EBM2中生長(zhǎng)。然后分析細(xì)胞的LDL攝取。如果觀察彩色影像，則紅色指示LDL的存在，其呈與紅色熒光染料DiI偶聯(lián)的形式。由于已知HH73074對(duì)VEGF受體具有弱抑制作用，因此出于排除VEGF信號(hào)傳導(dǎo)的參與的目的，還使RADSC-1細(xì)胞在補(bǔ)充VEGF/維生素C的EBM2中生長(zhǎng)。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0042]圖26顯示用豬ADSC治療犬骨折的結(jié)果。圖A提供在移除5個(gè)螺釘中的2個(gè)后I周時(shí)犬的斷裂橈骨和尺骨的X射線(第O天)，所述螺釘已用于將動(dòng)力加壓板附接到斷裂橈骨。X射線已揭露，在所述板下的骨折部位處，橈骨發(fā)生嚴(yán)重脫鈣作用且變薄(骨質(zhì)減少)。在當(dāng)天(“第O天”)，以0.5mL的體積向所述板的內(nèi)側(cè)和外側(cè)皮下投與5 X IO6個(gè)豬ADSC，且向動(dòng)物經(jīng)靜脈內(nèi)投與另外I X IO6個(gè)豬ADSC。在投與豬ADSC后17天(圖B)和26天(圖C)進(jìn)行的后續(xù)X射線揭露，橈骨的脫鈣作用逆轉(zhuǎn)且骨折部位愈合。
【具體實(shí)施方式】
[0043]本發(fā)明提供用于治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的各種病狀和緩解非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的與各種病狀相關(guān)的不適和/或疼痛的組合物和方法。
[0044]除非另外定義，否則本文所用所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0045]如果此部分中所述的定義與以引用方式并入本文中的專(zhuān)利、已公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)案和其它公開(kāi)案中所述定義相反或者不一致，則以此部分中所述定義為準(zhǔn)，而不以以引用方式并入本文中的定義為準(zhǔn)。
[0046]1.一般技術(shù)
[0047]除非另外指示，否則本發(fā)明的實(shí)踐將利用干細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，所述技術(shù)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述技術(shù)全面解釋于文獻(xiàn)中，例如分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(MolecularCloning:A Laboratory Manual),第三版(薩姆布魯克(Sambrook)等人,2001)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press);寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(P.哈德維(P.Herdewi jn)編輯 ，2004);動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Animal Cell Culture) (R.1.弗拉施尼(R.1.Freshney))編輯，1987);酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)公司)；實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.韋爾(D.M.WeiiO和C.C.布萊克韋爾(C.C.Blackwell)編輯)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells) (J.M.米勒(J.M.Miller)和M.P.卡洛斯(M.P.Calos)編輯，1987);分子生物學(xué)的現(xiàn)行規(guī)范(Current Protocolsin Molecular Biology) (F.M.奧蘇貝爾(F.M.Ausubel)等人編輯，1987) ;PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR:The Polymerase Chain Reaction)(穆里斯(Mullis)等人編輯，1994)；免疫學(xué)現(xiàn)行規(guī)范(Current Protocols in Immunology) (J.E.科林根(J.Ε.Coligan)等人編輯，1991)精編分子生物學(xué)規(guī)范(Short Protocols in MolecularBiology)(威利父子公司(Wiley and Sons)，1999)，胚胎干細(xì)胞:實(shí)用方法(Embryonic Stem Cells:APractical Approach)(諾特里安尼(Notaranni)等人編輯，牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversity Press) 2006);干細(xì)胞生物學(xué)綱要(Essentials of Stem Cell Biology) (R.蘭扎(R.Lanza)編輯，愛(ài)思維爾學(xué)術(shù)出版社(Elsevier Academic Press) 2006);干細(xì)胞分析(分子生物學(xué)方法)(Stem Cell Assays (Methods in Molecular Biology))(莫翰 C.維姆利(Mohan C.Vemuri)編輯，胡馬納出版社(Humana Press);第一版(2007年8月10日)；間葉干細(xì)胞:方法和規(guī)范(分子生物學(xué)方法)(Mesenchymal Stem Cells:Methods andProtocols (Methods in Molecular Biology))(達(dá)爾文 J.普克夫(Darwin J.Prockop)、唐納德G.菲尼(Donald G.Phinney)、布魯斯A.邦內(nèi)爾(Bruce A.Bunnell)編輯，第一版(2008年3 月 7 日))；干細(xì)胞手冊(cè)(Handbook of Stem Cells)(羅伯特蘭扎(Robert Lanza)等人編輯，學(xué)術(shù)出版社(2004年9月14日)；干細(xì)胞培養(yǎng)(Stem Cell Culture)，第86卷:細(xì)胞生物學(xué)方法(Methods in Cell Biology)(杰尼P.馬瑟(Jennie P.Mather)編輯，學(xué)術(shù)出版社，第一版(2008年5月15日))；實(shí)用造血干細(xì)胞移植(Practical HematopoieticStem Cell Transplantation)(安德魯 J.坎特(Andrew J.Cant)等人編輯，威利-布萊克韋爾(Wiley-Blackwell)，第一版(2007 年 I 月 22 日));造血干細(xì)胞規(guī)范(HematopoieticStem Cell Protocols)(凱文D.邦廷(Kevin D.Bunting)編輯，胡馬納出版社，第2版(2008年I月31日));骨髓和干細(xì)胞移植(分子醫(yī)學(xué)方法)(Bone Marrow and Stem CellTransplantation (Methods in Molecular Medicine))(麥特貝克(Meral Beksac)編輯，胡馬納出版社；第一版(2007年5月3日))；用于心血管修復(fù)的干細(xì)胞療法和組織工程:從基石出石開(kāi)究到臨床應(yīng)用(Stem Cell Therapy and Tissue Engineeringfor CardiovascularRepair:From Basic Research to Clinical Applications)(納t匕勒迪布(Nabil Dib)等人編輯，施普林格(Springer)，第一版(2005年11月16日))；血液和骨髓干細(xì)胞移植:原理、實(shí)踐和護(hù)理見(jiàn)解(Blood And Marrow Stem Cell Transplantation:Principles，Practice，And Nursing Insights)(金施密特-波克尼(Kim Schmit-Pokorny)(作者)和蘇珊艾宗(Susan Ezzone)(編輯)，瓊斯與巴特利出版公司(Jones&Bartlett Publishers);第三版(2006 年 5 月 22 日))；造血干細(xì)胞規(guī)范(Hematopoietic Stem Cell Protocols)(克里斯多夫A.克魯格(Christopher A.Klug)和克雷格T.喬丹(Craig T.Jordan)編輯，胡馬納出版社；第一版(2001年12月15日))；和臨床骨髓和血液干細(xì)胞移植(Clinical BoneMarrow and Blood Stem Cell Transplantation)(凱瑞艾金森(Kerry Atkinson)等人編輯，劍橋大學(xué)出版社(Cambridge University Press);第三版(2003年12月8日))。
[0048]II.定義
[0049]“脂肪衍生干細(xì)胞”、“脂肪組織衍生干細(xì)胞”和ADSC在本文中可互換使用且是指源于脂肪組織且能自我更新的多潛能基質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞?！爸尽币庵溉我恢窘M織。脂肪組織可為褐色或白色脂肪組織，來(lái)源于皮下、網(wǎng)膜/內(nèi)臟、乳房、性腺或其它脂肪組織部位。優(yōu)選地，脂肪為皮下白色脂肪組織。所述細(xì)胞可包含原代細(xì)胞培養(yǎng)物或永生細(xì)胞系。脂肪組織可來(lái)自任一具有脂肪組織的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。脂肪組織可來(lái)源于待治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(即自體組織)或個(gè)體的無(wú)性系，或來(lái)源于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的不同物種(即異種)，或來(lái)源于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的相同物種但不是待治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(即同種)。這些細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面蛋白的獨(dú)特組合，其可包括(但不限于)干細(xì)胞標(biāo)記CD34和CD90、四跨膜蛋白CD9、CALLA (⑶10)、氨肽酶N(⑶13)、整合素I (⑶29)、透明質(zhì)酸受體(⑶44)、整合素.α.4和5(CD49d、CD49e)、ICAM-1 (CD54)、衰變加速因子(CD55)、互補(bǔ)保護(hù)素(CD59)、內(nèi)皮因子(CD105)、VCAM-1 (CD106)、Muc_l, 8 (CD146)和 ALCAM (CDl66)(格羅恩索斯(Gronthos)等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志(J.Cell Physiol.) (2001年)10月;189 (I): 5463)。在一個(gè)方面中，來(lái)源于豬的ADSC通常對(duì)于⑶90、⑶44、⑶29呈陽(yáng)性且通常對(duì)于⑶31、⑶45和⑶11呈陰性。例如，參見(jiàn)瓦琳娜(Valina)等人，歐洲心臟雜志(European Heart Journal) 28:2667-77 (2007),其揭示所培養(yǎng)的豬 ADSC 對(duì)于 CD90 (97.3+0.62%)、CD44(98.27+0.38%)和 CD29(98.2+0.87%)呈陽(yáng)性且對(duì)于 CD31 (0.03+0.05%)、CD45 (0.45+0.41%)和 CDll (0.17+0.17%)呈陰性。
[0050]本文所用術(shù)語(yǔ)多潛能(multipotent或pluripotent) ADSC的“制劑”或“經(jīng)純化制劑”是指含一種或一種以上細(xì)胞的制劑，其經(jīng)操作以提供實(shí)質(zhì)上不含其它組份的細(xì)胞制劑。在一些方面中，細(xì)胞制劑中以重量或數(shù)目計(jì)至少約60%不含產(chǎn)生細(xì)胞時(shí)存在的其它組份。在多個(gè)方面中，細(xì)胞以重量或數(shù)目計(jì)為至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少約99%純。經(jīng)純化細(xì)胞制劑可通過(guò)(例如)從天然來(lái)源純化(例如，提取)、熒光激活細(xì)胞分選或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它技術(shù)來(lái)獲得?？赏ㄟ^(guò)任一適當(dāng)方法(例如熒光激活細(xì)胞分選(FACS))或通過(guò)目測(cè)檢查來(lái)分析純度。
[0051]用于闡述干細(xì)胞的純度的“純度”并非是指組合物中僅存在干細(xì)胞，而是指示干細(xì)胞已經(jīng)操作以使得已將其從其天然組織環(huán)境中移除且指示其與所得群體中存在的其它細(xì)胞的關(guān)系。
[0052]本文所用術(shù)語(yǔ)“多潛能”(“multipotent”或“pluripotent”)是指ADSC分化成以下三個(gè)胚層的細(xì)胞的潛能:內(nèi)胚層(例如，內(nèi)部胃粘膜、胃腸道、肺)、中胚層(例如，肌肉、骨、血液、泌尿生殖器)或外胚層(例如，表皮組織和神經(jīng)系統(tǒng))。多潛能干細(xì)胞可產(chǎn)生任一胎兒或成人細(xì)胞類(lèi)型。其由于沒(méi)有促成胚外組織(例如，活體內(nèi)胎盤(pán)或活體外滋胚層)的潛能而無(wú)法單獨(dú)發(fā)育成胎兒或成人動(dòng)物。
[0053]“非人類(lèi)哺乳動(dòng)物”包括(但不限于)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物、寵物、非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、小鼠和大鼠。農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物可包括(但不限于)豬、牛、馬、山羊和綿羊。寵物包括(但不限于)狗、貓、兔和雪貂。此定義范圍內(nèi)的其它動(dòng)物包括(但不限于)猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹和美洲駝。非人類(lèi)哺乳動(dòng)物在本文中也可稱(chēng)為“個(gè)體”。
[0054]“治療”(“treatment”或“treating”)意指獲得有益或所需結(jié)果(包括臨床結(jié)果，包括動(dòng)物診所或醫(yī)院的結(jié)果)的方法。出于本發(fā)明的目的，有益或所需結(jié)果包括(但不限于)緩解與病狀相關(guān)的癥狀、降低與病狀相關(guān)的癥狀的程度、預(yù)防與病狀相關(guān)的癥狀?lèi)夯蜓舆t疾病或病狀發(fā)展。在一些方面中，用一種或一種以上本文所揭示細(xì)胞治療不伴隨任何副作用或伴隨的副作用少于與目前可用療法相關(guān)者。
[0055]“接受治療”包括初始治療和/或連續(xù)治療。本文所用“治療”是獲得有益或所需結(jié)果(優(yōu)選地包括來(lái)自動(dòng)物診所或醫(yī)院中的治療的臨床結(jié)果)的方法。出于本發(fā)明的目的，有益或所需臨床結(jié)果包括(但不限于)穩(wěn)定或改良罹患各種醫(yī)學(xué)病狀的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的健康相關(guān)生活質(zhì)量。
[0056]本文所用“延遲”疾病或病狀的發(fā)展意指推遲、阻礙、減緩、阻止、穩(wěn)定和/或擱延疾病或病狀的發(fā)展。根據(jù)疾病史和/或所治療的個(gè)體，此延遲的時(shí)間長(zhǎng)度有所不同。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所了解，足夠或顯著延遲實(shí)際上可由于個(gè)體未出現(xiàn)疾病或病狀而涵蓋預(yù)防。例如，在與不使用所述方法相比時(shí)，所述方法可降低給定時(shí)段內(nèi)發(fā)展疾病的概率和/或降低給定時(shí)段內(nèi)的疾病程度。在一些方面中，所述比較是基于使用統(tǒng)計(jì)顯著數(shù)目的個(gè)體的臨床研究。疾病發(fā)展可使用標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來(lái)檢測(cè)。發(fā)展也可是指起初可能無(wú)法檢測(cè)的疾病進(jìn)展且包括發(fā)生、復(fù)發(fā)和發(fā)作。
[0057]“減輕”疼痛(例如，與炎性疾病、例如一類(lèi)關(guān)節(jié)炎相關(guān)的疼痛)或一種或一種以上疼痛癥狀意指降低經(jīng)本發(fā)明ADSC組合物治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的疼痛的一種或一種以上不合意臨床表現(xiàn)的程度。
[0058]“有效量”(當(dāng)在治療或預(yù)防背景中或在減輕疼痛或緩解特定病狀的癥狀的背景中使用時(shí))是足以實(shí)現(xiàn)有益或所需結(jié)果(包括臨床結(jié)果)的量。有效量可以一次或一次以上投與來(lái)投與。出于本發(fā)明的目的，ADSC的有效量是細(xì)胞可減輕非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中所治療病狀的一種或一種以上癥狀的某一量。例如，已投與ADSC的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的跛行的減輕是非人類(lèi)動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎的一種癥狀，且觀察到此特定癥狀的此減輕可意味著已給予所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物有效量的ADSC。在一個(gè)方面中，進(jìn)一步培養(yǎng)ADSC以誘導(dǎo)其沿特定途徑分化。在另一個(gè)方面中，以不發(fā)生分化的方式培養(yǎng)ADSC。
[0059]本文所用“有需要的”包括患有病狀或疾病或“具有所述病狀或疾病的風(fēng)險(xiǎn)”的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。本文所用“具有風(fēng)險(xiǎn)”的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是具有發(fā)展病狀的風(fēng)險(xiǎn)的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物?！熬哂酗L(fēng)險(xiǎn)”的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物可能患有或可能未患有可檢測(cè)疾病或病狀，且可能在本文所述治療方法之前已顯示或可能未顯示可檢測(cè)疾病。“具有風(fēng)險(xiǎn)”表示，非人類(lèi)哺乳動(dòng)物具有一種或一種以上所謂風(fēng)險(xiǎn)因子，所述風(fēng)險(xiǎn)因子是與疾病或病狀的發(fā)展相關(guān)聯(lián)的可測(cè)量參數(shù)且為業(yè)內(nèi)已知。具有一種或一種以上所述風(fēng)險(xiǎn)因子的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物發(fā)展疾病或病狀的概率高于不具有所述風(fēng)險(xiǎn)因子的個(gè)體。所述風(fēng)險(xiǎn)因子包括(但不限于)年齡、性另|J、飲食、先前疾病史、前體疾病的存在、遺傳(即遺傳性(hereditary))因素、繁殖方案和因素以及環(huán)境暴露。
[0060]“醫(yī)藥上可接受的載劑”意指基于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)，在與活性成份組合時(shí)允許所述成份保持生物活性且并不引起不可接受的免疫反應(yīng)(例如，嚴(yán)重過(guò)敏或過(guò)敏性休克)的任一材料。實(shí)例包括(但不限于)任一標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥載劑，例如羧甲基纖維素(CMC)、磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳液(例如油/水乳液)和各種類(lèi)型的潤(rùn)濕劑。用于氣溶膠或非經(jīng)腸投與的實(shí)例性稀釋劑為磷酸鹽緩沖鹽水或生理鹽水(0.9%)。用于細(xì)胞輸注的實(shí)例性載劑為CMC。包含所述載劑的組合物是通過(guò)熟知的常規(guī)方法來(lái)調(diào)配(例如，參見(jiàn)雷明頓氏藥學(xué)科學(xué)(Remington’s Pharmaceutical Sciences),第 18 版，Α.根那羅(A.Gennaro)編輯，邁克出版(Mack Publishing)公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1990 ;和雷明頓，藥學(xué)科學(xué)與實(shí)踐(Remington, The Science and Practice of Pharmacy),第 20 版.邁克出版，2000,其各自是全文以引用方式并入本文中，特別關(guān)于調(diào)配物)。
[0061]一般在提及“組合物”(“the composition”或“compositions”)時(shí)包括且適用于本發(fā)明組合物。本發(fā)明還提供包含本文所述組份的醫(yī)藥組合物。
[0062]除非另外指明，否則本文所用單數(shù)形式“一(a、an)”和“所述”包括復(fù)數(shù)含義。例如，“一種” ADSC包括一種或一種以上脂肪組織衍生干細(xì)胞。
[0063]本文中在提及“關(guān)于”某值或參數(shù)時(shí)包括(且闡述)與所述值或參數(shù)本身有關(guān)的各方面。例如，提及“關(guān)于X”的闡述包括對(duì)“X”的闡述。
[0064]應(yīng)理解，本文中所述本發(fā)明的各個(gè)方面包括“包含”各個(gè)方面、“由其組成”和“基本上由其組成”。
[0065]II1.脂肪衍生干細(xì)胞(ADSC)和其分離
[0066]脂肪組織提供多潛能基質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源。脂肪組織在許多個(gè)體(例如，非人類(lèi)哺乳動(dòng)物)中可容易獲得且含量豐富。許多文獻(xiàn)中有記載，脂肪細(xì)胞是可補(bǔ)充細(xì)胞群。即使在通過(guò)抽脂或其它程序進(jìn)行手術(shù)移除后，個(gè)體中的脂肪細(xì)胞隨時(shí)間重現(xiàn)也很常見(jiàn)。這表明，月旨肪組織含有能自我更新的基質(zhì)干細(xì)胞。
[0067]先前已闡述用于人類(lèi)脂肪組織衍生干細(xì)胞的普通分離、擴(kuò)增和分化的方法(祖克(Zuk)等人，組織工程(Tissue Engineering) (2001)7:211-228 ;伯里斯(Burris)等人，分子內(nèi)分泌學(xué)(Mot Endocrinol) 1999, 13:4107 ;埃里克森(Erickson)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊(Biochemical & Biophysical ResearchCommunications) 2002, 290:7639 ;格羅恩索斯等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志2001年10月；189(1):5463 ;霍爾沃森(Halvorsen)等人，代謝(Metabolism) 2001, 50:407413 ；霍爾沃森等人，組織工程2001年12月；7(6):72941 ;哈普(Harp)等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊2001,281:907912 ;薩拉丁(Saladin)等人，1999細(xì)胞生長(zhǎng)與分化(Cell Growth & Diff) 10:4348 ;森(Sen)等人，細(xì)胞生物化學(xué)雜志(Journal ofCellular Biochemistry)2001, 81:312319 ；周(Zhou)等人，生物技術(shù)(BiotechnolTechniq) 1999，13:513517)。脂肪組織衍生干細(xì)胞是根據(jù)已知技術(shù)通過(guò)膠原酶消化和差速離心從切碎的人類(lèi)脂肪組織獲得(霍爾沃森等人，代謝2001，50:407413 ;霍內(nèi)(Hauner)等人，臨床研究雜志(J Clin Invest) 1989，84:16631670 ;羅德貝爾(Rodbell)等人，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem) 1966，241:130139)。這些技術(shù)同樣適用于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物脂肪組織衍生干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和分化。例如，參見(jiàn)弗杜希P.(Fotuhi P.)等人，歐洲心臟病學(xué)研究雜志(Europace)，9 (12): 1218-21 (2007);麥當(dāng)娜 R.(Madonna R.)等人,干細(xì)胞(Stem Cell), 26(1):202-11(2008);黃1\ (Huang T.)等人，脊髓醫(yī)學(xué)雜志(J SpinalCord Med), 30增刊.l:S35-40(2007);黑姆里希K.(Hemmrich K.)等人，外科研究雜志(J Surg Res.), 144(1):82-8(2008)』CQ(Qu CQ)等人，動(dòng)物體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)(InVitro Cell Dev Biol Anim.)，43 (2): 95-100 (2007) dK.H.(Wang K.H.)等人，生物技術(shù)應(yīng)用生物化學(xué)(Biotechnol.Appl.Biochem.) (2008);威廉姆斯 K.J.(Williams K.J.),細(xì)胞，組織，器官(Cells Tissues Organs)，(2008);和瓦琳娜C等人，歐洲心臟雜志，28(21):2667-77(2007)。
[0068]ADSC可從各種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物分離，包括(但不限于)豬、牛、犬、馬和貓。在一個(gè)方面中，可分離出ADSC并用于治療和/或預(yù)防目的的個(gè)體為豬。所飼養(yǎng)的豬通常用于提供用于異種移植的部分(例如，用于人類(lèi)心臟的瓣膜)的目的。因此，豬ADSC可用于異種移植到其它非人類(lèi)動(dòng)物中。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供從私人擁有的寵物獲得的ADSC，所述寵物的獲取可由食品與藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)來(lái)管理。來(lái)自這些寵物的ADSC可用于異種移植、同種移植或同源移植。
[0069]在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于ADSC的治療的接受者的異種ADSC?？墒褂玫腁DSC類(lèi)型的非限制性實(shí)例為牛、馬、羊和豬。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于ADSC的治療的接受者的同種ADSC。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于ADSC的治療的接受者的同源ADSC。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供基于ADSC的治療的接受者的自體ADSC。
[0070]來(lái)自非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的ADSC可以所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任一方式分離。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，ADSC可根據(jù)以下非限制性方法來(lái)分離。首先，用含有1%青霉素和鏈霉素的PBS沖洗經(jīng)分離脂肪組織(即脂肪組織或抽脂脂肪)，將其切碎成小塊，然后以5:lv/v的膠原酶溶液:脂肪的比率與含有0.075%膠原酶IA型的溶液(西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密蘇里州)混合。在37°C和劇烈振蕩下培育I小時(shí)后，然后在室溫下以220Xg將產(chǎn)物離心10分鐘。形成三個(gè)層:上部脂質(zhì)層、中間膠原酶層和底部細(xì)胞沉淀。收集中間層并藉助200 μ m過(guò)濾器過(guò)濾，接著進(jìn)行離心。在第二輪中使用穿流(flow-thru)中的再循環(huán)膠原酶IA型來(lái)再次消化新鮮脂肪組織，使用高于第一輪的比率(7:1，以體積計(jì))。底部細(xì)胞沉淀含有干細(xì)胞。
[0071]可在進(jìn)一步純化、分化、向個(gè)體投與或用于任一其它用途之前保存或存儲(chǔ)ADSC或包含ADSC的脂肪組織。盡管已報(bào)道脂肪組織可在室溫下存儲(chǔ)24小時(shí)并在4°C下存儲(chǔ)I天到3天，但脂肪組織中的活細(xì)胞在存儲(chǔ)期間急劇減少。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供使用脂肪組織保存溶液(ATPS)保存ADSC或脂肪組織的活力的方法，其中所述ATPS含有超氧化物歧化酶(SOD)作為其必需成份。在一個(gè)方面中，從哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞分離超氧化物歧化酶。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可從市售來(lái)源(例如西格瑪奧德里奇，其還出售從牛RBC或肝分離的S0D)容易地獲取S0D。
[0072]在一個(gè)非限制性方面中，ATPS是由 200mg/ml KH2PO4、200mg/L KCl,2.16g/LNa2HP04.7H20、8g/L NaCl、30，000 單位/L SOD 和 5g/L 牛血清白蛋白(BSA)組成。為保存非人類(lèi)哺乳動(dòng)物脂肪衍生干細(xì)胞，可將IX IO6個(gè)脂肪衍生干細(xì)胞與Iml ATPS混合并存儲(chǔ)在4°C下。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可將ATPS所包含的試劑濃度改變到適當(dāng)程度，而顯著影響ATPS的所需性質(zhì)。
[0073]眾所周知，來(lái)源于脂肪組織消化的基質(zhì)血管成份是由許多類(lèi)型的細(xì)胞組成，例如干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和其它終末分化細(xì)胞?！疤赃x”是用于從不同細(xì)胞類(lèi)型的混合物富集特定細(xì)胞群的免疫選擇方法，其已闡述于各種細(xì)胞培養(yǎng)教科書(shū)和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的參考文獻(xiàn)中。這種方法是基于與細(xì)胞培養(yǎng)皿結(jié)合的抗體的選擇能力。將多種細(xì)胞類(lèi)型的混合物在經(jīng)抗體涂覆的板上培養(yǎng)并允許結(jié)合較短時(shí)期。然后可從培養(yǎng)皿輕輕地洗脫非附著細(xì)胞(所述不結(jié)合抗 體者)，從而使得可采集已結(jié)合細(xì)胞。這種方法有助于研發(fā)其它新技術(shù)，例如密度梯度分離和利用特定細(xì)胞類(lèi)型的獨(dú)特表面結(jié)合性質(zhì)的方法。例如，磁珠粒技術(shù)的研發(fā)允許反復(fù)洗滌珠粒結(jié)合細(xì)胞，從而顯著改良潛在分離純度。各公司所用的順磁珠粒的大小和組成顯著不同且定期進(jìn)行進(jìn)一步精制/改良。
[0074]因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，使用可一起用于檢測(cè)⑶34、⑶90和SSEAI細(xì)胞標(biāo)記的存在的抗體組合來(lái)選擇脂肪衍生干細(xì)胞。除了這些標(biāo)記以外可使用其它抗體，例如在頒予塞爾(Sayre)等人的已公開(kāi)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)案第2006/0147430號(hào)中揭示的所述標(biāo)記。在識(shí)別陽(yáng)性細(xì)胞之后，可培養(yǎng)所述細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究，或在一種或一種以上本文所揭示的治療方法中投與個(gè)體。
[0075]IV.組合物
[0076]本發(fā)明還提供可用于實(shí)踐本發(fā)明的治療方法的治療組合物。在一些實(shí)施例中，所用ADSC對(duì)于接受者來(lái)說(shuō)是異種的。本發(fā)明還提供可用作治療(治療性或預(yù)防性)各種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的“萬(wàn)能供體”、從而降低移植排斥的可能性的ADSC庫(kù)。
[0077]在本發(fā)明的一個(gè)方面中，治療組合物以混合物形式包括醫(yī)藥上可接受的賦形劑(載劑)或介質(zhì)和本發(fā)明的ADSC (包括從其衍生的細(xì)胞或組織)，所述ADSC是單獨(dú)的或與一種或一種以上生物活性劑組合，且其強(qiáng)度可有效通過(guò)各種方式投與經(jīng)歷細(xì)胞或組織損失或缺陷的個(gè)體。
[0078]在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供用于多種方法中的治療組合物，其包含或基于本發(fā)明的ADSC (包括從其衍生的譜系未定的細(xì)胞群、譜系定型的細(xì)胞群或組織)以及醫(yī)藥上可接受的載劑或介質(zhì)。應(yīng)理解，本發(fā)明還涵蓋治療組合物，其包含作用于或調(diào)節(jié)本發(fā)明ADSC和/或從其衍生的細(xì)胞或組織的生物活性劑以及醫(yī)藥上可接受的載劑或介質(zhì)。
[0079]基于細(xì)胞或組織的治療組合物的制備在業(yè)內(nèi)眾所周知。所述組合物可調(diào)配于醫(yī)藥上可接受的介質(zhì)中。細(xì)胞可呈溶液形式或包埋于基質(zhì)中。具有生物活性劑(例如，生長(zhǎng)因子)作為活性成份的治療組合物的制備在業(yè)內(nèi)眾所周知。通常將活性治療成份與醫(yī)藥上可接受且與所述活性成份相容的賦形劑或介質(zhì)混合。另外，如果需要，組合物可含有增強(qiáng)活性成分有效性的少量輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑。
[0080]可將生物活性劑以經(jīng)中和的醫(yī)藥上可接受的鹽形式調(diào)配到治療組合物中。醫(yī)藥上可接受的鹽包括酸加成鹽(用肽或抗體分子的游離氨基來(lái)形成)，且其是用無(wú)機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸和諸如此類(lèi))來(lái)形成。從游離羧基形成的鹽還可衍生自無(wú)機(jī)堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)和諸如此類(lèi))。
[0081]ADSC 的投與
[0082]本發(fā)明的治療組合物是以與劑量調(diào)配物相容的方式并以治療有效量來(lái)投與。待投與的量取決于(例如)待治療的個(gè)體和虛弱情況。然而，本發(fā)明治療組合物的適宜劑量可在以下范圍內(nèi):約0.05 X IO6個(gè)到100.0 X IO6個(gè)脂肪衍生干細(xì)胞/10毫米治療部位，優(yōu)選地約0.10 X IO6個(gè)到50.0 X IO6個(gè)脂肪衍生干細(xì)胞/10毫米治療部位，且更優(yōu)選地約0.5 X IO6個(gè)到5.0X IO6個(gè)脂肪衍生干細(xì)胞/10毫米治療部位。初始投與和后繼投與的適宜方案也是可變的，但可包括初始投與和之后以一個(gè)或一個(gè)以上所需或所指示間隔(例如數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年)通過(guò)后續(xù)注射或其它投與來(lái)投與重復(fù)劑量。[0083]所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定用于特定目的的適當(dāng)細(xì)胞濃度。實(shí)例性劑量是在每天每治療部位約0.05X IO6個(gè)到100.0X IO6個(gè)細(xì)胞的范圍內(nèi)。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，將約5 X IO6個(gè)ADSC注射到非人類(lèi)關(guān)節(jié)(例如，僵硬關(guān)節(jié))中來(lái)治療骨關(guān)節(jié)炎。治療組合物的精確投與時(shí)間表取決于獸醫(yī)的判斷和所需結(jié)果，且因此在某種程度上為每一個(gè)體所特有的。
[0084]本發(fā)明的ADSC或分化細(xì)胞可通過(guò)優(yōu)選地經(jīng)由遞送裝置(例如管，例如導(dǎo)管)注射到個(gè)體的標(biāo)靶部位中來(lái)投與。在一個(gè)方面中，所述管另外含有針(例如注射器)，借助其可將細(xì)胞引入個(gè)體的所需位置中。向個(gè)體投與細(xì)胞的具體非限制性實(shí)例也可包括通過(guò)皮下注射、肌內(nèi)注射、關(guān)節(jié)內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來(lái)投與。如果經(jīng)靜脈內(nèi)投與，則可制備細(xì)胞的可注射液體懸浮液并通過(guò)連續(xù)滴注或以濃注形式來(lái)投與。在另一個(gè)方面中，如果待治療的醫(yī)學(xué)病狀為擴(kuò)張型心肌病，則所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，獸醫(yī))可使用到達(dá)冠狀動(dòng)脈中的基于導(dǎo)管的注射或以使ADSC捕捉于毛細(xì)血管床中以使其可分布到周?chē)M織的方式來(lái)遞送ADSC。
[0085]還可將細(xì)胞以不同形式插入遞送裝置(例如注射器)中。例如，可將細(xì)胞懸浮于此一遞送裝置所含溶液中。本文所用術(shù)語(yǔ)“溶液”包括本發(fā)明細(xì)胞于其中保留活力的醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑。所述載劑和稀釋劑的使用為業(yè)內(nèi)所熟知。溶液優(yōu)選為無(wú)菌的且其流動(dòng)性達(dá)到易于用注射器抽注的程度。優(yōu)選地，溶液在制造和存儲(chǔ)條件下穩(wěn)定且在保存時(shí)藉助使用(例如)對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞和諸如此類(lèi)來(lái)抵抗微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染作用。本發(fā)明的溶液可通過(guò)將如本文所述的ADSC或分化細(xì)胞納入醫(yī)藥上可接受的載劑或稀釋劑和視需要上文所列舉的其它成份中且隨后過(guò)濾滅囷來(lái)制備。
[0086]細(xì)胞可全身性(例如經(jīng)靜脈內(nèi))或局部地(例如，在超聲心動(dòng)圖指導(dǎo)下直接投與到心肌缺損處，或在手術(shù)期間在可視化情況下直接施加)投與。對(duì)于所述注射，細(xì)胞可存在于可注射液體懸浮液制劑中或存在于可以液體形式注射且在受損組織部位變?yōu)榘牍腆w的生物相容性介質(zhì)中。可使用常規(guī)心內(nèi)注射器或可控內(nèi)窺鏡遞送裝置，只要針腔或孔的直徑足以使剪切力不會(huì)損傷所遞送細(xì)胞即可(例如30號(hào)或更大)。
[0087]細(xì)胞可以準(zhǔn)許其移植到打算組織部位并重構(gòu)功能缺陷區(qū)域或使其再生的任一方式來(lái)投與?？杉{入或包埋ADSC的載體基質(zhì)包括具有生物相容性、接受者相容性且降解成對(duì)接受者無(wú)害的產(chǎn)物的基質(zhì)。這些基質(zhì)在活體內(nèi)為ADSC和分化細(xì)胞提供支持和保護(hù)。
[0088]天然和/或合成生物可降解基質(zhì)是所述基質(zhì)的實(shí)例。天然生物可降解基質(zhì)包括血漿凝塊(例如來(lái)源于哺乳動(dòng)物)、膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白基質(zhì)。用于細(xì)胞移植基質(zhì)的適宜合成材料必須具有生物相容性以避免遷移和免疫學(xué)并發(fā)癥；且應(yīng)能廣泛支持細(xì)胞生長(zhǎng)和分化細(xì)胞功能。其必須也可再吸收，從而允許全天然組織來(lái)替代?；|(zhì)應(yīng)可構(gòu)造成各種形狀且應(yīng)具有足夠強(qiáng)度以防止在植入后瓦解。各種研究指示，由聚羥乙酸制成的生物可降解聚酯聚合物滿(mǎn)足所有這些準(zhǔn)則，如瓦蔡蒂(Vacanti)等人，小兒外科雜志(J.Ped Surg.),23:3-9(1988);西瑪(Cima)等人，生物技術(shù)與生物工程(Biotechnol Bioeng.) 38:14 5 (1991);瓦蔡蒂等人，整形與改造外科學(xué)(Plast.Reconstr.Surg)，88:753-9 (1991)所述。其它合成生物可降解載體基質(zhì)包括合成聚合物，例如聚酸酐、聚原酸酯和聚乳酸。合成聚合物的其它實(shí)例和將細(xì)胞納入或包埋到這些基質(zhì)中的方法也為業(yè)內(nèi)已知。例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4，298，002號(hào)和第5，308，701號(hào)。[0089]細(xì)胞與聚合物的附接可通過(guò)用諸如以下等化合物涂覆聚合物來(lái)增強(qiáng):基膜組份、瓊脂、瓊脂糖、明膠、阿拉伯膠(gum arabic)、膠原I型、II型、III型、IV型和V型、纖連蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖、其混合物和細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它材料。用于基質(zhì)中的所有聚合物都必須滿(mǎn)足為細(xì)胞的后續(xù)生長(zhǎng)和增殖提供足夠支持所需的機(jī)械和生物化
學(xué)參數(shù)。
[0090]生物可降解聚合物基質(zhì)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于，可將血管生成性化合物和其它生物活性化合物直接納入載體基質(zhì)中，以便其在活體內(nèi)可隨著載體基質(zhì)降解而緩慢釋放。隨著細(xì)胞-聚合物結(jié)構(gòu)血管化和結(jié)構(gòu)降解，ADSC可根據(jù)其固有特性來(lái)分化?？蓪ㄒ韵碌囊蜃蛹{入基質(zhì)中或連同基質(zhì)一起提供:營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子、分化或去分化(即，使分化細(xì)胞喪失分化特性并獲得諸如增殖等特性和更一般的功能)誘導(dǎo)劑、分泌產(chǎn)物、免疫調(diào)節(jié)劑、炎癥抑制劑、消退因子、增強(qiáng)或允許淋巴網(wǎng)絡(luò)或神經(jīng)纖維向內(nèi)生長(zhǎng)的生物活性劑、透明質(zhì)酸和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知且可從諸如合作研究(Collaborative Research)、西格瑪化學(xué)(SigmaChemical)公司等供應(yīng)商購(gòu)得并具有關(guān)于有效量構(gòu)成的說(shuō)明書(shū)的藥物、諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)等血管生長(zhǎng)因子。類(lèi)似地，可合成含有諸如附接肽RGD (Arg-Gly-Asp)等肽的聚合物用于形成基質(zhì)(例如，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第4，988，621號(hào)、第4，792，525號(hào)、第5，965，997號(hào)、第4，879，237號(hào)和第 4，789，734 號(hào))。
[0091]在另一個(gè)實(shí)例中，細(xì)胞可在凝膠基質(zhì)(例如，明膠海綿(Gelfoam)，厄普約翰(Upjohn)公司)中移植，所述凝膠基質(zhì)聚合以形成可生長(zhǎng)ADSC或分化細(xì)胞的基質(zhì)。已研發(fā)各種囊封技術(shù)(例如萊西(Lacy)等人，科學(xué)(Science) 254:1782-84(1991);沙利文(Sullivan)等人，科學(xué) 252:718-712 (1991) ；W091/10470 ;W091/10425 ;美國(guó)專(zhuān)利第5，837，234號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第5，011，472號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第4，892，538號(hào))。
[0092]PLGA或聚(乳酸-共-羥乙酸)是食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的共聚物，其由于其生物可降解性和生物相容性而在多種治療裝置中使用。PLGA是藉助兩種不同單體、即羥乙酸和乳酸的環(huán)狀二聚體(1，4-二惡烷-2，5-二酮)的無(wú)規(guī)開(kāi)環(huán)共聚合來(lái)合成。用于制備此聚合物的常用催化劑包括2-乙基己酸錫(II)、環(huán)烷氧錫(II)或異丙醇鋁。在聚合期間，連續(xù)單體單元(羥乙酸或乳酸)在PLGA中通過(guò)酯鍵連接在一起，從而產(chǎn)生非線性脂肪族聚酯產(chǎn)物。由于PLGA在體內(nèi)經(jīng)歷水解而產(chǎn)生初始單體乳酸和羥乙酸，因此其已成功用作生物可降解聚合物。所述兩種單體是體內(nèi)各種代謝途徑的副產(chǎn)物。由于身體能有效分解所述兩個(gè)單體，因此沒(méi)有與使用PLGA進(jìn)行藥物遞送或生物材料應(yīng)用相關(guān)的全身毒性。與PLGA/羧甲基纖維素(CMC)混合的ADSC保留在注射區(qū)域的趨勢(shì)大于與鹽水混合的ADSC。
[0093]V.經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞
[0094]另外 ，ADSC可經(jīng)改造以含有表達(dá)生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞因子的基因。例如，ADSC可經(jīng)改造以表達(dá)有益基因，例如(但不限于)VEGF、BDNF, IGF、TGF、NGF和其它神經(jīng)滋養(yǎng)和血管滋養(yǎng)生長(zhǎng)因子。注射經(jīng)特別改造的ADSC可幫助某些組織再生；例如，BDNF之于神經(jīng)。ADSC還可經(jīng)改造以表達(dá)β細(xì)胞特異性基因Pdx-1，其使得ADSC能分泌胰島素?？蓪⑺黾?xì)胞移植到個(gè)體中以治療其糖尿病。在另一個(gè)方面中，ADSC可經(jīng)改造以產(chǎn)生肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白且然后植入個(gè)體中以治療肌營(yíng)養(yǎng)不良。在另一個(gè)方面中，表達(dá)軟骨細(xì)胞的至少一個(gè)基因型或表型特性的ADSC經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)外源基因或抑制內(nèi)源基因的表達(dá)并將其植入動(dòng)物中。本發(fā)明提供在植入之前遺傳修飾所述細(xì)胞和群體的方法。應(yīng)理解，即便沒(méi)有遺傳修飾的幫助，ADSC可能也能沿譜系向器官特異性細(xì)胞(例如，軟骨細(xì)胞)進(jìn)一步分化。
[0095]可將包含啟動(dòng)子和所關(guān)注序列的核酸構(gòu)筑體以非復(fù)制型DNA(或RNA)分子形式引入接受者的原核或真核細(xì)胞中，所述分子可為線性分子或更優(yōu)選地閉合共價(jià)環(huán)狀分子。由于所述分子在沒(méi)有復(fù)制起點(diǎn)時(shí)不能自主復(fù)制，因此基因的表達(dá)可藉助所引入序列的短暫表達(dá)來(lái)進(jìn)行?；蛘撸山逯鷮⑺隓NA序列整合到宿主染色體中來(lái)進(jìn)行永久表達(dá)。
[0096]在一個(gè)方面中，利用能將所需基因序列整合到宿主細(xì)胞染色體中的載體。已將所引入DNA穩(wěn)定地整合到染色體中的細(xì)胞可通過(guò)另外引入一個(gè)或一個(gè)以上允許選擇含有所需核酸序列的宿主細(xì)胞的標(biāo)記來(lái)選擇。標(biāo)記(如果需要)可向營(yíng)養(yǎng)缺陷宿主提供原養(yǎng)，提供殺生物劑抗性(例如對(duì)抗生素或諸如銅等重金屬的抗性)或諸如此類(lèi)。可將可選擇標(biāo)記基因序列直接連接到待表達(dá)的DNA基因序列或通過(guò)共轉(zhuǎn)染引入同一細(xì)胞中。優(yōu)選地，可量化標(biāo)記的表達(dá)。
[0097]在優(yōu)選方面中，可將所引入核酸分子納入接受者宿主中能自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《据d體中。眾多種載體中的任一者可用于此目的。在選擇特定質(zhì)?；虿《据d體時(shí)的重要因素包括:1)從不含所述載體的接受者細(xì)胞中識(shí)別并選擇出含有所述載體的所述接受者細(xì)胞的便捷性；2)特定宿主中需要的載體的拷貝數(shù)；和3)是否需要能使所述載體在不同物種的宿主細(xì)胞之間穿梭。
[0098]優(yōu)選真核載體包括(例如)痘苗病毒、SV40、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒和所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的各種基于質(zhì)粒的市售哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。
[0099]在已制備含有構(gòu)筑體的載體或核酸分子用于表達(dá)后，可通過(guò)以下多種適宜方式中的任一者將DNA構(gòu)筑體引入適當(dāng)宿主細(xì)胞中:即轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、病毒感染、偶聯(lián)、原生質(zhì)融合、電穿孔、粒子槍技術(shù)、磷酸鈣沉淀、直接顯微注射和諸如此類(lèi)。在引入載體后，使接受者細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，所述選擇性培養(yǎng)基針對(duì)含有載體的細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行選擇。經(jīng)克隆基因分子的表達(dá)導(dǎo)致異源蛋白的產(chǎn)生。
[0100]將所引入DNA “維持”在細(xì)胞中應(yīng)理解為，在所討論細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)并增殖時(shí)，所引入DNA在基本上所有所述細(xì)胞中繼續(xù)存在。也就是說(shuō)，在多輪細(xì)胞分裂后，所引入DNA不會(huì)從大部分細(xì)胞中稀釋。相反，其在細(xì)胞增殖期間復(fù)制，且在幾乎每一個(gè)子細(xì)胞中都保留所引入DNA的至少一個(gè)拷貝?？梢?xún)煞N方式中的任一者將所引入DNA維持在細(xì)胞中。第一，可將其直接整合到細(xì)胞的基因組中。發(fā)生這種情況的頻率極低。第二，其可以染色體外元件或游離體的形式存在。為了使游離體在細(xì)胞增殖期間不被稀釋?zhuān)稍谒隓NA和在需要標(biāo)記基因表達(dá)的條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞中包括可選擇標(biāo)記基因。甚至在已將所引入DNA整合于基因組中的情形下，也可包括可選擇標(biāo)記基因以防止從染色體切除所述DNA。
[0101]經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞可短暫表達(dá)所關(guān)注基因或組成型表達(dá)所關(guān)注基因。所述表達(dá)可位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面上。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，本發(fā)明的ADSC經(jīng)遺傳修飾以短暫表達(dá)一種或一種以上有益于治療特定醫(yī)學(xué)病狀或減輕疼痛的細(xì)胞因子。例如，可將已經(jīng)遺傳修飾以表達(dá)抗炎性細(xì)胞因子(例如，IL-2)的ADSC移植到發(fā)生炎癥的位置(例如，關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié))中。然后由于ADSC除了表達(dá)有益的抗炎性細(xì)胞因子外還可變成軟骨細(xì)胞，所以所述移植向個(gè)體提供雙重益處。短暫表達(dá)可延續(xù)數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)、數(shù)天或甚至數(shù)周的時(shí)段。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，有益細(xì)胞因子的短暫表達(dá)為I周、2周或3周。在本發(fā)明的其它實(shí)施例中，有益細(xì)胞因子的短暫表達(dá)為癥狀減少或甚至消失所需的時(shí)間長(zhǎng)度。癥狀的減少或消失可由治療個(gè)體的所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如獸醫(yī))來(lái)確定。
[0102]然后可通過(guò)各種方法在轉(zhuǎn)基因可在活體內(nèi)表達(dá)的條件下將經(jīng)遺傳改變的細(xì)胞引入個(gè)體中。作為非限制性實(shí)例，轉(zhuǎn)基因可編碼產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其中轉(zhuǎn)基因優(yōu)選地編碼產(chǎn)生膠原。然后可將含有細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞引入動(dòng)物中?；蛘?，可腹膜內(nèi)注射含有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或?qū)⑵渥⑸涞揭恍┢渌m宜的器官儲(chǔ)積部位中。
[0103]V1.ADSC 庫(kù)
[0104]本發(fā)明還提供來(lái)源于多種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物物種的ADSC存儲(chǔ)庫(kù)?？墒褂玫腁DSC類(lèi)型的非限制性實(shí)例為牛、馬、羊和豬。ADSC庫(kù)允許存放和/或存儲(chǔ)已從多種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物分離的ADSC。ADSC庫(kù)允許所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，獸醫(yī))便捷迅速地治療動(dòng)物。ADSC庫(kù)也允許所屬領(lǐng)域技術(shù)人員用其確定為適當(dāng)?shù)淖泽w、同種、異種或同源ADSC治療動(dòng)物。在一個(gè)方面中，提供可通過(guò)FDA的移植(包括異種移植)條例的豬-衍生ADSC庫(kù)用于治療性以及預(yù)防性動(dòng)物治療。在另一個(gè)方面中，提供來(lái)源于未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的來(lái)源的豬-衍生ADSC庫(kù)用于治療性以及預(yù)防性動(dòng)物治療。在另一個(gè)方面中，ADSC庫(kù)對(duì)于治療接受者來(lái)說(shuō)是異種的。在另一個(gè)方面中，ADSC庫(kù)充當(dāng)動(dòng)物治療的接受者的萬(wàn)能供體。
[0105]VI1.具有來(lái)源于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的ADSC的試劑盒
[0106]本發(fā)明還提供包括來(lái)源于任一非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的ADSC的組合物和適宜包裝的制造物件和試劑盒。在一個(gè)方面中，組合物包含100%(在提及純度時(shí))的ADSC?！凹兌取辈⒎鞘侵附M合物中僅存在干細(xì)胞，而是指示干細(xì)胞已經(jīng)操作以使得已將其從其天然組織環(huán)境移除。關(guān)于其它方面，組合物包含 99.9%,99.5%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91% 或90%純度的ADSC。在其它方面中，組合物包含85%、80%、75%或70%純度的ADSC。包含來(lái)自非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的ADSC的試劑盒可用于存儲(chǔ)和/或裝運(yùn)。在一些方面中，本發(fā)明包括具有以下的試劑盒:(i) 一種或一種以上來(lái)源于一種或一種以上非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的多潛能ADSC或可移植ADSC和(ii)使用所述試劑盒治療需要所述治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的病狀的說(shuō)明書(shū)。在多個(gè)方面中，本發(fā)明的特征為具有以下的試劑盒:(i) 一種或一種以上來(lái)源于一種或一種以上非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的多潛能ADSC或可移植ADSC和(ii)使用所述試劑盒進(jìn)行研究或藥物篩選用途的說(shuō)明書(shū)。 在另一個(gè)方面中，將ADSC組合物與羧甲基纖維素(CMC)組合。
[0107]本文所述組合物的適宜包裝為業(yè)內(nèi)已知，且包括(例如)小瓶(例如，密封小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、廣口瓶、柔性包裝(例如，密封麥拉(Mylar)袋或塑料袋)和諸如此類(lèi)。這些制造物件可進(jìn)一步經(jīng)滅菌和/或密封。本發(fā)明還提供包含本文所述組合物的單位劑型。可將這些單位劑型以單一或多個(gè)單位劑量存儲(chǔ)在適宜包裝中且還可進(jìn)一步經(jīng)滅菌和密封。本發(fā)明試劑盒中所供應(yīng)的說(shuō)明書(shū)通常為標(biāo)簽或包裝插頁(yè)(例如，試劑盒中包括的紙頁(yè))上的書(shū)面說(shuō)明書(shū)，但也可接受機(jī)讀說(shuō)明書(shū)(例如，載于磁性或光學(xué)存儲(chǔ)盤(pán)上的說(shuō)明書(shū))。關(guān)于使用來(lái)源于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的ADSC的說(shuō)明書(shū)通常包括關(guān)于用于打算治療或工業(yè)應(yīng)用的劑量、投藥時(shí)間表和投與路徑的信息。試劑盒可進(jìn)一步包含對(duì)選擇適宜治療的個(gè)體的方法的描述。
[0108]容器可為單位劑量、散裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。例如，也可提供含有足夠劑量的ADSC以在諸如以下等延長(zhǎng)時(shí)段內(nèi)為個(gè)體提供有效治療的試劑盒:約I周、約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約5個(gè)月、約6個(gè)月、約7個(gè)月、約8個(gè)月、約9個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)段中的任一者。試劑盒還可包括多個(gè)單位劑量的細(xì)胞和使用說(shuō)明書(shū)，并以足夠數(shù)量包裝以供在動(dòng)物診所(例如動(dòng)物醫(yī)院)、動(dòng)物醫(yī)院中的藥房和動(dòng)物診所和/或動(dòng)物醫(yī)院的供應(yīng)商店中存儲(chǔ)和使用。
[0109]另外，套組可含有包含對(duì)于治療接受者為異種、同種或同源的ADSC的組合物。
[0110]VII1.ADSC的治療和投與方法
[0111]可投與ADSC以治療多種哺乳動(dòng)物病狀，包括(但不限于)尿失禁、骨關(guān)節(jié)炎、退行性脊髓病、糖尿病、組織再生、傷口愈合、結(jié)瘢、軟組織缺損、大便失禁、擴(kuò)張型心肌病、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全、股骨頭無(wú)血管壞死、韌帶損傷、肌腱損傷、脊髓損傷、動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)梗塞、關(guān)節(jié)炎和肌營(yíng)養(yǎng)不良。ADSC的另一用途是阻抑免疫反應(yīng)以預(yù)防移植物抗宿主(GVH)疾病。ADSC可用于組織再生，或用于其可分泌的各種因子和/或酶，或用于其在分化后對(duì)周?chē)h(huán)境的效應(yīng)。
[0112]可將脂肪衍生干細(xì)胞或分化細(xì)胞移植到接受者中，其中所述細(xì)胞將增殖并分化以形成新細(xì)胞和組織，從而提供通常由所述組織提供的生理過(guò)程。本文所用術(shù)語(yǔ)“移植”是指僅轉(zhuǎn)移細(xì)胞或轉(zhuǎn)移包埋于載體基質(zhì)中的細(xì)胞。細(xì)胞可為自體、同源、同種或異種細(xì)胞。本文所用術(shù)語(yǔ)“組織”是指聯(lián)合執(zhí)行特定功能的類(lèi)似專(zhuān)門(mén)化細(xì)胞的聚集體。組織打算涵蓋所有類(lèi)型的生物組織，包括硬組織和軟組織二者。軟組織是指連接、支持或包圍身體的其它結(jié)構(gòu)和器官的組織。軟組織包括肌肉、肌腱(將肌肉連接到骨的纖維帶)、纖維組織、脂肪、血管、神經(jīng)和滑膜組織(關(guān)節(jié)周?chē)慕M織)。硬組織包括結(jié)締組織(例如，諸如骨組織或骨等硬形式)以及其它肌肉或骨骼組織。
[0113]在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，將ADSC與醫(yī)藥上可接受的載劑或賦形劑一起投與。本文所述醫(yī)藥上可接受的賦形劑(例如，媒劑、佐劑、載劑或稀釋劑)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知且公眾可容易獲得。優(yōu)選地，醫(yī)藥上可接受的載劑或賦形劑為在化學(xué)上對(duì)治療組合物為惰性者和在使用條件下無(wú)有害副作用或毒性者。
[0114]賦形劑或載劑的選擇部分取決于特定治療組合物以及投與所述組合物使用的特定方法。因此，本發(fā)明醫(yī)藥組合物有眾多種適宜調(diào)配物。本文所述調(diào)配物僅為實(shí)例性且決不具有限制性。
[0115]通常，生理上可接受的載劑是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載劑的實(shí)例包括(但不限于)鹽水、溶劑、分散介質(zhì)、細(xì)胞培養(yǎng)基、水性緩沖劑(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸)；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰氨、精氨酸或賴(lài)氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA ;糖醇，例如甘露醇或山梨醇；鹽形成抗衡離子，例如鈉；和/或非離子型表面活性劑，例如吐溫(TWEEN，TM)、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克(PLUR0NICS，TM)。
[0116]A.尿失禁的ADSC治療
[0117]ADSC可用于治療各種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的尿失禁。尿失禁(UI)是使人虛弱且迄今難以治愈的病狀。在一個(gè)方面中，Π定義為無(wú)意漏尿并影響約20%切除卵巢(卵巢子宮切除術(shù))的雌性狗，但在少于1%的完整雌性狗中出現(xiàn)且極少在雄性犬中報(bào)道，不管其性腺狀態(tài)如何。
[0118]罹患UI的狗具有一些常見(jiàn)的繼發(fā)性問(wèn)題，例如膀胱感染和尿液灼傷。膀胱感染是由細(xì)菌引起的，所述細(xì)菌沿尿道向上遷移并穿過(guò)患有Π的狗的較松弛尿道口進(jìn)入膀胱。皮膚的尿液灼傷是因長(zhǎng)期接觸漏出的尿液(其具有高度腐蝕性)所致。在雌性狗中，Π可在自切除卵巢后I周起的任一時(shí)間發(fā)生且與通常導(dǎo)致動(dòng)物安樂(lè)死的嚴(yán)重管理問(wèn)題相關(guān)。人們相信切除卵巢的雌性狗的UI是因神經(jīng)、血管或激素變化而非因手術(shù)期間持續(xù)的下泌尿道的機(jī)械損傷而發(fā)生。
[0119]目前，主要用苯丙醇胺(PPA)來(lái)治療犬UI。PPA是α-腎上腺素能激動(dòng)劑并刺激分泌去甲腎上腺素(增加尿道括約肌肌肉緊張度的激素物質(zhì))。在1999年，由于PPA會(huì)增加出血性中風(fēng)(腦中出血或血液流入腦周?chē)M織中)的風(fēng)險(xiǎn)，所以聯(lián)邦食品與藥物管理局禁止將其用于人類(lèi)。
[0120]已在人類(lèi)醫(yī)學(xué)中成功證明了 UI的干細(xì)胞療法。現(xiàn)在，將干細(xì)胞從個(gè)體的骨骼肌分離并注射到尿道括約肌中，從而導(dǎo)致肌肉細(xì)胞再生和尿道收縮性增強(qiáng)。然而，由于缺乏所述干細(xì)胞且肌肉生檢大小受限，因此此程序需要持久培養(yǎng)所分離干細(xì)胞。另外，這些細(xì)胞注定僅變成肌肉細(xì)胞且因此不能復(fù)原尿道中的其它細(xì)胞類(lèi)型(例如神經(jīng)和血管)。相比之下，ADSC可大量獲得并可分化成眾多種細(xì)胞類(lèi)型(包括神經(jīng)元細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)，從而提供優(yōu)于其它類(lèi)型的療法的優(yōu)勢(shì)。
[0121]因此，可使用ADSC來(lái)治療UI。在一個(gè)方面中，將所使用的ADSC描述為萬(wàn)能供體?？蓪⒂米魅f(wàn)能供體 的ADSC存儲(chǔ)在動(dòng)物診所或動(dòng)物醫(yī)院以便于迅速治療。將有效量的ADSC注射到針對(duì)Π進(jìn)行治療的個(gè)體的尿道括約肌區(qū)域中。有效量根據(jù)動(dòng)物大小在每個(gè)動(dòng)物一百萬(wàn)個(gè)到一千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或五百萬(wàn)/IOkg的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)使用允許可視化和注射二者的尿檢查儀來(lái)完成精確注射。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，獸醫(yī))可與個(gè)體的體重成比例地調(diào)整懸浮液的體積和細(xì)胞數(shù)。
[0122]在治療程序后，個(gè)體的所有者應(yīng)每天留心監(jiān)測(cè)個(gè)體以觀察以下特性:監(jiān)測(cè)注射部位的反應(yīng)體征，例如發(fā)紅、疼痛和發(fā)熱；監(jiān)測(cè)動(dòng)物的過(guò)敏性反應(yīng)和尿道堵塞體征；動(dòng)物中的任何其它不尋常體征，例如持續(xù)惡心、疲勞、嗜睡、食欲下降和排尿困難。如果觀察到任一所述特性，則個(gè)體的所有者應(yīng)立即通知獸醫(yī)，以便獸醫(yī)可采取適當(dāng)措施來(lái)改善個(gè)體的健康狀態(tài)。獸醫(yī)可在治療后定期實(shí)施評(píng)估，例如，在治療后10天到15天、25天到30天和55天到60天。
[0123]B.骨關(guān)節(jié)炎(OA)的ADSC治療
[0124]ADSC可用于治療各種非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的骨關(guān)節(jié)炎(OA)。OA是狗的慢性疼痛的最常見(jiàn)病因，且在美國(guó)在任何時(shí)候都有20%以上或一千萬(wàn)只到一千二百萬(wàn)只狗患有慢性疼痛。OA的特性在于關(guān)節(jié)軟骨退化，伴隨基質(zhì)損失、纖維性顫動(dòng)和形成裂縫，且可導(dǎo)致軟骨表面的完全損失。軟骨細(xì)胞(即關(guān)節(jié)軟骨的唯一細(xì)胞)經(jīng)由分泌大分子組份(膠原、糖胺聚糖和透明質(zhì)酸)和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)更新來(lái)維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)合成和降解。在OA中，破壞性和促炎性媒介物相對(duì)于合成代謝和修補(bǔ)性物質(zhì)過(guò)量產(chǎn)生，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨被逐漸破壞。
[0125]現(xiàn)在，干細(xì)胞療法已在臨床環(huán)境中應(yīng)用于人類(lèi)、馬和狗。在馬中，使用脂肪組織衍生干細(xì)胞(ADSC)治療肌腱損傷、韌帶損傷、骨關(guān)節(jié)炎(OA)和骨軟骨缺陷已達(dá)成高成功率(約70%)。在狗中，OA的ADSC治療似乎同樣有效。是干細(xì)胞療法的潛在目標(biāo)的其它犬疾病包括肌腱和韌帶損傷、髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全、股骨頭無(wú)血管壞死、擴(kuò)張型心肌病、脊髓損傷、退行性脊髓病、尿失禁(UI)和肌營(yíng)養(yǎng)不良。
[0126]目前，主要用NASID來(lái)治療0A。然而，許多科學(xué)研究和臨床經(jīng)驗(yàn)表明，NSAID并不徹底緩解疼痛。與藥物療法相比，諸如ADSC療法等細(xì)胞療法不依賴(lài)其作用的單一標(biāo)靶受體或途徑。細(xì)胞療法通過(guò)分泌細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子以及通過(guò)將內(nèi)源細(xì)胞募集到受傷部位來(lái)起滋養(yǎng)作用，且其可促進(jìn)細(xì)胞分化成常駐譜系。已知包括ADSC的間葉干細(xì)胞與其局部環(huán)境的細(xì)胞連通，阻抑免疫反應(yīng)并抑制凋亡。最新研究也顯示，骨髓干細(xì)胞(其具有與ADSC類(lèi)似的再生能力)可將新線粒體遞送到受損細(xì)胞，從而拯救有氧代謝。因此，ADSC療法可減輕OA個(gè)體的疼痛并促進(jìn)愈合，從而改良生活質(zhì)量。
[0127]因此，ADSC可用于治療0A。在一個(gè)方面中，將所使用的ADSC描述為萬(wàn)能供體?？蓪⒂米魅f(wàn)能供體的ADSC存儲(chǔ)在動(dòng)物診所或動(dòng)物醫(yī)院以便于迅速治療。在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供對(duì)罹患OA的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物(例如狗)的治療。盡管OA實(shí)際上可折磨任一關(guān)節(jié)，但其最常與后肢膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)相關(guān)。治療可通過(guò)將ADSC懸浮液注射到所述關(guān)節(jié)中來(lái)實(shí)行。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，獸醫(yī))可熟練地按個(gè)體大小成比例地調(diào)整細(xì)胞懸浮液的體積和細(xì)胞數(shù)。作為非限制性實(shí)例，20kg狗的每個(gè)關(guān)節(jié)可接受存于0.5ml PBS中的五百萬(wàn)個(gè)ADSC。在治療之后，勸告所有者每天牽繩遛狗30分鐘。允許非人類(lèi)哺乳動(dòng)物繼續(xù)服用在ADSC治療前所服用的任何口服藥物。在ADSC治療前的任何關(guān)節(jié)內(nèi)治療都應(yīng)中斷。
[0128]在治療后,動(dòng)物評(píng)估將納入病歷、身體檢查和跋足檢查,所述跋足檢查包括關(guān)節(jié)靈活性和操作時(shí)的疼痛記錄。臨床結(jié)果量度將基于動(dòng)物矯形外科評(píng)估，所述評(píng)估使用基于標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷的數(shù)值等級(jí)量表?？稍诠吠ㄟ^(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射接受測(cè)試或?qū)φ罩苿┲?天與14天之間記錄所有者評(píng)估和動(dòng)物評(píng)估二者的基線結(jié)果?？稍诠返年P(guān)節(jié)內(nèi)注射后30天、60天和90天時(shí)到動(dòng)物診所進(jìn)行跟蹤訪視。在每次訪視時(shí)，可要求所有者完成作為從辛辛那提(Cincinnati)矯形外科失能指數(shù)改編的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷的一部分的數(shù)字等級(jí)量表(I (最好)到5 (最差))，其包括對(duì)以下參數(shù)的評(píng)估:行走、跑、跳、突然轉(zhuǎn)向、從躺下起來(lái)、從站立躺下、爬階梯、下階梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走困難和自主玩耍的意愿。
[0129]C.愈合傷口的ADSC治療
[0130]也可出于加速傷口愈合和減少瘢痕形成的目的向非人類(lèi)哺乳動(dòng)物投與ADSC。此既適用于改良美容術(shù)(即，僅出于美容目的改良瘢痕愈合)也適用于輔助改良體內(nèi)手術(shù)瘢痕(例如，手術(shù)吻合術(shù)部位處的過(guò)度結(jié)?？梢l(fā)手術(shù)并發(fā)癥，例如吻合術(shù)部位攣縮。在手術(shù)時(shí)或以延遲方式局部注射ADSC可改良手術(shù)組織部位愈合并降低由于過(guò)度結(jié)瘢所致的手術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率)。
[0131]因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，在所需位置(例如沿手術(shù)傷口的縫合部位)皮下注射ADSC。在某些方面中，可引入載體材料(例如具有CMC的基質(zhì)膠或微球體)的使用以進(jìn)一步將ADSC定位到治療部位。將ADSC引入傷口部位導(dǎo)致ADSC以模擬身體對(duì)傷口的天然反應(yīng)的方式分化。例如，ADSC似乎自發(fā)分化成包含天然傷口愈合器官的其它細(xì)胞類(lèi)型(例如成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞)或新形成血管。
[0132]D.ADSC的預(yù)防用途
[0133]本發(fā)明的ADSC還用作預(yù)防以通過(guò)分別向髖部或股骨頭投與有效量的ADSC來(lái)延遲髖關(guān)節(jié)發(fā)育不全和股骨頭無(wú)血管壞死的發(fā)展。有效量根據(jù)動(dòng)物大小在每個(gè)動(dòng)物一百萬(wàn)個(gè)到一千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞或五百萬(wàn)/IOkg的范圍內(nèi)，此可由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員(例如，獸醫(yī))容易地確定。
[0134]E.ADSC在骨折修復(fù)中的使用
[0135]本發(fā)明的ADSC用于促進(jìn)骨斷裂的修復(fù)，包含在斷裂部位投與有效量的ADSC。在某些實(shí)施例中，ADSC的有效量可在約I X IO5個(gè)ADSC到約I X IO8個(gè)ADSC、約5 X IO5個(gè)ADSC至Ij約5X107個(gè)ADSC、約IXlO6個(gè)ADSC到約I X IO7個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在其它實(shí)施例中，ADSC是連同有效量的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP) —起投與。在特定實(shí)施例中，BMP為人類(lèi)BMP2、人類(lèi)BMP4、人類(lèi)BMP7或人類(lèi)BMP的混合物，所述混合物包含BMP2、人類(lèi)BMP4、人類(lèi)BMP7中的一者或一者以上。在特定實(shí)施例中，BMP或BMP混合物中的一者或一者以上是以重組方式產(chǎn)生。BMP的適宜水平提供于市售去礦質(zhì)骨基質(zhì)產(chǎn)品(例如，定制艾羅麥? ( AlloMatrix?Custom);瑞特醫(yī)療技術(shù)(Wright Medical Technology)公司，阿靈頓，田納西州)中或可由所屬領(lǐng)域技術(shù)人員獨(dú)立確定。在所述實(shí)施例的特定方面中，同樣經(jīng)靜脈內(nèi)投與有效量的ADSC。在某些實(shí)施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)投與的ADSC的有效量在約IXlO5個(gè)ADSC到約IXlO8個(gè)ADSC、約 5 X IO5 個(gè) ADSC 到約 5X107fADSCJ4 I X IO6 個(gè) ADSC 到約 I X IO7 個(gè) ADSC 的范圍內(nèi)。在所述實(shí)施例的其它方面中，根據(jù)動(dòng)物大小來(lái)調(diào)整所投與ADSC和BMP的劑量。因此，在某些實(shí)施例中，所投與ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO8個(gè)ADSC/千克體重、約5 X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約5 X IO7個(gè)ADSC/千克體重、約I X IO6個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。在其它特定實(shí)施例中，所治療的動(dòng)物是非人類(lèi)動(dòng)物且ADSC來(lái)自非人類(lèi)動(dòng)物。在具體實(shí)施例中，ADSC是豬ADSC。
[0136]F.ADSC在“干眼”病狀治療中的用途
[0137]非人類(lèi)哺乳動(dòng)物可因淚腺和/或瞼腺的功能障礙導(dǎo)致淚液的產(chǎn)量降低且不足或所產(chǎn)生淚液的組成發(fā)生改變且有效性降低而產(chǎn)生“干眼”病狀(例如，干性角膜結(jié)膜炎)。干眼癥的病因尤其包括自體免疫疾病(例如，修格蘭氏綜合癥(S.j(h_w^s syndrome)和/或類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、年齡和創(chuàng)傷。
[0138]本發(fā)明的ADSC用于促進(jìn)患有干眼癥的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的淚液產(chǎn)生復(fù)原，包含將有效量的ADSC投與到受折磨非人類(lèi)哺乳動(dòng)物眼睛的淚腺周?chē)鷧^(qū)域中。在某些實(shí)施例中，ADSC的有效量可在約I X IO5個(gè)ADSC到約I X IO8個(gè)ADSC、約5 X IO5個(gè)ADSC到約5 X IO7個(gè)ADSC、約I X IO6個(gè)ADSC到約I X IO7個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在具體實(shí)施例中，將存于0.2mL鹽水中的I X IO6個(gè)ADSC注射到淚腺周?chē)鷧^(qū)域中。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，將存于0.2mL鹽水中的I X IO6個(gè)ADSC注射到待治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的瞼腺區(qū)域中。視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定重復(fù)注射。在具體實(shí)施例中，視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定每周重復(fù)注射，持續(xù)(例如)數(shù)周。在所述實(shí)施例的特定方面中，同樣經(jīng)靜脈內(nèi)投與有效量的ADSC。在某些實(shí)施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)投與ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC到約I X IO8個(gè)ADSCJS5 X ?ο5 個(gè) ADSC 到約 5 X IO7AadscJ^] ιχιο6 個(gè) adsc 到約 Ixio7Aadsc 的范圍內(nèi)。在所述實(shí)施例的其它方面中，根據(jù)動(dòng)物大小來(lái)調(diào)整所投與ADSC和BMP的劑量。因此，在某些實(shí)施例中，所投與ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO8個(gè)ADSC/千克體重、約5 X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約5 X IO7個(gè)ADSC/千克體重、約I X IO6個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。在其它特定實(shí)施例中，所治療的動(dòng)物是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物且ADSC來(lái)自非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。在具體實(shí)施例中，ADSC是豬ADSC。在一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是貓，而在另一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是狗。
[0139]G.ADSC在慢性腎衰竭治療中的使用
[0140]慢性腎病的特性在于腎功能在經(jīng)延長(zhǎng)時(shí)期(例如，數(shù)月或數(shù)年)內(nèi)逐漸損失，其通常通過(guò)血清肌酸酐水平的增加和/或尿中蛋白質(zhì)水平的增加來(lái)識(shí)別。慢性腎衰竭的發(fā)展通常與受折磨非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中糖尿病、高血壓和腎小球性腎炎的存在相關(guān)。
[0141]本發(fā)明的ADSC用于治療(例如改善)患有慢性腎衰竭的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中慢性腎衰竭的癥狀，其中所述治療包含向受折磨的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物靜脈內(nèi)投與有效量的ADSC。在某些實(shí)施例中，ADSC的有效量可在約I X IO5個(gè)ADSC到約lX108fADSCj^J 5 X IO5個(gè)ADSC到約5 X IO7個(gè)ADSC、約I X IO6個(gè)ADSC到約I X IO7個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在具體實(shí)施例中，向受折磨哺乳動(dòng)物經(jīng)靜脈內(nèi)遞送IX IO6個(gè)ADSC/千克體重。視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定重復(fù)投與。在具體實(shí)施例中，視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定每周重復(fù)投與，持續(xù)(例如)數(shù)周。在某些實(shí)施例中，經(jīng)靜脈內(nèi)投與的ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC到約 I X IO8 個(gè) ADSC、約 5 X IO5 個(gè) ADSC 到約 5 X IO7 個(gè) ADSC、約 I X IO6 個(gè) ADSC 到約 I X IO7個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在所述實(shí)施例的其它方面中，根據(jù)動(dòng)物大小來(lái)調(diào)整所投與ADSC和BMP的劑量。因此，在某些實(shí)施例中，所投與ADSC的有效量是在約IX IO5個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO8個(gè)ADSC/千克體重、約5 X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約5 X IO7個(gè)ADSC/千克體重、約I X IO6個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。在其它特定實(shí)施例中，所治療的動(dòng)物是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物且ADSC來(lái)自非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。在具體實(shí)施例中，ADSC是豬ADSC。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是貓，而在另一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是狗。
[0142]H.ASDC在急性腎衰竭治療中的用途
[0143]急性腎衰竭的特性在于腎功能相對(duì)快速的損失。急性腎衰竭有許多病因，包括由任一原因?qū)е碌牡脱萘俊⒈┞队趯?duì)腎有害的物質(zhì)中和泌尿道阻塞。急性腎衰竭可通過(guò)(例如)以下來(lái)識(shí)別:血液中的尿素氮和肌酸酐水平升高，以及受折磨非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的腎不能產(chǎn)生足量尿液。
[0144]本發(fā)明的ADSC用于治療(例如改善)患有急性腎衰竭的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物中急性腎衰竭的癥狀，其中所述治療包含將有效量的ADSC注射到患有急性腎衰竭的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的每個(gè)腎的腎皮質(zhì)中。在某些實(shí)施例中，ADSC的有效量可在約IXlO5個(gè)ADSC到約I X IO8 個(gè) ADSC、約 5 X IO5 個(gè) ADSC 到約 5 X IO7 個(gè) ADSC、約 I X IO6 個(gè) ADSC 到約 I X IO7 個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施例中，向受折磨哺乳動(dòng)物遞送I X IO6個(gè)ADSC/千克體重。在一個(gè)具體實(shí)施例中，將存于鹽水中的IX IO6個(gè)ADSC注射到受折磨非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的每個(gè)腎的腎皮質(zhì)中。視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定重復(fù)投與。在一個(gè)具體實(shí)施例中，視需要根據(jù)治療動(dòng)物的獸醫(yī)的決定每周重復(fù)投與，持續(xù)(例如)數(shù)周。在某些實(shí)施例中，所投與ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC到約I X IO8個(gè)ADSC、約5 X IO5個(gè)ADSC到約5 X IO7個(gè)ADSCJ^ IXlO6個(gè)ADSC到約I X IO7個(gè)ADSC的范圍內(nèi)。在所述實(shí)施例的其它方面中，根據(jù)動(dòng)物大小來(lái)調(diào)整所投與ADSC和BMP的劑量。因此，在某些實(shí)施例中，所投與ADSC的有效量是在約I X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO8個(gè)ADSC/千克體重、約5 X IO5個(gè)ADSC/千克體重到約5 X IO7個(gè)ADSC/千克體重、約I X IO6個(gè)ADSC/千克體重到約I X IO7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。在其它特定實(shí)施例中，所治療的動(dòng)物是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物且ADSC來(lái)自非人類(lèi)哺乳動(dòng)物。在一個(gè)具體實(shí)施例中，ADSC是豬ADSC。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是貓，而在另一個(gè)具體實(shí)施例中，所治療的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物是狗。在再一個(gè)具體實(shí)施例中，在投與水凝膠(例如(但不限于)基于殼聚糖的水凝膠)之前、之后或與其同時(shí)投與ADSC。在此實(shí)施例的一個(gè)方面中，將ADSC分布于水凝膠(例如(但不限于)基于殼聚糖的水凝膠)內(nèi)。
[0145]實(shí)例
[0146]所述實(shí)例打算僅例示本發(fā)明且因而不應(yīng)視為以任何方式限制本發(fā)明，其還闡述并詳述上文所論述的本發(fā)明的各個(gè)方面。
[0147]實(shí)例I用脂肪組織衍生干細(xì)胞對(duì)犬尿失禁的實(shí)驗(yàn)性治療
[0148]材料和方法
[0149]動(dòng)物選擇
[0150]選擇具有明顯Π癥狀的雌性狗用于此研究。這些癥狀包括滴尿、自主控制損失和/或尿液灼傷皮膚炎。為確保個(gè)體的UI癥狀是由尿道缺陷所致，其必須展示對(duì)PPA治療的反應(yīng)性。每一所有者也通過(guò)簽署同意書(shū)來(lái)同意進(jìn)入此實(shí)驗(yàn)性研究，所述同意書(shū)指示(I)狗將經(jīng)受在后腿中測(cè)試注射ADSC以確保沒(méi)有免疫反應(yīng)，(2)對(duì)狗的PPA治療將取消若干天(最多I周)以使得可再次出現(xiàn)UI癥狀，(3)狗在經(jīng)受ADSC治療前至少3天必須展示UI癥狀再次出現(xiàn)，和⑷如果所有者不愿在取消PPA之后和/或在ADSC治療之后照顧狗，則狗可能需要住院，直到癥狀改良為止。
[0151]治療前檢查
[0152]在治療之前，對(duì)所有狗進(jìn)行身體檢查、常規(guī)臨床化學(xué)和血液學(xué)評(píng)估以及尿分析，以確保個(gè)體整體上健康且無(wú)原發(fā)性泌尿道感染。另外，將檢查后腿中的測(cè)試注射部位以確保無(wú)炎癥。
[0153]治療程序
[0154]在此研究中，UI的治療程序是將一百萬(wàn)到一千萬(wàn)個(gè)豬ADSC注射到尿道的括約肌區(qū)域中。利用允許可視化和注射二者的尿檢查儀來(lái)完成精確注射。懸浮液的體積和細(xì)胞數(shù)隨個(gè)體體重成比例地變化。例如,20kg狗每次注射將接受存于0.2ml PBS中的二百萬(wàn)個(gè)ADSC。通常,使用五百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/10千克體重。
[0155]治療后評(píng)估
[0156]所有者將每天通過(guò)觀察以下特性來(lái)實(shí)施評(píng)估:監(jiān)測(cè)注射部位的反應(yīng)體征，例如發(fā)紅、疼痛和發(fā)熱；監(jiān)測(cè)動(dòng)物的過(guò)敏性反應(yīng)和尿道堵塞的體征；動(dòng)物中任何其它不尋常體征，例如持續(xù)惡心、疲勞、嗜睡、食欲下降和排尿困難。
[0157]獸醫(yī)在治療后10天到15天、25天到30天和55天到60天實(shí)施評(píng)估。
[0158]實(shí)例2使用ADSC治療骨關(guān)節(jié)炎
[0159]治療程序
[0160]盡管OA實(shí)際上可折磨任一關(guān)節(jié)，但其最常與后肢膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)相關(guān)。將ADSC注射到所述關(guān)節(jié)中與注射皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)似，只是使用細(xì)胞懸浮液而非類(lèi)固醇。細(xì)胞懸浮液的體積和細(xì)胞數(shù)隨個(gè)體的大小成比例地變化。作為實(shí)例，20kg狗的每個(gè)關(guān)節(jié)將接受存于0.5mlPBS中的五百萬(wàn)個(gè)ADSC。在治療之后，勸告所有者每天牽繩遛狗30分鐘。允許狗繼續(xù)服用在ADSC治療前所服用的任何口服藥物。在ADSC治療前的任何關(guān)節(jié)內(nèi)治療都應(yīng)中斷。
[0161]治療后評(píng)估
[0162]動(dòng)物評(píng)估將納入病歷、身體檢查和跛足檢查，所述跛足檢查包括關(guān)節(jié)靈活性和操作時(shí)的疼痛記錄。臨床結(jié)果量度將基于動(dòng)物矯形外科評(píng)估，所述評(píng)估使用基于標(biāo)準(zhǔn)化問(wèn)卷的數(shù)值等級(jí)量表。將在狗通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射接受測(cè)試或?qū)φ罩苿┲?天與14天之間記錄所有者評(píng)估和動(dòng)物評(píng)估二者的基線結(jié)果。將需要在狗的關(guān)節(jié)內(nèi)注射后30天、60天和90天時(shí)到動(dòng)物診所進(jìn)行跟蹤訪視。在每次訪視時(shí)，將要求所有者完成作為從辛辛那提矯形外科失能指數(shù)改編的標(biāo)準(zhǔn)問(wèn)卷的一部分的數(shù)字等級(jí)量表(1(最好)到5(最差))，其包括對(duì)以下參數(shù)的評(píng)估:行走、跑、跳、突然轉(zhuǎn)向、從躺下起來(lái)、從站立躺下、爬階梯、下階梯、蹲下排尿或排便、早晨僵硬、晚上僵硬、在光滑地板上行走的難度和自主玩耍的意愿。
[0163] 實(shí)例3用ADSC治療患有糖尿病的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物
[0164]Pdxl是β細(xì)胞(產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞)發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)芐基因且PV-16是Pdxl的經(jīng)改造形式(例如，參見(jiàn)唐(Tang)等人，實(shí)驗(yàn)室研究(Laboratory Investigation)86:829-841(2006)；曹(Cao)等人，糖尿病(Diabetes) 53:3168-3178 (2004);唐等人，實(shí)驗(yàn)室研究 86:83-93 (2006))。此實(shí)例闡述的結(jié)果顯示，在用攜帶Pdx基因或PV-16的慢病毒轉(zhuǎn)染之后，ADSC可轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。然后可將這些細(xì)胞注射到門(mén)靜脈(如在島細(xì)胞細(xì)胞移植中)以幫助糖尿病個(gè)體。此治療需要約十億個(gè)細(xì)胞。
[0165]用Lent1-Pdxl、Lent1-PV-16 或 Lent1-GFP (GFP,綠色突光蛋白)轉(zhuǎn)染非人類(lèi)ADSC，其中所述Lent1-GFP充當(dāng)陰性對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后，在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。在21天后，經(jīng)GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的形態(tài)保持不變，而經(jīng)Pdxl或PV-16轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的形態(tài)顯著變化。另外，經(jīng)Pdxl或PV-16轉(zhuǎn)染的細(xì)胞似乎分泌粒狀材料。通過(guò)RT-PCR來(lái)證實(shí)并測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PdxlmRNA表達(dá)。使用西方墨點(diǎn)來(lái)證實(shí)Pdxl蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0166]還通過(guò)使用抗胰島素抗體對(duì)細(xì)胞染色來(lái)分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胰島素產(chǎn)生。
[0167]實(shí)例4使用再循環(huán)膠原酶分離ADSC的方法
[0168]用含有1%青霉素和鏈霉素的PBS沖洗從非人類(lèi)哺乳動(dòng)物分離的脂肪組織(即脂肪組織或抽脂脂肪)，將其切碎成小塊，然后以5:lv/v的膠原酶溶液:脂肪比率與含有
0.075%膠原酶IA型的溶液(西格瑪奧德里奇，圣路易斯，密蘇里州)混合。在37°C和劇烈振蕩下培育I小時(shí)后，然后在室溫下以220Xg將產(chǎn)物離心10分鐘。形成三個(gè)層:上部脂質(zhì)層、中間膠原酶層和底部細(xì)胞沉淀。收集中間層并藉助200 μ m過(guò)濾器過(guò)濾，接著進(jìn)行離心。使用穿流中的再循環(huán)膠原酶IA型消化新鮮脂肪組織(也降低購(gòu)買(mǎi)大量膠原酶的成本)，使用高于第一輪的比率(7:1，以體積計(jì))。
[0169] 實(shí)例5用超氧化物歧化酶保存ADSC
[0170]此實(shí)例闡述新脂肪組織保存溶液(ATPS)，其含有從哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞分離的超氧化物歧化酶以保存細(xì)胞活力。ATPS 是由 200mg/L KH2PO4、200mg/L KCl,2.16g/LNa2HP04 7H20、8g/L NaCl、30，000單位/L超氧化物歧化酶(SOD)和5g/L牛血清白蛋白(BSA)組成。
[0171]在4°C下使用ATPS將脂肪組織保存24hr和48hr。根據(jù)上文所述程序使用所保存的脂肪組織分離脂肪衍生干細(xì)胞。比較來(lái)自?xún)蓚€(gè)個(gè)體的得自ATPS所保存組織和剛采集的脂肪組織的脂肪衍生干細(xì)胞產(chǎn)率。與剛采集的脂肪組織相比，ADSC的產(chǎn)率在24小時(shí)為85%且在48小時(shí)為65%。此遠(yuǎn)高于不使用ATPS時(shí)獲得的產(chǎn)率，如松本(Matsumoto)等人，整形與改造外科學(xué).(2007) 120 (6): 1510-7所報(bào)道。
[0172]還測(cè)試ATPS對(duì)脂肪干細(xì)胞的保存。將IXlO6個(gè)非人類(lèi)脂肪衍生干細(xì)胞與ImlATPS混合并存儲(chǔ)在4°C下。在48小時(shí)后，執(zhí)行細(xì)胞活力測(cè)試(錐蟲(chóng)藍(lán)(trypan blue)方法)。結(jié)果指示，在用ATPS保存48小時(shí)后，少于5%的細(xì)胞受損。
[0173]實(shí)例6分離優(yōu)選ADSC群的方法
[0174]特定細(xì)胞類(lèi)型的有效且準(zhǔn)確分離是許多研究項(xiàng)目的關(guān)鍵方面。使用抗體進(jìn)行細(xì)胞分離并非新技術(shù)?！疤赃x”是用于從不同細(xì)胞類(lèi)型的混合物富集特定細(xì)胞群的免疫選擇方法，其已應(yīng)用了很長(zhǎng)時(shí)間。這種方法是基于與細(xì)胞培養(yǎng)皿結(jié)合的抗體的選擇能力。將多種細(xì)胞類(lèi)型的混合物在經(jīng)抗體涂覆的板上培養(yǎng)并允許結(jié)合較短時(shí)期。然后可從培養(yǎng)皿輕輕地洗脫非附著細(xì)胞(所述不結(jié)合抗體者)，從而使得可采集已結(jié)合細(xì)胞。這種方法有助于研發(fā)其它新技術(shù)，例如密度梯度分離和利用特定細(xì)胞類(lèi)型的獨(dú)特表面結(jié)合性質(zhì)的方法。磁珠技術(shù)的研發(fā)允許反復(fù)洗滌珠粒結(jié)合細(xì)胞，從而顯著改良潛在分離純度。各公司所用的順磁珠粒的大小和組成顯著不同且定期進(jìn)行進(jìn)一步精制/改良。
[0175]來(lái)源于脂肪組織消化的基質(zhì)血管成份是由許多類(lèi)型的細(xì)胞組成，例如干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和其它終末分化細(xì)胞。磁細(xì)胞系統(tǒng)提供優(yōu)良的磁珠粒標(biāo)記細(xì)胞分選。
[0176]根據(jù)制造商的方案通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析剛分離的ADSC的細(xì)胞表面抗原的表達(dá)。將細(xì)胞與存于50 μ I洗滌緩沖液(含有1%FBS和0.l%Na3N的PBS)中的一級(jí)抗體(表I)在冰上一起培育30分鐘，接著再與FITC偶聯(lián)的二級(jí)抗體(山羊抗IgG) —起培育。然后用洗滌緩沖液將細(xì)胞沖洗兩次，用存于PBS中的1%多聚甲醛固定，并通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選機(jī)(FACS Vantage SE ;必帝(Becton Dickinson))來(lái)分析。利用FlowJo軟件(樹(shù)星(Tree Star)公司，阿什蘭，俄勒岡州)分析結(jié)果。所分析細(xì)胞抗原為⑶13、⑶31、⑶34、⑶90、⑶105、⑶133、SSEA-1和端粒酶。表達(dá)水平呈現(xiàn)于表2中。
[0177]表1.此研究中所用抗體
[0178]
【權(quán)利要求】
1.一種脂肪組織衍生干細(xì)胞ADSC的用途，其用于制造用以治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的骨折的藥劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物選自由以下組成的群組:狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹和美洲駝。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述ADSC對(duì)于所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)是異種的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約1X1O5個(gè)ADSC/千克體重到約1 X1O8個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約5X 1O6個(gè)ADSC/千克體重到約5 X 1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約1XlO6個(gè)ADSC/千克體重到約1 X1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥劑是用于與骨形態(tài)發(fā)生蛋白一起投與。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥劑是用于在所述骨折部位投與。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中所述藥劑是以靜脈內(nèi)投與的方式投與ADSC。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中所述靜脈內(nèi)投與的ADSC是在約1X 1O5個(gè)ADSC/千克體重到約1 X 1O8個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其中所述靜脈內(nèi)投與的ADSC是在約5X1O6個(gè)ADSC/千克體重到約5 X1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的用途，其中所述靜脈內(nèi)投與的ADSC是在約1X1O6個(gè)ADSC/千克體重到約1 X1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述ADSC是豬ADSC。
14.一種脂肪組織衍生干細(xì)胞ADSC的用途，其用于制造用以治療非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的選自由以下組成的群組的病狀的藥劑:“干眼”病狀、慢性腎衰竭、急性腎衰竭和其組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物選自由以下組成的群組:狗、貓、馬、兔、豬、猴、狒狒、黑猩猩、猩猩、虎、獅、熊、獵豹和美洲馬它。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述ADSC對(duì)于所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)是異種的。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約1X1O5個(gè)ADSC/千克體重到約1 X 1O8個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約5X 1O6個(gè)ADSC/千克體重到約5 X 1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約1XlO6個(gè)ADSC/千克體重到約1X 1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
20.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述藥劑是用于靜脈內(nèi)投與。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約1XlO5個(gè)ADSC/千克體重到約1 X1O8個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約5X1O6個(gè)ADSC/千克體重到約5 X 1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的用途，其中所述藥劑是用于提供在約IXlO6個(gè)ADSC/千克體重到約1 X1O7個(gè)ADSC/千克體重的范圍內(nèi)的ADSC。
24.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述ADSC是豬ADSC。
25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述病狀為“干眼”病狀。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的用途，其中所述藥劑是用于投與到所述非人類(lèi)哺乳動(dòng)物的淚腺周?chē)鷧^(qū)域(perilacrimal area)中。
27.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述病狀為慢性腎衰竭。
28.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述病狀為急性腎衰竭。
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK103830275SQ201310239434
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年6月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月21日
【發(fā)明者】林慶順, 呂福泰, 林桂廷 申請(qǐng)人:瑟弗維股份有限公司