一種基于糖基化酪蛋白的茶多酚納米膠囊及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于糖基化酪蛋白的茶多酚(表沒食子兒茶素沒食子酸酯，EGCG)納米膠囊，可抑制高濃度多酚導(dǎo)致的酪蛋白聚集與沉淀。本發(fā)明的步驟如下：將酪蛋白與葡聚糖干熱處理后超濾去除游離的反應(yīng)物制得糖基化酪蛋白，將其與EGCG物理混合，即得結(jié)合有EGCG的納米膠囊。本發(fā)明制得的納米膠囊對(duì)EGCG的包封率最高可達(dá)90％，平均粒徑為70～140nn，貯藏10天后EGCG的保留率為60％～70％，貯存期間粒徑變化較小，且在EGCG載量較高的情況下仍能維持體系的均一分散狀態(tài)，無絮狀沉淀生成。本發(fā)明顯著提高了酪蛋白與EGCG的結(jié)合率，可作為EGCG等多酚類物質(zhì)的納米載體，廣泛應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)。
【專利說明】一種基于糖基化酪蛋白的茶多酚納米膠囊及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種基于糖基化酪蛋白的茶多酚納米膠囊及其制備方法，本發(fā)明屬于功能性保健 食品納米膠囊【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 茶多酚，又名茶單寧、兒茶酸，屬多酚類物質(zhì)，是茶葉中所含有的一類多羥基酚類 化合物的總稱。茶多酚中最重要成分是黃烷醇類的多種兒茶素，其中沒食子兒茶素沒食 子酸酯（EGCG)是含量最高也是最為重要的一種組分，具有高效的抗氧化、抗菌、抗癌、抗輻 射、提高機(jī)體免疫力等作用。然而由于EGCG分子結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)酚羥基，導(dǎo)致其易受光、 氧、水分、重金屬等作用而降解，且脂溶性較弱，穩(wěn)定性差，并且在堿性溶液中活性大大降 低，故在實(shí)際應(yīng)用中常常受到限制。目前普遍采用微膠囊技術(shù)對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)行包埋，不僅能 有效避免貯運(yùn)環(huán)境中光、氧等因素的不利影響，增強(qiáng)活性物質(zhì)在貨架期和生物體內(nèi)的穩(wěn)定 性，同時(shí)微膠囊結(jié)構(gòu)的緩釋作用能延長(zhǎng)該物質(zhì)的生物半衰期，實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸，從而提高生物 利用率，強(qiáng)化其生理活性。
[0003] 現(xiàn)有研究過程中使用有機(jī)溶劑，或者非食品級(jí)合成聚合電解質(zhì)，成為食品主要的 安全性問題。開發(fā)簡(jiǎn)單、安全且具有高效傳輸系統(tǒng)的納米膠囊，是目前的研究熱點(diǎn)?；?天然蛋白的納米載體，既具有良好的生物相容性和生物降解性，又具有納米尺寸效應(yīng)，適合 作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)載體，所以有著良好的應(yīng)用前景。其中，酪蛋白可通過自組裝形成膠束，其外 親水、內(nèi)疏水結(jié)構(gòu)可用于輸送水溶性、脂溶性物質(zhì)，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的天然載體。而多酚與富含 脯氨酸的蛋白有很強(qiáng)的親和性，在水溶液中與其結(jié)合形成可溶或者不可溶復(fù)合物，因此是 EGCG較為理想的載體。然而天然酪蛋白在等電點(diǎn)附近溶解性差，且對(duì)EGCG的載量不高，高 濃度的EGCG使酪蛋白凝聚沉淀從而無法獲得具有良好穩(wěn)定性的納米膠囊。通過美拉德反 應(yīng)定向接枝獲得的糖基化酪蛋白賦予其更加卓越的界面性質(zhì)，并且在低于酪蛋白臨界膠束 濃度條件下可通過自組裝形成膠束，接枝多糖的無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)特質(zhì)有效改善了酪蛋白的物 理穩(wěn)定性，因此在較高EGCG載量下，不會(huì)生成大的聚集體，并且良好的貯藏穩(wěn)定性。與此同 時(shí)，相比于天然酪蛋白，糖基化酪蛋白對(duì)EGCG的載量顯著提高。因此可將其作為構(gòu)建EGCG 等水溶性營(yíng)養(yǎng)素的更為理想的載體。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)酪蛋白的糖基化改性方法，使酪蛋白對(duì)EGCG的結(jié)合 率和貯藏穩(wěn)定性顯著提高。選擇美拉德定向接枝的糖基化酪蛋白為壁材，成分簡(jiǎn)單，體系性 質(zhì)穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)了 EGCG的保護(hù)和貯藏。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，具有高結(jié)合率和良好貯藏穩(wěn)定性的EGCG納米膠囊，由以下 成分組成：
[0006] 芯材為EGCG ;壁材分別為酪蛋白、糖基化酪蛋白；其中，芯材與壁材的摩爾比 為0 : 1?256 : 1;所述的糖基化酪蛋白為酪蛋白與葡聚糖干熱美拉德反應(yīng)定向接枝 產(chǎn)物經(jīng)超濾分離去除未參與反應(yīng)的酪蛋白與葡聚糖制得；所述的葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量為 200, 000。
[0007] 本發(fā)明所采用的另一技術(shù)方案是，上述納米膠囊的制備方法，按以下步驟進(jìn)行：
[0008] a.采用干熱美拉德反應(yīng)定向接枝制備糖基化酪蛋白：將酪蛋白和葡聚糖（w/w = 1/7)溶于pH7. 0,0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液中獲得酪蛋白濃度為8g/L的溶液，然后冷凍干燥； 將干燥后的樣品磨細(xì)，過120目篩，反應(yīng)（60°C，相對(duì)濕度為78%，pH7. 0) 12?24h ;超濾（膜 的截留分子量為IOOkDa)去除未參與糖基化反應(yīng)的酪蛋白及葡聚糖，即得糖基化酪蛋白。
[0009] b.采用物理混合法制備EGCG納米膠囊：常溫下將酪蛋白及上述糖基化酪蛋白溶 于0. 2mol/L、pH7. 0的磷酸鹽緩沖液中，其中酪蛋白濃度均為lg/L ;將溶有不同濃度的EGCG 的醋酸鹽緩沖液（PH4. 5)與蛋白溶液以1 : 19 (v/v)混合，輔以攪拌1?IOmin (轉(zhuǎn)速為 400?800r/min)，即得EGCG納米膠囊。
[0010] c.采用高效液相色譜法及動(dòng)態(tài)光散射法分析EGCG納米膠囊的貯藏穩(wěn)定性：將不 同芯壁摩爾比的EGCG-酪蛋白、EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊分別充滿N2，并于4°C冰箱中 貯藏若干天，利用高效液相色譜法及動(dòng)態(tài)光散射法分析其保留率及平均粒徑變化率。
[0011] 本發(fā)明中，相較于EGCG-酪蛋白納米膠囊，EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊的壁芯摩 爾比有顯著提高，且高濃度EGCG不會(huì)造成糖基化蛋白的聚集和沉淀，因此體系仍呈現(xiàn)澄清 透明狀。納米膠囊的平均粒徑在80?150nm之間，包埋率高于90%，且EGCG-糖基化酪蛋 白納米膠囊在貯藏10天期間的保留率及粒徑變化率均優(yōu)于EGCG-酪蛋白納米膠囊。對(duì)酪 蛋白通過美拉德反應(yīng)進(jìn)行糖基化修飾，不僅改善了酪蛋白的水溶性、乳化性，而且有效提高 了對(duì)EGCG的載量和體系的貯存穩(wěn)定性。
[0012] 粒徑的測(cè)定：采用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測(cè)定，測(cè)定溫度25°C。
[0013] 包封率的測(cè)定：取納米膠囊500 μ L，用2mL的離心超濾管（截留分子量3K)進(jìn)行 離心，優(yōu)化離心條件為2000 X g，常溫下離心30min。采用高效液相色譜法測(cè)定游離EGCG含 量，流動(dòng)相為甲醇+〇· 1 %乙酸，色譜柱為C18反相柱（5 μ m，39 X 150mm，Atlantis, Waters, 美國(guó)）。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為實(shí)施例2制備的EGCG-酪蛋白納米膠囊在貯藏期間的平均粒徑變化及EGCG 的保留率隨時(shí)間的變化。
[0015] 圖2為實(shí)施例3制備的EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊在貯藏期間的平均粒徑變化 及EGCG的保留率隨時(shí)間的變化。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 準(zhǔn)確稱取酪蛋白0· 8g、葡聚糖（相對(duì)分子質(zhì)量20, 000)5. 6g溶于IOOmLO. 2mol/L 的磷酸鹽緩沖液中，攪拌，制成酪蛋白質(zhì)量濃度為8g/L的均勻溶液，冷凍干燥24h。干燥后 的樣品磨細(xì)，過120目篩，置于培養(yǎng)皿中，用刺孔的鋁箔封口后進(jìn)行反應(yīng)（60°C，相對(duì)濕度為 78%，pH為7. 0)反應(yīng)20h時(shí)后冷卻終止反應(yīng)。用截流分子量為IOOkDa的超濾膜反復(fù)超濾 三次去除未反應(yīng)的酪蛋白及多糖，收集大于IOOkDa的組分冷凍干燥，即得糖基化酪蛋白。
[0018] 實(shí)施例2
[0019] 將天然酪蛋白溶于磷酸鹽緩沖液中（酪蛋白含量為8g/L)，攪拌若干小時(shí)后，離心 并取上層清液，最終確定酪蛋白含量為lg/L。將溶于pH4.5醋酸鹽緩沖液的不同濃度的 EGCG分別與酪蛋白溶液混合（v/v，1 : 19)，混合Imin (轉(zhuǎn)速為600r/min)即得EGCG-酪蛋 白納米膠囊。測(cè)得平均粒徑75?150nm，包封率27 %?85%。
[0020] 實(shí)施例3
[0021] 將上述糖基化蛋白溶于磷酸鹽緩沖液（酪蛋白含量為lg/L)。將溶于pH4. 5醋酸鹽 緩沖液的不同濃度的EGCG分別與糖基化酪蛋白溶液混合（v/V，1 : 19)，混合Imin (轉(zhuǎn)速為 600r/min)即得EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊。測(cè)得平均粒徑70?140nm，包封率50%? 90%。
[0022] 實(shí)施例4
[0023] 本實(shí)例為對(duì)本發(fā)明的EGCG納米膠囊的貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)。
[0024] 將2mL不同芯壁摩爾比的EGCG-酪蛋白納米膠囊、EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊 分別充滿N 2，并置于4°C冰箱中保藏10天左右，平行取樣6份。貯藏0、1、2、4、8、10天期間， 利用高相液相色譜法和動(dòng)態(tài)光散射法分析EGCG的保留率及納米膠囊的平均粒徑變化率。
[0025] 包封率及保留率由以下公式測(cè)定：

【權(quán)利要求】
1. 一種茶多酚（沒食子兒茶素沒食子酸酯，EGCG)納米膠囊，由以下成份組成：芯材為 EGCG;壁材為葡聚糖修飾的糖基化酪蛋白；其中，芯材與壁材的摩爾比為0 : 1?256 : 1。
2. 按照權(quán)利要求1所述的EGCG納米膠囊，其特征在于，所述的葡聚糖修飾的糖基化酪 蛋白為干熱美拉德反應(yīng)定向接枝產(chǎn)物經(jīng)超濾分離制得。
3. 按照權(quán)利要求1所述的EGCG納米膠囊，其特征在于，所述的葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量為 20, 000。
4. 一種權(quán)利要求1所述EGCG納米膠囊的制備方法，其特征在于，該方法按以下步驟進(jìn) 行： a. 采用物理混合制備EGCG-酪蛋白納米膠囊：常溫下將酪蛋白溶于0. 2mg/mL、pH7. 0 磷酸鹽緩沖液中，其中蛋白濃度為1.0mg/mL;將溶于醋酸鹽緩沖液（pH4. 5)中不同濃度 的EGCG和酪蛋白溶液以體積比1 : 19混合1?10min(轉(zhuǎn)速為400?800r/min)，即得 EGCG-酪蛋白納米膠囊。 b. 采用干熱美拉德反應(yīng)定向接枝制備糖基化酪蛋白：將酪蛋白和葡聚糖（l/7，m/m)溶 于磷酸鹽緩沖液中獲得酪蛋白濃度為8g/L的溶液，然后冷凍干燥；將干燥后的樣品磨細(xì)， 過120目篩，反應(yīng)（601：，相對(duì)濕度為78%，？!17.0)12?2411 ;采用超濾裝置（膜的截留分子 量為lOOkDa)去除未反應(yīng)的酪蛋白及葡聚糖，即得糖基化酪蛋白。 c. 采用物理混合制備EGCG-糖基化酪蛋白納米膠囊：方法同a。
5. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，該體系可有效包埋EGCG，和EGCG-酪 蛋白納米膠囊相比，糖基化酪蛋白可與高濃度的EGCG仍形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，并且具有 更高的結(jié)合率及貯藏穩(wěn)定性。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104273521SQ201310281806
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月3日
【發(fā)明者】夏書芹, 薛瑾, 譚晨, 張曉鳴 申請(qǐng)人:江南大學(xué)