包含聚合物和生物活性分子的綴合物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含聚合物和生物活性分子（例如GLP-1受體激動劑）的綴合物及其用途，更特別地包含二價或更多價聚合物和兩個或更多個生物活性分子的綴合物。
【專利說明】包含聚合物和生物活性分子的綴合物及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及包含聚合物和生物活性分子（例如 GLP-I受體激動劑）的綴合物，更特別地包含二價或更多價聚合物和兩個或更多個生物活 性分子的綴合物。本發(fā)明還涉及所述綴合物用于治療疾病和/或減肥的用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中廣泛存在通過形成二聚體的方式來加強配體和受體之間的作用強度的 例子（ChemBi〇-Chem6, 358-364, 2005 ;Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2754-2794,1998)，研究人 員也嘗試采用藥物的二聚體來增加藥物和受體之間的結(jié)合強度和療效。2個Exendin-4分 子通過一個小分子連接在一起的產(chǎn)物，比單獨1個Exendin-4與受體的結(jié)合強度強3. 5倍 (Bioconjugate Chem. 22,625-632,2011)。但是，這樣的二聚體存在種種缺陷，例如藥物活 性分子彼此之間由于空間位阻彼此影響，使得藥效難以獲得預(yù)期的提高。
[0003] 除了小分子可以用來作連接基團(tuán)，雙官能團(tuán)聚乙二醇因為具備和兩個相同或不同 的基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)的能力，也被研究者用作連接基團(tuán)。如脂肪族環(huán)酯在催化劑的作用下，和雙 羥基聚乙二醇進(jìn)行開環(huán)聚合，從而制備脂肪族聚酯-聚乙二醇-脂肪族聚酯三嵌段共聚物， 再在縮合劑的作用下，和紫杉醇進(jìn)行酯化反應(yīng)，從而得到紫杉醇鍵合物（CN1961962)。
[0004] 雙官能團(tuán)的聚乙二醇還被用來連接相同或者不同的具有生物活性的分子，如葉酸 類化合物，從而制備葉酸類化合物介導(dǎo)的主動靶向載體（CN1733309)。
[0005] 徐明波等公布了聚乙二醇修飾雙價生長激素和降鈣素（CN102190719， CN102190721)，其中聚乙二醇雙端活化（優(yōu)選醛或者酮），然后和多肽或蛋白藥物的 游離氨基共價結(jié)合從而形成雙價的柔性分子。Thompson Robert也在EP0575545B1， W092016221A1PEGYLATI0N OF POLYPEPTIDES中公布了聚合物（如聚乙二醇）雙端共價連接 相同或者不同的多肽（如腫瘤壞死因子（TNF)，白介素-1，白介素-2等多肽）的方法。
[0006] 1985年發(fā)現(xiàn)了 一種腸激素胰高血糖素樣肽-I (Glucagon-like peptide-1, GLP-1)，其是進(jìn)食后由胰高血糖素原基因表達(dá)，主要在腸道黏膜L-細(xì)胞分泌的一種產(chǎn) 物，它能刺激胰島￠-細(xì)胞分泌胰島素 （J Med 〇^111，47,4128-4134,2004)，對穩(wěn)定血糖 水平有重要作用。外源給予GLP-I能使II型糖尿病患者的血糖水平正?；―iabetes Care，15,270-276,1992 ;Lancet，359,824-830, 2002 ;Endoer. Rev，16,390-410,1996 ; Diabetologia，28, 565-573,1985)。但 GLP-I 在體內(nèi)很容易被二肽基肽酶（DPPIV)降解， 半衰期不足2分鐘，幾乎不能成為有效的抗糖尿病藥物。因此，研究人員開發(fā)了 GLP-I受體 激動劑，以模擬GLP-I的糖代謝調(diào)節(jié)作用。例如，Exendin-4是在毒蜥（美國亞利桑那州和 北墨西哥州內(nèi)陸爬行動物）的唾液分泌物中發(fā)現(xiàn)的多肽（J. BiOl. Chem，265, 20259-20262， 1990 J. BiOl. Chem，267, 7402-7405,1992)，與胰高血糖素樣肽-I (GLP-1 (7-36))具有高度 同源性（53% )。研究表明，Exendin-4同樣可以與GLP-I受體結(jié)合，并在藥理上表現(xiàn)出與 GLP-I相類似的激動作用。
[0007] 為了進(jìn)一步改進(jìn)GLP-I受體激動劑的效果，科研人員對GLP-I受體激動劑的聚合 物修飾也進(jìn)行了一系列研究。楊和普里克特（CN1372570A)的研究證明了 Exendin-4主要 是通過腎清除來代謝，因此他們利用分子量范圍在500至20, OOO道爾頓（Dalton，Da)的聚 乙二醇對Exendin-4進(jìn)行修飾。包文超、徐宏景、余剛、左亞軍（CN101125207A)則利用分子 量范圍在20kDa至50kDa的聚乙二醇對Exendin-4進(jìn)行了氨基修飾。
[0008] W02010/121559公開了 一種新型Exendin變體，其中具體公開了 Exendin變體與聚 乙二醇的綴合物及其用于治療II型糖尿病的用途，其通過引用以整體并入本文。
[0009] 但是，現(xiàn)在已有的GLP-I受體激動劑以及各種修飾形式仍有一些缺點，包括效果 仍然不夠理想，在體內(nèi)使用時給藥頻率較高，給患者身體、心理和經(jīng)濟帶來較大的負(fù)擔(dān)，限 制了患者用藥依從性，無法廣泛應(yīng)用。另外，有一些GLP-I受體激動劑的修飾形式雖然也 可達(dá)到一定的效果，但是具有延遲效應(yīng)，也就是說在施用后需要經(jīng)過一段時間才能起效，這 使得對象血糖水平出現(xiàn)較大波動，不能非常平穩(wěn)的控制血糖水平。因此，仍然需要有新的 GLP-I受體激動劑及其聚合物修飾形式。
[0010] 此外，在世界范圍內(nèi)肥胖發(fā)病率逐年增加，WHO已將其定位為一種重要的疾病，它 已成為世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題。國內(nèi)調(diào)查顯示，2002年我國成年人超重和肥胖發(fā) 生率分別為22. 8%和7. 1 %，超重和肥胖已經(jīng)影響到2億7千萬人口，肥胖癥及其相關(guān)疾病 治療的總費用高達(dá)100億人民幣/年，這在大中城市尤其明顯。在美國，64. 5%的人群處于 超重、肥胖狀態(tài)，防治肥胖癥及其相關(guān)并發(fā)癥的費用迅速增加，2003年花費達(dá)750億美元， 2006年花費則增至907億美元，2009年報道每年花費高達(dá)1470億美元。因此，一直存在對 減肥藥物的需求。
[0011] 奧利司他，是目前全球唯一的OTC減肥藥，全球超過40, 000, 000人服用并成功減 重，是目前最暢銷的減肥產(chǎn)品。但是，奧利司他具有種種缺點，例如，其減肥效果對某些人群 不顯著，而且其需要每天隨餐或者餐后服用，患者依從性較差。而且，其也存在安全性風(fēng)險。 美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)于2010年5月警告其存在可能引起嚴(yán)重肝損害的風(fēng)險。因 此，需要開發(fā)其他機制的新的減肥藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)，兩個或更多個GLP-I受體激動劑與二價或更多價聚合 物相綴合形成的綴合物能夠特別有效地作用于GLP-I受體，因而特別有效地降低血糖和/ 或治療糖尿病。
[0013] 另外，本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的綴合物具有出人意料的減肥效果。相比于 市場上目前唯一的OTC減肥藥奧利司他，本發(fā)明的綴合物至少表現(xiàn)出以下優(yōu)點：減肥效果 更好，持續(xù)作用時間更長（也就是說，用藥頻率更低），劑量更小從而更加安全。另外，由于 優(yōu)先減少腹部皮下脂肪，本發(fā)明的綴合物更是滿足了塑形、美體等方面的需求，獲得了出人 意料的技術(shù)效果。
[0014] 在一個方面，本發(fā)明涉及包含聚合物和生物活性分子的綴合物，其中所述聚合物 為與兩個或更多個生物活性分子相綴合的二價或更多價聚合物。特別地，所述生物活性分 子各自獨立地選自GLP-I受體激動劑。
[0015] 在另一個方面，本發(fā)明涉及具有通式Y(jié)-(Z「X上的綴合物，其中各個Xi表示相同或 不同的生物活性分子，各個Z i表示相同或不同的連接基，Y表示聚合物，n是大于1的整數(shù)， i是1至n的整數(shù)。特別地，所述生物活性分子各自獨立地選自GLP-I受體激動劑。
[0016] 在又一個方面，本發(fā)明涉及制備本發(fā)明綴合物的方法，其包括使所述生物活性分 子與經(jīng)活化的聚合物相接觸。
[0017] 在又一個方面，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其包含有效量的本發(fā)明綴合物，以及任 選地藥學(xué)上可接受的載體。
[0018] 在又一個方面，本發(fā)明還涉及試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的綴合物和/或根據(jù)本 發(fā)明的藥物組合物，以及使用說明書。
[0019] 本發(fā)明人還出人意料地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的綴合物大大降低了維持所需效果需要的給 藥頻率。在某些實施方案中，本發(fā)明的綴合物每至少30天、每至少25天、每至少20天、每 至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、每至少6天、每至少5天、 每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述對象施用。在某些實施方案 中，本發(fā)明的綴合物每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、 每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、 每至多2天、每至多1天一次向所述對象施用。
[0020] 在又一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的對象中降低血糖的方法，其包括向所 述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，所述方法包括每至少30 天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至 少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向 所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。在某些實施方案中，所述方法 包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每 至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每 至多1天一次向所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。
[0021] 在又一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的對象中治療糖尿?。ㄌ貏e是II型糖尿 ?。┑姆椒ǎ浒ㄏ蛩鰧ο笫┯帽景l(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地， 所述方法包括每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少 9天、每至少8天、每至少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2 天、每至少1天一次向所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。在某些 實施方案中，所述方法包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多 10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多 3天、每至多2天、每至多1天一次向所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組 合物。
[0022] 在又一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的對象中減輕體重的方法，其包括向所 述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，所述方法包括每至少30 天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至 少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向 所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。在某些實施方案中，所述方法 包括每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每 至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每 至多1天一次向所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物。在一些實施方 案中，體重的減輕是通過減少脂肪實現(xiàn)的，更優(yōu)選選擇性減少腹部皮下脂肪。在另一些實施 方案中，體重的減輕是通過抑制食欲實現(xiàn)的。
[0023] 在又一個方面，本發(fā)明提供了在有此需要的對象中減少脂肪（例如腹部皮下脂肪 和/或腹腔內(nèi)脂肪）的方法，其包括向所述對象施用本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物 組合物。
[0024] 在又一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物在制備 用于在有此需要的對象中降低血糖的藥物中的用途。
[0025] 在又一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物在制備 用于治療糖尿?。ㄌ貏e是II型糖尿病）的藥物中的用途。
[0026] 在又一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物在制備 用于在有此需要的對象中減輕體重的藥物中的用途。在一些實施方案中，體重的減輕是通 過減少脂肪實現(xiàn)的，更優(yōu)選選擇性減少腹部皮下脂肪。在另一些實施方案中，體重的減輕是 通過抑制食欲實現(xiàn)的。
[0027] 在又一個方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的綴合物和/或本發(fā)明的藥物組合物在制備 用于在有此需要的對象中減少脂肪（例如腹部皮下脂肪和/或腹腔內(nèi)脂肪）的藥物中的用 途。
[0028] 在又一個方面，本發(fā)明提供了綴合物和/或藥物組合物，其用于在有此需要的對 象中降低血糖。
[0029] 在又一個方面，本發(fā)明提供了綴合物和/或藥物組合物，其用于治療糖尿?。ㄌ貏e 是II型糖尿病）。
[0030] 在又一個方面，本發(fā)明提供了綴合物和/或藥物組合物，其用于在有此需要的對 象中減輕體重。在一些實施方案中，體重的減輕是通過減少脂肪實現(xiàn)的，更優(yōu)選選擇性減少 腹部皮下脂肪。在另一些實施方案中，體重的減輕是通過抑制食欲實現(xiàn)的。
[0031] 在又一個方面，本發(fā)明提供了綴合物和/或藥物組合物，其用于在有此需要的對 象中減少脂肪（例如腹部皮下脂肪和/或腹腔內(nèi)脂肪）。
[0032] 本發(fā)明的綴合物大大降低了給藥頻率，增加了對象的順從性。另外，本發(fā)明的綴合 物在施用后，立即或者很快起效，沒有延遲，減少了對象中血糖水平的波動。本發(fā)明的綴合 物還能夠在對象中顯著抑制食欲，顯著減少脂肪（特別是腹部皮下脂肪），從而實現(xiàn)減輕體 重的作用。

【專利附圖】

【附圖說明】 圖1為雙61611(1;[11-4變體聚乙二醇綴合物？￡6401(-(￡1611(1;[11-4-05^39)2的分離純化圖。 圖 2 為 PEG40K-(Exendin-4-Cys39)2 HPLC 分析圖。 圖3比較了 Exendin-4和PB105樣品的體外生物活性檢測。 圖4顯示PB-108和PB-193在恒河猴中的藥時曲線。 圖5顯示PB-193給藥后對肥胖恒河猴動物攝食量的影響。 圖6顯示PB-193給藥對肥胖恒河猴體重隨時間變化的影響。 圖7顯示PB-193給藥結(jié)束后肥胖恒河猴的體重降低。 圖8顯示PB-193給藥后對肥胖恒河猴腹部皮下脂肪體積的影響。 圖9顯示PB-193給藥后對肥胖恒河猴腹內(nèi)脂肪體積的影響。 圖10顯示PB-193單次給藥后對肥胖恒河猴空腹血糖的影響。 圖11顯示PB-193單次給藥后肥胖恒河猴空腹血糖下降率。

【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明涉及包含聚合物和生物活性分子的綴合物，其中所述聚合物為與兩個或更 多個生物活性分子相綴合的二價或更多價聚合物。優(yōu)選地，所述生物活性分子各自獨立地 選自GLP-I受體激動劑。
[0034] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及包含二價聚合物和兩個生物活性分子的綴合物。 優(yōu)選地，所述兩個生物活性分子各自獨立地選自GLP-I受體激動劑。
[0035] 在一些實施方案中，所述GLP-I受體激動劑選自：GLP-I生物活性形式及其功 能性變體（例如GLP-I- (7-37)和GLP-I- (7-36)酰胺）、exendin-4及其功能性變體、 exendin-3及其功能性變體、albiglutide及其功能性變體、Iiraglutide及其功能性變體 和taspoglutide及其功能性變體。
[0036] 在一些優(yōu)選實施方案中，所述GLP-I受體激動劑選自exendin-4功能性變體 和exendin-3功能性變體，所述功能性變體相比于其野生型序列（例如，exendin-4和 exendin-3的野生型序列分別如SEQ ID NO :1和2所示，參見表1)具有包含一個或更多個 半胱氨酸替換的氨基酸序列。特別地，所述半胱氨酸替換中至少一個位于氨基酸序列的C 末端，優(yōu)選地位于C末端的10個氨基酸、9個氨基酸、8個氨基酸、7個氨基酸、6個氨基酸、 5個氨基酸、4個氨基酸、3個氨基酸、2個氨基酸或者1個氨基酸中，最優(yōu)選位于C末端最后 一個氨基酸。

【權(quán)利要求】
1. 包含聚合物和GLP-1受體激動劑的綴合物，其中所述聚合物為與兩個或更多個 GLP-1受體激動劑相綴合的二價或更多價聚合物。
2. 具有通式Υ_(Ζ^)η的綴合物，其中各個\表示相同或不同的GLP-1受體激動劑， 各個Zi表示相同或不同的連接基，Y表示聚合物，η是大于1的整數(shù)，i是1至η的整數(shù)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的綴合物，其中所述GLP-1受體激動劑選自：GLP-1生物活性形 式及其功能性變體、exendin-4及其功能性變體和exendin-3及其功能性變體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的綴合物，其中所述GLP-1受體激動劑選自：exendin-3、 exendin-4、exendin-3功能性變體和exendin-4功能性變體， 其中所述功能性變體相比于其野生型序列具有包含一個或更多個半胱氨酸替換的氨 基酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4的綴合物，其中所述半胱氨酸替換中至少一個位于氨基酸序列的C 末端，優(yōu)選地位于C末端的10個氨基酸、9個氨基酸、8個氨基酸、7個氨基酸、6個氨基酸、 5個氨基酸、4個氨基酸、3個氨基酸、2個氨基酸或者1個氨基酸中，最優(yōu)選位于C末端最后 一個氨基酸。
6. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的綴合物，其中所述GLP-1受體激動劑為具有SEQ ID NO :3 所示序列的exendin-4功能性變體。
7. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的綴合物，其中所述聚合物選自：多糖、多肽、聚亞烷基二 醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚惡唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲 基丙烯酰胺、馬來酸丙烯酸共聚物、聚酯、聚縮醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亞氨碳酸酯、聚酰 胺、乙烯基醚馬來酸酐共聚物、苯乙烯馬來酸酐共聚物以及以上聚合物的共聚物，優(yōu)選地所 述聚合物選自聚亞烷基二醇，更優(yōu)選地所述聚合物是聚乙二醇（PEG)。
8. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的綴合物，其中所述聚合物的分子量為2kDa至50kDa，優(yōu)選 3kDa 至 40kDa，更優(yōu)選 4kDa 至 35kDa，還優(yōu)選 5kDa 至 30kDa，例如 5kDa、10kDa、15kDa、20kDa、 25kDa、30kDa、35kDa、40kDa和45kDa以及上述各分子量值之間的任意值。
9. 根據(jù)前述任一權(quán)利要求的綴合物，其中所述聚合物是被活化的從而與所述GLP-1受 體激動劑相綴合，優(yōu)選地所述聚合物為經(jīng)修飾的帶有活化基團(tuán)的聚合物，使得所述聚合物 通過所述活化基團(tuán)與所述GLP-1受體激動劑相綴合，更優(yōu)選地所述活化基團(tuán)選自：馬來酰 亞胺、齒素、乙稀基諷、-硫鍵、疏基、醒基、撰基、〇 _取代輕氣、活性醋、稀基、塊基、置氣基以 及其他具有高化學(xué)反應(yīng)活性的基團(tuán)。
10. 制備前述任一權(quán)利要求所述綴合物的方法，其包括使所述GLP-1受體激動劑與經(jīng) 活化的聚合物相接觸。
11. 藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-9中任一項的綴合物，以及任選地藥學(xué)上 可接受的載體。
12. 試劑盒，其包含權(quán)利要求1-9中任一項的綴合物和/或權(quán)利要求11的組合物，以及 使用說明書。
13. -種降低血糖的方法，其包括向有此需要的對象施用權(quán)利要求1-9中任一項的綴 合物和/或權(quán)利要求11的組合物。
14. 一種治療糖尿病的方法，其包括向有此需要的對象施用權(quán)利要求1-9中任一項的 綴合物和/或權(quán)利要求11的組合物。
【文檔編號】A61K38/22GK104277104SQ201310284588
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月8日
【發(fā)明者】徐敏, 周向軍, 黃國鋒, 張映輝, 呂瑋, 羅小蘇, 侯銀菊 申請人:派格生物醫(yī)藥(蘇州)有限公司