一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種外構(gòu)建三維立體組織的方法:分離培養(yǎng)上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞;將小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架置入肌細(xì)胞懸液中,震蕩復(fù)合完成后,繼續(xù)培養(yǎng);將上皮細(xì)胞懸液滴在經(jīng)步驟2處理得到后的支架的肌細(xì)胞層上,繼續(xù)培養(yǎng)得到三維立體組織。該方法采用舌粘膜上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞,取材方便,能夠在較短的時間內(nèi)擴增較多的數(shù)量,滿足應(yīng)用的需要;采用震蕩的方法使肌細(xì)胞與小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架復(fù)合,能夠使肌細(xì)胞大量浸潤至支架內(nèi)部且分布較均勻,同時在不明顯破壞支架的前提下,可以使支架盡可能的松散,更利于養(yǎng)分滲入和新生血管生成;可以構(gòu)建可用于組織工程化尿道的三維立體組織。
【專利說明】一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組織工程【技術(shù)領(lǐng)域】,尤其涉及一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法,以及該方法構(gòu)建的三維立體組織。
【背景技術(shù)】
[0002]先天性或獲得性尿道疾病的手術(shù)修復(fù)是泌尿外科領(lǐng)域不斷探索的難題之一。組織工程技術(shù)的發(fā)展為尿道狹窄的修復(fù)提供了新的理念。其中脫細(xì)胞基質(zhì)作為細(xì)胞再生的支架是組織工程的一個重要內(nèi)容。目前對于脫細(xì)胞基質(zhì)研究最多的為小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)(SIS),并應(yīng)用于臨床尿道修復(fù),已取得較好效果。
[0003]小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)是一種取材于豬小腸的異體組織,制作時去除小腸的黏膜層、漿膜層以及肌層,從而形成厚0.1cm的膜狀組織,其中含有膠原成分以及一些促進(jìn)組織再生的生長因子,并且其與細(xì)胞外基質(zhì)十分接近,而有利于細(xì)胞的粘附和生長,最大優(yōu)點是沒有免疫原性。以往研究已證實其可作為一種良好的支架材料促進(jìn)尿道修補處的上皮再生以及新生血管的形成,目前已作為一種產(chǎn)業(yè)化的成品。利用SIS進(jìn)行尿道修復(fù)重建時可以明顯縮短手術(shù)時間并可避免自體取的一些并發(fā)癥(Yue-Min Xu, Qiang Fu, Ying-LongSajJ1ngZhangjLu-Jie Song,Chao Feng.1nternat1nal Journal of Urology,2013,20:622-629)。
[0004]目前常選擇4層交迭SIS作為支架。但是4層SIS支架目前修復(fù)長段尿道缺損效果不理想,究其原因為單純的長段SIS在體內(nèi)不能保證充足的血供,且新生血管不能快速形成。而將種子細(xì)胞在體外與支架復(fù)合能夠促進(jìn)新生血管的快速形成(H Orabi, TAbouShwarebj Y Zhang,JJ.Yooj A Atala.Cell-Seeded Tubularized Scaffolds forReconstruct1n of Long Urethral Defects:A Preclinical Study.2013,63,531 - 538)。
[0005]而對于應(yīng)用于尿道組織工程的種子細(xì)胞,傳統(tǒng)最常見的是采用尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,但是這種種子細(xì)胞的獲取常常需要膀胱活檢或切開獲得,取材方式比較不方便。而干細(xì)胞作為種子細(xì)胞存在腫瘤形成或血管瘤等嚴(yán)重并發(fā)癥。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法。
[0007]本發(fā)明提供了一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法,包括以下步驟:
[0008]步驟1,分離培養(yǎng)上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞;
[0009]步驟2,將小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架置入肌細(xì)胞懸液中,震蕩復(fù)合完成后,繼續(xù)培養(yǎng);
[0010]步驟3,將上皮細(xì)胞懸液滴在經(jīng)步驟2處理得到后的支架的肌細(xì)胞層上,繼續(xù)培養(yǎng)得到三維立體組織。
[0011]其中,所述肌細(xì)胞可以為人體的各種肌細(xì)胞,例如骨骼肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞或心肌細(xì)胞等,優(yōu)選為骨骼肌細(xì)胞。
[0012]其中,所述上皮細(xì)胞可以為人體各個部位的上皮細(xì)胞,例如口腔、喉部、鼻咽、器官、肺、胃、腸等的上皮細(xì)胞,優(yōu)選為舌上皮細(xì)胞。
[0013]優(yōu)選地,所述三維立體組織為三維立體尿道組織。
[0014]優(yōu)選地,步驟2中的震蕩復(fù)合在恒溫震蕩箱內(nèi)進(jìn)行,溫度為25-40°C (優(yōu)選30-390C,更優(yōu)選 33-38°C,更優(yōu)選 35_37°C ),速度為 50_150rpm/min (優(yōu)選 60_120rpm/min,更優(yōu)選 70-110rpm/min,更優(yōu)選 75-95rpm/min),持續(xù)震蕩 6_24h(優(yōu)選 7_20h,更優(yōu)選 8_16h,更優(yōu)選10-14h)。
[0015]優(yōu)選地,步驟2中所述肌細(xì)胞懸液由步驟I得到的肌細(xì)胞消化調(diào)整密度為(0.5-5) X 1VmL得到,其中,密度更優(yōu)選為(0.8-4) X 107/mL,更優(yōu)選為(1-3) X 10VmL,更優(yōu)選為(1.5-2.5) X 1VmL0
[0016]優(yōu)選地,步驟3中所述上皮細(xì)胞懸液由步驟I得到的上皮細(xì)胞消化調(diào)整密度為(0.2-3) X 1fVmL得到,其中,密度更優(yōu)選為(0.4-2.5) X 106/mL,更優(yōu)選為(0.6-2.2) X 16/mL,更優(yōu)選為(0.8-1.6) X 106/mL,更優(yōu)選為(0.9-1.2) X 106/mL。
[0017]優(yōu)選地,步驟2中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d,每天換液。
[0018]優(yōu)選地,步驟3中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d,每天換液。
[0019]優(yōu)選地,步驟2中所述小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架在使用前先進(jìn)行消毒處理。
[0020]本發(fā)明還提供了一種上述方法構(gòu)建的三維立體組織。
[0021 ] 優(yōu)選地,所述三維立體組織為三維立體尿道組織。
[0022]本發(fā)明還提供了一種上述方法構(gòu)建的三維立體組織在尿道組織工程中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明提供體外構(gòu)建三維立體組織的方法采用舌粘膜上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞作為種子細(xì)胞,取材方便,能夠在較短的時間內(nèi)擴增較多的數(shù)量,滿足應(yīng)用的需要;采用震蕩的方法使肌細(xì)胞與小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架復(fù)合,能夠使肌細(xì)胞大量浸潤至小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架內(nèi)部且分布較均勻,同時在不明顯破壞小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架的前提下,可以使小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架盡可能的松散,更利于養(yǎng)分滲入和新生血管生成;可以構(gòu)建可用于組織工程化尿道的三維立體組織。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為采用本發(fā)明提供的體外構(gòu)建三維立體組織的方法構(gòu)建的三維立體組織的HE染色(A)和免疫熒光染色(B)結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0025]下面參照附圖,結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明,以更好地理解本發(fā)明。
[0026]實施例14層小腸黏膜脫細(xì)胞基質(zhì)(SIS)支架與舌上皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞體外復(fù)合構(gòu)建三維立體尿道組織
[0027]1、支架消毒
[0028]將購自美國COOK公司的4層SIS支架,裁剪為大小2cmX3cm的小塊,環(huán)氧乙烷消毒,分裝室溫保存?zhèn)溆谩?br>
[0029]2、取材
[0030]選取行舌粘膜代尿道成形術(shù)的前尿道狹窄患者,待其行舌粘膜代尿道成形術(shù)時,收集手術(shù)剩余舌粘膜組織。
[0031]3、種子細(xì)胞培養(yǎng)
[0032]I)舌黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng):將舌黏膜組織,去除漿膜層組織,置入含氯霉素的50ml離心管中振洗6-9次,PBS沖洗3次后轉(zhuǎn)入含DISPASEII工作液的離心管中于4°C浸泡12-18h。PBS沖洗3次后將黏膜上皮層與其余組織分離。眼科剪剪碎后0.05%胰蛋白酶37°C恒溫振蕩消化20min。用含10%FBS的DMEM終止消化后吹打,200目濾網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞懸液離心棄上清,用KSFM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后,加入10mm培養(yǎng)皿中,置入37°C、5%C02、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2天換液I次。第3代細(xì)胞采用免疫熒光技術(shù),利用AEl/AE3抗體對細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)鑒定。
[0033]2)舌骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)及純化:將去除舌粘膜層后殘留的肌層組織充分清洗后,將組織條剪碎至Imm3大小后,應(yīng)用0.5%1型膠原酶,37°C恒溫振蕩(120rpm/min)消化3h。用含10%FBS的DMEM終止消化后,吹打,200目濾網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞懸液,離心(1500rpm, 1min),棄上清,用含20%FBS的高糖DMEM重懸細(xì)胞后,加入到10mm培養(yǎng)皿中,置入37°C、5%C02、95%空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每3天換液I次,傳代后改用含10%FBS的DMEM進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。同時通過差速貼壁技術(shù)對3代內(nèi)的肌細(xì)胞進(jìn)行純化處理。第3代細(xì)胞采用免疫熒光技術(shù),利用抗α -橫紋肌肌動蛋白(a -SCA)和抗結(jié)蛋白(DESMIN)抗體對細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)鑒定。
[0034]4、種植
[0035]收集體外培養(yǎng)的肌細(xì)胞,消化調(diào)整密度為2X107/ml后將懸液置于培養(yǎng)瓶中,將SIS支架置入上述含有肌細(xì)胞懸液的培養(yǎng)瓶中,37°C恒溫震蕩箱中80rpm/min條件下持續(xù)震蕩12h,振蕩復(fù)合完成后,用DMEM沖洗支架I次,置入10mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),每天換液。
[0036]上述培養(yǎng)4d后,將舌黏膜上皮細(xì)胞消化離心后調(diào)整密度為IXlO6Ail后,將上皮細(xì)胞懸液滴在種植到肌細(xì)胞層,再體外培養(yǎng)4天,得到三維立體尿道組織。
[0037]5、組織學(xué)檢查
[0038]所的三維立體尿道組織行H-E切片染色,結(jié)果如圖1A所示;另外利用免疫熒光雙標(biāo)染色進(jìn)一步評估復(fù)合效果,結(jié)果如圖1B所示。染色可見肌細(xì)胞可浸潤至支架內(nèi)部且分布較均勻,骨骼肌層與支架表面的上皮細(xì)胞層分界清晰,同時振蕩法使4層SIS支架變得疏松,這更有利于細(xì)胞-支架復(fù)合體回植體內(nèi)后新生血管生成。
[0039]6、結(jié)果表明
[0040]舌粘膜上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞取材方便,能夠在較短的時間內(nèi)擴增較多的數(shù)量,滿足應(yīng)用的需要。本發(fā)明的復(fù)合方法能夠使肌細(xì)胞大量浸潤至支架內(nèi)部且分布較均勻,可以構(gòu)建三維立體的組織工程化尿道。
[0041]以上對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行了詳細(xì)描述,但其只是作為范例,本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言,任何對本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此,在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外構(gòu)建三維立體組織的方法,其特征在于,包括以下步驟: 步驟I,分離培養(yǎng)上皮細(xì)胞和肌細(xì)胞; 步驟2,將小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架置入肌細(xì)胞懸液中,震蕩復(fù)合完成后,繼續(xù)培養(yǎng); 步驟3,將上皮細(xì)胞懸液滴在經(jīng)步驟2處理得到后的支架的肌細(xì)胞層上,繼續(xù)培養(yǎng)得到三維立體組織。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述肌細(xì)胞為骨骼肌細(xì)胞;所述上皮細(xì)胞為舌上皮細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述三維立體組織為三維立體尿道組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2中的震蕩復(fù)合在恒溫震蕩箱內(nèi)進(jìn)行,溫度為25-40°C,速度為50-150rpm/min,持續(xù)震蕩6_24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2中所述肌細(xì)胞懸液由步驟I得到的肌細(xì)胞消化調(diào)整密度為(0.5-5) X 1VmL得到;步驟3中所述上皮細(xì)胞懸液由步驟I得到的上皮細(xì)胞消化調(diào)整密度為(0.2-3) X 1VmL得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d,每天換液;步驟3中繼續(xù)培養(yǎng)時間為2-6d,每天換液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,步驟2中所述小腸黏膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)支架在使用前先進(jìn)行消毒處理。
8.—種如權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建的三維立體組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的三維立體組織,其特征在于,所述三維立體組織為三維立體尿道組織。
10.權(quán)利要求8所述三維立體組織在尿道組織工程中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61L27/36GK104274864SQ201310291478
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月11日
【發(fā)明者】徐月敏, 呂向國, 馮超 申請人:上海市第六人民醫(yī)院