預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的蟛蜞菊屬萃取物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)于預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的蟛蜞菊屬萃取物及其用途，借由一種特定的萃取方法，使其萃取物達(dá)到有效的預(yù)防和治療腸道發(fā)炎，其萃取物包含綠原酸和阿魏酸作為預(yù)防和治療腸道發(fā)炎的成分。
【專利說明】預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的蟛蜞菊屬萃取物及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明關(guān)于一種蟛蜞菊屬的植物萃取物在預(yù)防和治療腸道發(fā)炎上的運用和產(chǎn)品化。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)炎性腸道疾病(Inflammatory bowel disease, IBD)是一種腸胃道慢性發(fā)炎病癥，影響范圍遍及全球數(shù)百萬人口。流行病學(xué)和病理學(xué)上的研究證據(jù)顯示發(fā)炎性腸道疾病發(fā)病的起因是經(jīng)由一種復(fù)雜的環(huán)境誘因、家族性和遺傳性的因子、免疫調(diào)節(jié)的缺陷以及微生物接觸的交互作用，造成不當(dāng)?shù)爻掷m(xù)活化黏膜免疫系統(tǒng)。
[0003]近年來，從草藥衍生出的天然健康產(chǎn)品已經(jīng)發(fā)展成常見疾病的另類或輔助療法。新近的調(diào)查報告指出，在發(fā)炎性腸道疾病患者之中，最常使用的另類或輔助療法是草藥療法。膨蜞菊(Wedelia chinensis)是在亞洲國家廣泛地被使用的一種重要草藥,為草藥茶中的一個重要組成成分。在臺灣和東南亞，蟛蜞菊是被認(rèn)為有療效例如去咳、解熱、排毒、消炎以及保護肝臟的效果。蟛蜞菊中的成分近來被報導(dǎo)有緩和雄性素受體的活性以及攝護腺癌的生長。
[0004]由于目前用以治療發(fā)炎性腸道疾病的藥物無法根除此疾病的復(fù)發(fā)且具有副作用，因此對于能有效治療發(fā)炎性腸道疾病的療法的研發(fā)仍有其需求。利用傳統(tǒng)藥草當(dāng)作輔助療法以緩解此種的疾病，已被認(rèn)為是一種重要的方式。然而，缺乏科學(xué)證據(jù)以證明傳統(tǒng)藥草的療效及安全性，和缺乏萃取方法和品種(species)對藥草的影響的調(diào)查等問題，仍是在傳統(tǒng)藥草的研發(fā)和應(yīng)用時需面對的。
[0005]目前已有從傳統(tǒng) 藥用植物衍生出單一化合物/植物化學(xué)物質(zhì)，例如，Curcuma1nga 的姜黃素[I]、Polygonum tinctorium[2]的色胺酮(tryptanthrin)、Scutelleriabaicalensis 的黃岑素[3], Catalpa Ovata 的梓苷(Catalposide) [4] > CopaiferaOfficinalis的β -石竹烯(β-caryophyllene) [5]以及其他已測試其可能為抗結(jié)腸炎的治療藥物。
[0006]然而，在傳統(tǒng)藥用植物特定組織中，萃取、制備和分離的方法會容易影響藥用或膳食的植物材料的最終萃取物樣品的藥物或營養(yǎng)的特性[6]。Capecka[7]等人研究已發(fā)現(xiàn)，在制備唇形科種植物中，新鮮與干燥方式備制的抗氧化活性有顯著的差異。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]在一方面，本發(fā)明是關(guān)于一種應(yīng)用蟛蜞菊萃取物方法于預(yù)防和治療腸道發(fā)炎疾病上的運用及產(chǎn)品化。對于具有急性腸道炎的小鼠展現(xiàn)出良好的抗腸炎作用，其顯示蟛蜞菊具有舒緩或治療IBD病患因腸道發(fā)炎所引起的臨床癥狀和組織病理變化的潛力。
[0008]在另一方面，本發(fā)明揭露一種萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本發(fā)明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鮮或陰干的蟛蜞菊所制得的熱水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒緩葡聚醣硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)所誘發(fā)的腸道發(fā)炎。[0009]前述或其他的實施例將可由以下對較佳實施例的描述及附圖更為清楚，然而其改變或修飾并未脫離本發(fā)明揭露內(nèi)容的精神、范圍及概念。
[0010]相關(guān)附圖可說明一個或多個本發(fā)明實施例，同時配合文字說明，可用于解釋本發(fā)明的概念。附圖中相同的組件符號用于標(biāo)示一實施例中的相同或相似組件。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1顯示給予具有DSS導(dǎo)入急性結(jié)腸炎的鼠WCHF療法的影響。結(jié)腸炎的導(dǎo)入是經(jīng)由含有2%DSS的飲水為期九天。小鼠同時間地經(jīng)口服給予載體(1%吐溫80)或WCHF(50mg/kg鼠體重)為期7天；之后為期九天的DSS的治療。圖1A顯示相對體重的改變。圖1B顯示疾病活性的指針。圖1C顯示結(jié)腸的長度。圖1D顯示組織切片。圖1E顯示組織學(xué)評分。圖1F顯示骨髓過氧化酵素活性。數(shù)據(jù)以均值土SD (n=5-6)表示。經(jīng)H&E染色的結(jié)腸中段組織切片以40倍和100倍放大。*P < 0.05，#P < 0.005，< 0.001，有顯著的不同與對照組相比較。*P < 0.05，林P < 0.005，_P < 0.001，有顯著的不同與DSS組相比較。
[0012]圖2顯示鼠具有DSS導(dǎo)入急性結(jié)腸炎對于以不同方法萃取出的蟛蜞菊的萃取物的效果。萃取的方法是依照本發(fā)明的材料和方法所述。小鼠同時間地經(jīng)口服給予載體(1%吐溫80)或不同的蟛蜞菊萃取物(50mg/kg鼠體重)為期7天；之后為期九天的DSS的治療。第2A圖顯示相對體重的改變。第2B圖顯示結(jié)腸的長度。第2C圖顯示疾病活性的指針。數(shù)據(jù)以均值土SD (n=5-6)表示。WCHF:經(jīng)熱水新鮮蟛蜞菊萃取物；WCHD:經(jīng)熱水干燥蟛蜞菊萃取物；WC50和WC100:100% (WC100)和50% (WC50)的乙醇新鮮蟛蜞菊萃取物。*P < 0.05，林P < 0.005，_P < 0.001，有顯著的不同與DSS組相比較。
[0013]圖3顯示經(jīng)熱水新鮮蟛蜞菊萃取物和經(jīng)熱水干燥蟛蜞菊萃取物的高效液相色譜法的特性以及候選的指針化學(xué)劑。WCHF，WCDF和單一純化學(xué)劑被偵測到在不同的波長下(藍(lán)色=208nm,紅色=254nm,綠色=300nm,粉紅色=350nm)。箭頭指示在WCHF的特性中所顯示的特定的高峰，其高峰減低或是并未發(fā)現(xiàn)在WCHD的特性中。
`[0014]圖4顯示試驗鼠的重要器官在WCHF的影響下其組織的亞毒性研究。
[0015]圖5顯示不同種的蟛蜞菊的熱水萃取物對于具有DDS導(dǎo)入急性結(jié)腸炎的鼠，喪失其體重的效果。(A)鼠的體重在DSS治療前。給予鼠口服熱水萃取物的A:WC、B:WT、C:WB、D:WP和E:WPR (50mg/kg)、磺胺塞拉金(sulfasalazine, 50mg/kg,正對照組)或載體(無菌水、對照組和DSS組)。(B)鼠的體重在DSS治療后。將含有2%DSS的飲水喂于鼠，為期七天。同時給予磺胺塞拉金和不同種的蟛蜞菊的熱水萃取物。WC=蟛蜞菊、WT=南美蟛蜞菊、WB=雙花蟛蜞菊、WP=天蓬草舅、WBR=琉球蟛蜞菊、WPR=大天蓬草舅。數(shù)據(jù)以均值土 S.E.M(η=14)。*Ρ〈0.05, **Ρ〈0.01, ***Ρ〈0.001 表示。
[0016]圖6顯示不同種的蟛蜞菊的熱水萃取物對于在DDS導(dǎo)入結(jié)腸炎的小鼠的疾病活性指標(biāo)的影響。將含有2%DSS的飲水喂于小鼠和接受口服的載體(無菌水、對照組和DSS組)，磺胺塞拉金(50mg/kg，正對照組)或熱水萃取物A:WC、B:WT, C:WB、D:WP和E:WPR (50mg/kg)。數(shù)據(jù)以均值土S.E.M (n=14)。*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01 表示。
[0017]圖7顯示不同種的蟛蜞菊的熱水萃取物對于具有DDS導(dǎo)入急性結(jié)腸炎的鼠的病理組織和組織學(xué)評分。將含有2%DSS的飲水喂于小鼠和接受口服的載體(無菌水、對照組和DSS組)，磺胺塞拉金(50mg/kg，正對照組)或熱水萃取物A:WC、B:WT, C:WB、D:WP和E:WPR(50mg/kg)。H&E染色的中段結(jié)腸切片放大于40倍(A)和100倍(B)。(C)組織學(xué)評分。數(shù)據(jù)以均值土S.E.M (η=14)。*Ρ〈0.05，**Ρ〈0.01，_Ρ〈0.001 表示。
【具體實施方式】
[0018]定義
[0019]說明書中所使用的用語在該領(lǐng)域中具有其一般定義，包括在本發(fā)明的說明內(nèi)容，以及特定文字內(nèi)容部份所使用的用語。以下將討論本發(fā)明所使用的特定用語，亦或說明書的其他部分，以作為實施者在實施本發(fā)明的導(dǎo)引。為了便利起見，某些詞匯將特別標(biāo)記，例如使用斜體及/或引號標(biāo)示。這些標(biāo)記的使用，將不影響該用語的范圍或定義；該用語的范圍或定義在文中仍然是相同的，無論其是否有標(biāo)記。相同的事物可用一種以上的方式描述。因此，在此將使用超過一種的其他用語及同義字，該些用語并無其他特殊含義，無論該些用語是否有特別解釋或闡述。在本文中使用了一些同義字，列舉一或多種同義字并不代表排除了其他未提及或列舉的同義字。在實施例或說明書中所使用的用語僅為用以說明，并非限定其本發(fā)明或?qū)嵤├姆秶蚨x。同樣地，本發(fā)明并非受限于說明書中的實施例。
[0020]除非另外定義，本文中所使用的技術(shù)上或科學(xué)上的用語，皆為該領(lǐng)域具有通常知識者所理解在本發(fā)明所涉及的一般定義。
[0021]在一方面，本發(fā)明是關(guān)于蟛蜞菊抗腸炎功效的可能性。本發(fā)明對于具有急性腸道炎的小鼠展現(xiàn)出良好的抗腸炎作用，其顯示蟛蜞菊具有舒緩或治療IBD病患因腸道發(fā)炎所引起的臨床癥狀和組織病理變化的潛力。
[0022]在另一方面，本發(fā)明揭露一種萃取蟛蜞菊萃取物的方法。本發(fā)明利用不同萃取方法所制得的蟛蜞菊萃取物，包括新鮮或陰干的蟛蜞菊所制得的熱水萃取物及50%和100%酒精的萃取物，皆能舒緩葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)所誘發(fā)的腸道發(fā)炎，其中以新鮮的制備的熱水萃取物效果最佳。另外，本發(fā)明進一步利用高效液相層析儀分析各種膨蜞菊屬(Wedeli·a genus)植物的其他種(species)的鮮品水萃物的代謝物圖譜。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，琉球膨蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)、膨蜞菊(Wedelia chinensis)及南美膨蜞菊(W.trilobata)的高效液相層析儀分析的圖譜與其他三者(雙花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)及大天蓬草舅(W.prostrata var.robusta.)有顯著的不同；各種的蟛蜞菊亦有獨特的波峰可供辨識。本研究也發(fā)現(xiàn)數(shù)種單一植化物(phytochemicals),如綠原酸(chlorogenic 8(^(1)及阿魏酸(€61'111;^ acid)可能存在于膨蜞菊屬植物中，可做為膨蜞菊屬植物的鮮品水萃物的指標(biāo)成分(index compounds),當(dāng)作商業(yè)應(yīng)用上的質(zhì)量控管依據(jù)。
[0023]在本發(fā)明的一實施例中，一種預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的蟛蜞菊屬(Wedelia)萃取物，其由蟛蜞菊屬植物以水或醇類萃取而得。
[0024]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該蟛蜞菊屬植物選自于琉球膨蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)> 膨蜞菊(Wedelia chinensis)、南美膨蜞菊(W.trilobata)、雙花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)、大天蓬草舅(ff.prostrata var.robusta.)及其任一組合所組成的群組
[0025]在本發(fā)明的另一實施例中，其中該蟛蜞菊屬植物為新鮮或干燥的植物。
[0026]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該水為滾燙熱水。[0027]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該醇類為乙醇。
[0028]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的蟛蜞菊屬萃取物，其進一步包含綠原酸(chlorogenic acid)、阿魏酸(ferulic acid)或其混合物。
[0029]在本發(fā)明的另一實施例中，一種用于預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的醫(yī)藥組成物，包括有效劑量的如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0030]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的醫(yī)藥組成物，其中該腸道發(fā)炎疾病為結(jié)腸炎。
[0031]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的蟛蜞菊屬萃取物用于制備預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的藥物的用途。
[0032]在本發(fā)明的另一實施例中，所述的用途，其中該蟛蜞菊屬萃取物具有抗發(fā)炎功效以達(dá)到預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的效果。[0033]實施例
[0034]以下將提供本發(fā)明的實施例，包括儀器、裝置及方法，以及依據(jù)該些實施例所得的結(jié)果。在實施例中使用的名稱及副名稱是為了方便閱讀，并非用以限制本發(fā)明的保護范圍。進一步地，在此所揭露的原理，只要發(fā)明能夠依據(jù)說明書所載據(jù)以實施，都不應(yīng)限制本發(fā)明的保護范圍。
[0035]材料及方法
[0036]蟛蜞菊萃取物的準(zhǔn)備
[0037]依先前文獻(xiàn)所記載及自行的研究，實驗用的植物材料需用肉眼于外觀、構(gòu)造、植物化學(xué)和基因圖表的特征上作確認(rèn)。蟛蜞菊購自臺北市有聲譽的中醫(yī)藥草店或由種植者取得。干燥的蟛蜞菊是將新鮮干凈的蟛蜞菊置放于陰涼處兩個星期干燥而成。關(guān)于經(jīng)由熱水提煉的新鮮(亦稱鮮品)或干燥蟛蜞菊萃取物，實驗植物材料需稱重然后加入適當(dāng)?shù)臐L水(每一百公克的新鮮或干燥蟛蜞菊須一公升的水)煎煮，須煎煮至滾水剩余原來的四分之一。然后使用吸取泵將滾水的萃取物經(jīng)由濾紙過濾以及使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將萃取物濃縮。乙醇提煉的萃取物是將整個新鮮蟛蜞菊浸泡于100%或509ffit0H (WC100或WC50)兩星期，之后其萃取物經(jīng)由上述的方法過濾以及濃縮。全部的萃取物在使用前須經(jīng)冷凍干燥以及儲藏在4°C中。
[0038]小鼠
[0039]七到八個月大的C57BL/6以及ICR雌小鼠是從National Laboratory AnimalCenter (臺灣臺北)購買的。小鼠安置固定的溫度和濕度下，維持以12h/12h/日/夜的循環(huán)。小鼠給予食物和水持續(xù)至小鼠達(dá)到實驗所需的理想體重。其步驟是依照中研院的實驗動物管理與使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)的標(biāo)準(zhǔn)流程進行。
[0040]導(dǎo)入急性結(jié)腸炎
[0041]待小鼠適應(yīng)環(huán)境之后，體重達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的雌小鼠(20-25公克)隨機分置對照、結(jié)腸炎-對照和治療等組。全部的小鼠給予正常的飲水從第-7天到第O天。為了導(dǎo)入急性結(jié)腸炎，除了對照組之外，其余的小鼠給予含有2% (w/v)葡聚醣硫酸鹽(DSS，分子量:36000-50000Da,MP Biochenicals，Solon，Ohio，USA)的飲水從第 O 天到第 8-9 天。DSS溶液每兩天更換一次，DSS的飲用量以均值(mean)紀(jì)錄。在整個實驗的期間,對照組和DSS組的小鼠經(jīng)由口服給予其對照試驗萃取物的載體(vehicle) (1%吐溫80, Sigma-Aldrich,St.Louis, MO, USA)。治療組給予以不同方式提煉的蟛蜞菊萃取物，將萃取物溶解于載體，經(jīng)由管喂(oral gavage)、口服的方式,其劑量為50mg/kg。為了評估結(jié)腸炎的程度,每天對小鼠的體重、排便狀況以及糞便中的血液含量進行觀察；結(jié)腸炎的疾病活動指數(shù)(diseaseactivity index)是根據(jù)Cooper[8]等人的改良準(zhǔn)則所計算的。在每個實驗結(jié)束之后，將全部的試驗小鼠測量體重并犧牲。小鼠的大腸被切除后，測量結(jié)腸長度，移除盲腸之后，洗浸于0.9%的生理食鹽水，最后浸泡置10%中性福爾馬林中。
[0042]結(jié)腸炎的組織病理學(xué)的評估
[0043]結(jié)腸組織檢驗的中段結(jié)腸的組織評分是根據(jù)Cooper等人所描述的評分系統(tǒng)。將已浸泡于福爾馬林中的結(jié)腸分成三等段(equal segments)分別是前、中和后段，使用石蠟包埋，切片(2um)然后染色于蘇木色素和伊紅。DSS導(dǎo)入的結(jié)腸炎的損傷以腸道腺窩的喪失、腸道腺窩的再生、黏膜下層的水腫、發(fā)炎以及出血(纖維組織母細(xì)胞的滲透)來評分。根據(jù)Shackleford[9]等人所描述的方法(參見表一)，其損害程度是以依照前述每項嚴(yán)重度I到5分來進行評分，最高總分為25分。
[0044]表一在亞急性毒性試驗中分析WCHF對于試驗鼠的血液參數(shù)(A)和血液生化(B)的影響
[0045]⑷血液參數(shù)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的蟛蜞菊屬(Wedelia)萃取物，其由蟛蜞菊屬植物以水或醇類萃取而得。
2.如權(quán)利要求1所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該蟛蜞菊屬植物選自于琉球蟛蜞菊(W.biflora var.ryukyuensis)> 膨蜞菊(Wedelia chinensis)、南美膨蜞菊(W.trilobata)、雙花膨蜞菊(W.biflora)、天蓬草舅(W.prostrata)、大天蓬草舅(W.prostrata var.robusta.)及其任一組合所組成的群組。
3.如權(quán)利要求1或2項所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該蟛蜞菊屬植物為新鮮或干燥的植物。
4.如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物，其中該水為滾燙熱水。
5.如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物,其中該醇類為乙醇。
6.如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物，其進一步包含綠原酸、阿魏酸或其混合物。
7.一種用于預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的醫(yī)藥組成物，包括有效劑量的如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物，以及藥學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7項所述的醫(yī)藥組成物，其中該腸道發(fā)炎疾病為結(jié)腸炎。
9.一種將如權(quán)利要求1項所述的蟛蜞菊屬萃取物用于制備預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的藥物的用途。
10.如權(quán)利要求7項所 述的用途，其中該蟛蜞菊屬萃取物具有抗發(fā)炎功效以達(dá)到預(yù)防或治療腸道發(fā)炎疾病的效果。
【文檔編號】A61K36/28GK103565872SQ201310320940
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】溫致群, 蕭培文, 黃文經(jīng), 林淑惠, 黃郁婷, 林文晴, 楊寧蓀 申請人:中央研究院, 萬寶祿生物科技股份有限公司