奧沙利鉑藥物組合物及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及奧沙利鉑類結(jié)腸癌治療藥物和應(yīng)用，由TOP2B抑制劑和奧沙利鉑組成。實驗證明抑制CCDC88A能夠提高結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉑的敏感性。同時，這種敏感性的增加與TOP2B的表達降低也有關(guān)，用TOP2B的抑制劑也能提高對奧沙利鉑結(jié)直腸癌細胞的敏感性，本發(fā)明的CCDC88A和TOP2B可以作為奧沙利鉑的增敏劑，以這兩個基因作為靶點設(shè)計藥物，聯(lián)合奧沙利鉑，可以提高奧沙利鉑的療效。
【專利說明】奧沙利鉑藥物組合物及應(yīng)用
[【技術(shù)領(lǐng)域】]
[0001]本發(fā)明涉及奧沙利鉬類結(jié)腸癌治療藥物和應(yīng)用，特別涉及CCDC88A和T0P2B抑制劑和奧沙利鉬的藥物組合物及應(yīng)用。
[【背景技術(shù)】]
[0002]奧沙利鉬作為第三代鉬類藥物，廣泛用于結(jié)直腸癌輔助治療的一線方案。奧沙利鉬發(fā)揮細胞毒性作用的機制是在細胞內(nèi)通過代謝產(chǎn)物與DNA交聯(lián)形成DNA復(fù)合物，從而終止腫瘤細胞的復(fù)制、導(dǎo)致細胞凋亡。研究表明只有40%患者從中獲益，但是仍然有一部分患者治療失敗。其主要的原因是對于奧沙利鉬化療藥物原始或獲得性的耐藥性。這種耐藥性的產(chǎn)生包含化療藥物的運輸、DNA修復(fù)、DNA損傷耐受和凋亡等多個因素的參與。如何提高奧沙利鉬為主的結(jié)直腸癌化療敏感性成為當前臨床研究和基礎(chǔ)研究的熱點問題。
[0003]CCDC88A (Gene ID: 55704)，屬激酶調(diào)節(jié)蛋白，它的 C 端含有 GEF (Guaninenucleotide Exchange Factor)結(jié)構(gòu)域，能夠與G蛋白I型α亞基(Gia )結(jié)合,釋放G3 Y亞基，從而活化細胞內(nèi)激酶，進而調(diào)控細胞內(nèi)信號通路，在腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。有研究表明CCDC88A在進展期結(jié)直腸癌中的表達有明顯升高并且影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后。目前發(fā)現(xiàn)(XDC88A主要通過調(diào)控EGFR和ΡΙ3Κ信號通路調(diào)控腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移。CCDC88A在細胞內(nèi)通過GEF結(jié)構(gòu)域結(jié)合Gi a，同時其C端與EGFR結(jié)合，形成Gi a -GIV-EGFR復(fù)合物，EGFR發(fā)生磷酸化，進而導(dǎo)致下游PI3K，AKT和PLC Y磷酸化，促進細胞遷移；當(XDC88A的1685位氨基酸發(fā)生突變(F1685A)后，不能和G蛋白結(jié)合，EGFR磷酸化水平下降，但是SRC和ERK磷酸化水平升高，也可以促進細胞分裂和增殖。EGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平除了與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)之外，還與腫瘤細胞對藥物的抗性有關(guān)，在鉬類耐藥的腫瘤細胞中均發(fā)現(xiàn)EGFR和PI3K磷酸化水平比非耐藥細胞要高。既然CCDC88A可以激活與化療耐藥相關(guān)的EGFR和PI3K通路，因此，有理由認為(XDC88A可以促進腫瘤細胞的耐藥，從而影響腫瘤的預(yù)后。
[0004]T0P2B (Gene ID: 55704)屬于T0P2家族成員，這個家族還有T0P2A。T0P2是機體內(nèi)重要的核酶，具有調(diào)整DNA拓撲結(jié)構(gòu)的作用，它參與了 DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及染色體的分離、損傷修復(fù)等過程。T0P2A在增殖細胞和腫瘤細胞等含量較高，其濃度與細胞的增殖狀態(tài)緊密相關(guān)，快速增殖細胞是靜止細胞表達的數(shù)倍，GcZG1其含量較低，在S期開始增加，G2/M期表達達到高峰。T0P2B的表達無細胞周期性差異，其濃度在細胞周期中保持相對恒定。因此推測T0P2A和T0P2B的功能，T0P2A可能負責(zé)在DNA復(fù)制后期解開兩個相互交聯(lián)的染色質(zhì)單體以及重組細胞分裂后期DNA ;而T0P2B負責(zé)DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程。由于T0P2在細胞代謝中的重要作用，因此其成為腫瘤靶點被應(yīng)用到惡性腫瘤的治療中。這些抗T0P2的靶向藥物按照其作用方式可以分為兩種:T0P2毒劑和Τ0Ρ2催化抑制劑。Τ0Ρ2毒劑的代表藥物有依托泊苷(Etoposide, VP16)和阿霉素(Adriamycin, ADM),其作用方式是通過提高可切割復(fù)合物的穩(wěn)態(tài)濃度使T0P2從酶變成生理毒劑，形成T0P2-藥物-DNA復(fù)合物，使細胞基因組DNA斷裂，從而導(dǎo)致細胞變異或啟動一系列事件導(dǎo)致細胞死亡。這些藥物是目前臨床上常用抗癌藥物，是淋巴瘤、肺癌等惡性腫瘤的首選藥物。T0P2催化抑制劑的代表藥物有新生霉素、阿柔比星等，其作用方式通過抑制催化反應(yīng)中的某一步驟或阻滯T0P2的某一特定功能，進而抑制T0P2的總體催化活性。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]為了增加奧沙利鉬對于結(jié)腸癌細胞的敏感性，提供一種以(XDC88A和T0P2B作為新的靶點的奧沙利鉬藥物組合物。
[0006]用MTT法檢測17種結(jié)直腸癌細胞系對奧沙利鉬敏感性，確定了奧沙利鉬對17株細胞的半致死濃度(IC50)和奧沙利鉬不敏感細胞株。通過篩選針對(XDC88A mRNA的4個靶點的siRNA，選擇干擾效率最高的序列設(shè)計shRNA，其堿基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其堿基反向序列如SEQ ID:2所示。
[0007]然后構(gòu)建慢病毒，感染DLDl細胞，RT-PCR和wetern blotting檢測干擾效率，選取干擾效率最高的shRNA慢病毒感染DLDl細胞，聯(lián)合奧沙利鉬，用MTT法檢測兩者聯(lián)用對DLDl細胞的生長抑制效果發(fā)現(xiàn):(XDC88A表達降低后，導(dǎo)致T0P2B基因表達下調(diào)，使用T0P2B的抑制劑阿霉素可以增加結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
[0008]抑制CCDC88A的能夠提高結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。同時，這種敏感性的增加與T0P2B的表達降低也有關(guān)，抑制T0P2B也能提高對奧沙利鉬結(jié)直腸癌細胞的敏感性。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明一種奧沙利鉬藥物組合物，由(XDC88A和/或T0P2B的抑制劑聯(lián)用奧沙利鉬組成。通過Real-time PCR及Western blotting檢測腫瘤耐藥相關(guān)基因T0P2B mRNA和蛋白表達，發(fā)現(xiàn)其表達量在(XDC88A被干擾之后，明顯降低。用T0P2B抑制劑和奧沙利鉬處理結(jié)直腸癌細胞，兩者聯(lián)用時抑制率顯著提高。
[0010]進一步的，所述的T0P2B抑制劑優(yōu)選為阿霉素或依托泊苷。
[0011]上述的藥物組合物中奧沙利鉬的濃度為3μΜ~10μΜ ；Τ0Ρ2Β抑制劑的濃度為3μΜ~24μΜ。優(yōu)選為下述3種方案:
[0012]a.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和濃度為6μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0013]b.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和9μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0014]c.濃度為3μΜ的奧沙利鉬和濃度為24μΜ的Τ0Ρ2Β抑制劑。
[0015]所述奧沙利鉬藥物組合物能夠用于D2、HCT116、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、C0115、CX-1、C0L0205、DLD1、GP2D、GP?、或 HCT15 等結(jié)直腸癌抑制藥物中，尤其能夠提高DLDl對于奧沙利鉬的敏感性。
[0016]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)而言，具有如下優(yōu)點:
[0017]確定了抑制CCDC88A能夠提高結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性，這種敏感性的增加與Τ0Ρ2Β的表達降低有關(guān)，用Τ0Ρ2Β的抑制劑阿霉素聯(lián)合奧沙利鉬處理結(jié)直腸癌細胞，也能提高對結(jié)直腸癌細胞的增殖。
[0018]本發(fā)明的(XDC88A和Τ0Ρ2Β可以作為奧沙利鉬的增敏劑，以這兩個基因作為靶點設(shè)計藥物，聯(lián)合奧沙利鉬，可以提高奧沙利鉬的療效。[【專利附圖】

【附圖說明】][0019] 圖1顯示了 CCDC88A對4個siRNA干擾效率；
[0020]圖2顯示了(XDC88A對shRNA慢病毒干擾效果；
[0021]圖3顯示了(XDC88A干擾之后提高了 DLDl細胞對奧沙利鉬的敏感性；
[0022]圖4顯示了(XDC88A干擾導(dǎo)致T0P2B蛋白表達下降；
[0023]圖5顯示了 (XDC88A干擾導(dǎo)致T0P2B mRNA表達下降；
[0024]圖6顯示了 T0P2B抑制劑阿霉素提高DLDl細胞對奧沙利鉬敏感性。
圖中I表不:未作任何處理2表不:3 μ m奧沙利鉬3表不:6 μ m阿霉素4表不:3 μ m奧沙利鉬+6 μ m阿霉素5表不:9 μ m阿霉素6表不:3 μ m奧沙利鉬+9 μ m阿霉素7表不:24 μ m阿霉素8表示:3 μ m奧沙利鉬+24 μ m阿霉素。
[【具體實施方式】]
[0025]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0026]實施例1:結(jié)直腸癌細胞株培養(yǎng)
[0027]將CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0205、D2、DLD1、GP2D、GP5D、HCT15、HCTl 16、HUTU80、LS174T、LS180、SW48、SW480、SW620、SW837 等 17 株結(jié)直腸癌細胞株置于 37°C、5%C02 培養(yǎng)箱中，含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。
[0028]實施例2 =MTT法檢測17種結(jié)直腸癌細胞系對奧沙利鉬的敏感性
[0029]取對數(shù)生長期結(jié)直腸癌細胞系，分別接種于96孔板中，1000-5000個/孔，100微升培養(yǎng)基/孔。
[0030]第二天棄培養(yǎng)液，每組細胞加入用培養(yǎng)基稀釋的不同濃度(0、3、10、30μπι)的奧沙利鉬，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，并設(shè)單獨培養(yǎng)基對照孔。將96孔板置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱再培養(yǎng)24小時-72小時。
[0031]每孔加入4 mg/ml的MTT試劑10 μ 1，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h。
[0032]小心吸取去上清液，每孔加入100 μ I DMSO,放于振蕩器上震蕩15min。
[0033]酶標儀在490nm波長下測吸光值(A值)。
[0034]根據(jù)OD值算出腫瘤細胞抑制率，計算公式為抑制率(IR)= (1-實驗組A值/對照組A值)X 100%。SPSS統(tǒng)計軟件計算各組結(jié)直腸癌細胞系奧沙利鉬IC5tl值。
[0035]實施例3: siRNA轉(zhuǎn)染
[0036]DLDl細胞鋪于24孔板，當細胞密度達到30%_50%時，將150-100pmolsiRNA與250ul無血清培養(yǎng)基混勻，5ul Lipofectamine 2000和另外250ul無血清培養(yǎng)基混勻，室溫放置5分鐘后，兩者混勻，靜置20分鐘，然后加入細胞培養(yǎng)板。
[0037]CCDC88A siRNA 序列
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種T0P2B和(XDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應(yīng)用，其特征在于(XDC88A表達降低后，導(dǎo)致T0P2B基因表達下調(diào)，使用T0P2B的抑制劑阿霉素可以增加結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
3.如權(quán)利要求1所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應(yīng)用，其特征在于抑制CCDC88A能夠提高結(jié)直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性，同時，這種敏感性的增加與T0P2B的表達降低有關(guān)，用T0P2B也能提高直腸癌細胞對奧沙利鉬的敏感性。
4.如權(quán)利要求2所述的T0P2B和CCDC88A在奧沙利鉬敏感性制劑中的應(yīng)用，其特征在于(XDC88A表達降低是通過(XDC88A的干擾序列來實現(xiàn)的，(XDC88A的干擾序列為一 shRNA分子，其堿基正向序列如SEQ ID NO:1所示，其堿基反向序列如SEQ ID: 2所示。
5.一種奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于由CCDC88A和/或T0P2B的抑制劑聯(lián)用奧沙利鉬組成。
6.如權(quán)利要求5所述的奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于所述的T0P2B抑制劑為阿霉素或依托泊苷。
7.如權(quán)利要求5所述的奧沙利鉬藥物組合物，其特征在于所述的藥物組合物中奧沙利鉬的濃度為3μΜ~10 μ Μ, Τ0Ρ2Β抑制劑的濃度為3μΜ~24μΜ。
8.權(quán)利要求5~7中任一所述奧沙利鉬藥物組合物在結(jié)直腸癌抑制藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求8所述的奧沙利鉬藥物組合物在結(jié)直腸癌細胞抑制藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的結(jié)直腸癌細胞為 D2、HCTl 16、HUTU80、SW48、SW480、SW620、SW837、CAC0-2、COl 15、CX-1、C0L0`205、DLD1、GP2D、GPOT、或 HCT15 中的一種或多種。
10.如權(quán)利要求9所述的奧沙利鉬藥物組合物在結(jié)直腸癌細胞抑制藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的結(jié)直腸癌細胞為DLDl。
【文檔編號】A61K31/282GK103520723SQ201310332311
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年8月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月1日
【發(fā)明者】李華光, 張亞杰 申請人:上海銳賽生物技術(shù)有限公司