一種白蛋白納米球的改良制備工藝及內(nèi)耳跨膜給藥緩釋微球載藥體的制作方法
【專利摘要】?jī)?nèi)耳跨圓窗膜給藥緩釋微球載藥體的制備方法，涉及一系列藥物如激素類、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類、抗自由基類、氨基糖甙類、顱內(nèi)抗腫瘤類等藥物的內(nèi)耳轉(zhuǎn)運(yùn)?？商峁┥鲜鏊幬锏陌d和轉(zhuǎn)運(yùn)，避開(kāi)血腦屏障和血迷路屏障，直接通過(guò)鼓膜穿刺技術(shù)跨圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳而發(fā)揮作用。這大大提高內(nèi)耳局部的有效藥物濃度，同時(shí)大大降低傳統(tǒng)全身給藥方式帶來(lái)的毒副作用。其提供一種利用血清白蛋白制備的內(nèi)耳局部給藥的緩釋微球載體制劑及方法。取血清白蛋白溶于含有氯化鈉的水溶液或雙蒸去離子水中，在磁力攪拌下加入無(wú)水乙醇溶液，放入高溫下水浴熱變性固化后離心干燥得到微球載藥體。以羅丹明B為模型藥物與微球共混依靠物理吸附形成粉紅色復(fù)合緩釋微球載制劑。
【專利說(shuō)明】一種白蛋白納米球的改良制備工藝及內(nèi)耳跨膜給藥緩釋微球載藥體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種經(jīng)圓窗膜跨膜治療內(nèi)耳病的緩釋載藥微球制劑及其制備工藝，并指出可以攜帶一系列藥物如激素類、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類、抗自由基類、氨基糖甙類、顱內(nèi)抗腫瘤類等藥物。

【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)耳病(包括耳蝸與前庭系統(tǒng))的臨床發(fā)病率約占耳科疾病的近1/3，如突發(fā)性耳聾、自身免疫性內(nèi)耳病及梅尼埃病等，可導(dǎo)致不同程度的感音神經(jīng)性耳聾和平衡機(jī)能障礙，嚴(yán)重影響患者的工作能力與生活質(zhì)量。
[0003]長(zhǎng)期以來(lái)臨床上常采用全身給藥治療內(nèi)耳病，其中糖皮質(zhì)激素為有效的治療藥物之一。因高血壓、糖尿病等系統(tǒng)性疾病則為全身激素治療的禁忌，使得此類藥物的應(yīng)用受到限制。同時(shí)由于血一迷路屏障的存在，阻抑了藥物在內(nèi)耳的分布與擴(kuò)散，導(dǎo)致治療效果并不理想。內(nèi)耳局部給藥的研究一直受到耳科醫(yī)師的關(guān)注。由于內(nèi)耳與中耳之間存在一種膜性間隔即圓窗膜，其具有生物半透膜的性質(zhì)，能允許多種藥物通過(guò)，這使得藥物可以不經(jīng)過(guò)體循環(huán)而直接進(jìn)入內(nèi)耳即避免了血迷路屏障。目前常用的方法是通過(guò)鼓膜向鼓室內(nèi)注射藥物溶液的策略最具微創(chuàng)性。但該方法的局限性在于不能調(diào)控到達(dá)圓窗膜的藥物濃度及難以有效控制藥物與圓窗膜的接觸時(shí)間，而后者是決定耳蝸內(nèi)藥物濃度的重要因素。結(jié)合近年來(lái)藥物緩釋劑型的發(fā)展，向鼓室內(nèi)注射藥物的緩釋劑型體現(xiàn)了緩釋技術(shù)與微創(chuàng)技術(shù)的結(jié)合，可能成為內(nèi)耳疾病最優(yōu)化的治療方式，成為近年研究熱點(diǎn)領(lǐng)域，鼓室跨膜給藥緩釋劑的研究尤為重要。迄今鼓室內(nèi)藥物治療尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)方案，臨床應(yīng)用亟待規(guī)范。因此，研制新型跨圓窗膜緩釋制劑在耳內(nèi)科學(xué)中具有十分重要的應(yīng)用前景。在生物制藥和組織工程迅猛發(fā)展的今天，控釋系統(tǒng)作為新型的藥物載體具有緩釋、靶向、生物利用度高等特點(diǎn)，是一種非常有前途的控釋系統(tǒng)。血清白蛋白是一種天然的血清中的一種球蛋白,由581個(gè)氨基酸殘基組成，其中35個(gè)半胱氨酸組成17個(gè)二硫鍵，在肽鏈的第34位有一自由巰基。其可與多種陽(yáng)離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結(jié)合，主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營(yíng)養(yǎng)作用。但迄今為止臨床上還沒(méi)有一種真正的內(nèi)耳局部跨膜給藥的緩釋制劑在應(yīng)用，而應(yīng)用血清白蛋白制備載藥微球作為新型跨圓窗膜的藥物載體在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道，故本發(fā)明有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]理想的耳用跨圓窗膜緩釋制劑應(yīng)具備以下特點(diǎn):①藥物迅速在內(nèi)耳達(dá)到理想有效濃度，并維持此濃度適當(dāng)時(shí)間；②在機(jī)體其它部位無(wú)藥物分布或藥物濃度僅在最低范圍；③一旦治療目的達(dá)到，藥物立即從內(nèi)耳消除選擇的緩釋輔料對(duì)機(jī)體無(wú)毒副作用；⑤可注射性；⑥可實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)，使用簡(jiǎn)便，易于推廣。
[0005]白蛋白納米粒是一種相當(dāng)有前途的藥物載體，必須優(yōu)化制備工藝，才能得到滿意的粒徑、粒度分布、表面性質(zhì)，使白蛋白納米粒達(dá)到理想的靶部位。本發(fā)明的制備工藝流程克服了以往的不足，即不再應(yīng)用戊二醛做交聯(lián)劑，也不再進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法將乙醇揮發(fā)出去，而是改用熱變性的固化方法后利用離心和干燥技術(shù)制備出空白白蛋白緩釋載藥微球。這樣有利于減少微球的細(xì)胞毒性使產(chǎn)物更安全，同時(shí)還保留了白蛋白表面大量的有用基團(tuán)，增強(qiáng)其對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用和對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。另外，本發(fā)明將其引入到跨圓窗膜內(nèi)耳給藥領(lǐng)域，不僅能很好發(fā)揮白蛋白自身的營(yíng)養(yǎng)作用，同時(shí)由于起表面結(jié)構(gòu)的特殊性使其更易于吸附攜帶其他藥物而發(fā)揮緩釋轉(zhuǎn)運(yùn)作用。因此本發(fā)明最大的特點(diǎn)在于制備的白蛋白納米粒結(jié)構(gòu)完整，制備方法簡(jiǎn)單、可重復(fù)性良好，不引入毒性敷料、有很好的載藥、緩釋功能，適合藥廠規(guī)模商品化生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]基于目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)內(nèi)耳病(如突發(fā)性耳聾、梅尼埃病、噪聲性耳聾)局部用藥的緩釋制劑在臨床上應(yīng)用。本發(fā)明的目的旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種可在鼓室腔內(nèi)注射給藥、并能跨圓窗膜實(shí)現(xiàn)內(nèi)耳藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的緩釋載藥微球的制備技術(shù)和工藝。這樣既減少了給藥量，增加了內(nèi)耳局部的藥物濃度，同時(shí)也大大降低了傳統(tǒng)給藥方式給患者帶來(lái)的全身毒副作用。
[0007]本發(fā)明所述的內(nèi)耳跨圓窗膜給藥緩釋微球載藥體制備方法如下:
[0008]I)取血清白蛋白溶于氯化鈉水溶液或雙蒸去離子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；
[0009]2)在磁力攪拌下加入無(wú)水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混懸液；
[0010]3)放入水浴鍋中在高溫下進(jìn)行熱變性固化處理，離心、干燥后形成穩(wěn)定的血清白蛋白空白微球；
[0011]4)以羅丹明B為模型藥物與微球共混依靠物理吸附形成粉紅色復(fù)合緩釋微球載制劑。
[0012]可以包載一系列藥物如激素類、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類、抗自由基類、氨基糖甙類、顱內(nèi)抗腫瘤類等藥物。制備過(guò)程中血清白蛋白配制的濃度是5?15mg/ml，所述的氯化鈉的濃度為5mmol?20mmol。按體積比氯化鈉溶液與無(wú)水乙醇的加入比例為1: 3?1: 8。無(wú)水乙醇的加入速度控制在1.0?3.0ml/min。熱變性溫度控制在70?100°C，固化時(shí)間控制在1min?2h。離心后處理為真空干燥。加入的模型藥物為物理混合吸附方式形成復(fù)合緩釋制劑。
[0013]總之，本發(fā)明采用改良去溶劑方法制備緩釋載藥微球，制備過(guò)程中血清白蛋白配制的濃度是5?15mg/ml,氯化鈉水溶液的濃度控制在5mmol?20mmol之間，氯化鈉水溶液與無(wú)水乙醇溶液的體積比為1: 3?1: 8。無(wú)水乙醇的加入速度控制在1.0?3.0ml/min0本發(fā)明確定了改良制備白蛋白納米粒的優(yōu)化工藝，制備的白蛋白納米粒結(jié)構(gòu)完整，粒徑大小均一，理化性質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好，具有良好的控釋能力，載藥率最高可達(dá)到15%，包封率可達(dá)到40%，制備方法簡(jiǎn)單、無(wú)毒性敷料、可以很好的包載藥、體外釋放具有良好的緩釋功能，且工藝成本低，無(wú)毒高效，可望實(shí)現(xiàn)更大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0014]圖1BSA納米球熱變性的掃描電鏡(a)和粒徑分布(b)，其中(a)插圖為透射電鏡的結(jié)果。
[0015]圖2載有RB的BSA納米球的掃描電鏡(a)和激光共聚焦顯微鏡下觀察(b)，BSA納米球的載藥和包封率隨投藥量增加的變化曲線(c)，在PBS體系下進(jìn)行的藥物釋放(d)。(a)中插圖是其透射電鏡的結(jié)果。
[0016]圖3以L929細(xì)胞分別評(píng)價(jià)熱變性固定后BSA納米球的細(xì)胞毒性，用三組數(shù)據(jù)的平均值計(jì)算得出，P < 0.001.
[0017]圖4光鏡下L929攝取CCK-8的細(xì)胞形態(tài)，加入CCK-8前對(duì)照組(a)，加入CCK-8后4小時(shí)對(duì)照組(b)，熱變性(C)。
[0018]圖5載有RB熱變性的BSA納米球注射到豚鼠聽(tīng)泡內(nèi)的不同時(shí)間段的活體成像，即刻成像(a)，三日后成像(b)。
[0019]圖6載有RB的BSA納米球經(jīng)圓窗膜擴(kuò)散至內(nèi)耳骨螺旋板的影象，圓窗膜的熒光顯微鏡下手術(shù)后即刻觀察結(jié)果(a)，手術(shù)三日后內(nèi)耳骨螺旋板的掃描觀察結(jié)果(b)。插圖是BSA納米球聚集的放大圖示。
[0020]圖7經(jīng)過(guò)改良處理后的BSA納米球的掃描電鏡觀察，可見(jiàn)納米球大小均一，分散良好。
[0021]圖8豚鼠圓窗膜掃描電鏡影象(箭頭所指處為納米球在圓窗膜內(nèi)跨越通過(guò)狀態(tài))。

【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1
[0023]取血清白蛋白50mg溶于1mmol氯化鈉水溶液或雙蒸去離子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在磁力攪拌下加入無(wú)水乙醇溶液，氯化鈉水溶液與無(wú)水乙醇溶液的體積比為1: 3?1: 8,無(wú)水乙醇的加入速度控制在1.0?3.0ml/min,形成乳白色血清白蛋白混懸液；放入水浴鍋中在70°C下30min進(jìn)行熱變性固化處理，離心、干燥后形成穩(wěn)定的血清白蛋白空白微球(見(jiàn)圖la)。微球的粒徑分布(見(jiàn)圖lb)。以羅丹明B為模型藥物與微球共混依靠物理吸附形成粉紅色復(fù)合緩釋微球載制劑(見(jiàn)圖2a)。微球理化性質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好，具有可注射性，可降解性。適合在局部跨膜注射給藥。微球的載藥率為2%?15%，包封率為10%?40% (見(jiàn)圖2c)。
[0024]實(shí)施例2
[0025]取50mg血清白蛋白空白微球溶于5mlPBS緩沖液中充分混合，加入1mg羅丹明B孵育lOmin，放入專用的體外藥物釋放的小室內(nèi)，按照每隔lh、4h、8h、12h、24h等順序依次取出擴(kuò)散池中的液體，在紫外分光光度計(jì)560nm波長(zhǎng)測(cè)吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出藥物釋放的計(jì)量，算累計(jì)藥物釋放量，換算成百分比例，即累積釋放藥物的百分比，微球的體外釋放曲線表示一周內(nèi)藥物的累計(jì)釋放量為12%。(見(jiàn)圖2d)。
[0026]實(shí)施例3
[0027]取血清白蛋白50mg溶于1mmol氯化鈉水溶液或雙蒸去離子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液；在磁力攪拌下加入無(wú)水乙醇溶液，氯化鈉水溶液與無(wú)水乙醇溶液的體積比為1: 3?1: 8,無(wú)水乙醇的加入速度控制在1.0?3.0ml/min,形成乳白色血清白蛋白混懸液；放入水浴鍋中在70°C下30min進(jìn)行熱變性固化處理，離心、干燥后形成穩(wěn)定的血清白蛋白空白微球。然后進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT法)，提示通過(guò)熱變性血清白蛋白的固化，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)大致相同，甚至可以發(fā)現(xiàn)熱變性實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)要優(yōu)于對(duì)照空白組和戊二醛交聯(lián)組(見(jiàn)圖3、4)。
【權(quán)利要求】
1.內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于其步驟如下: 1)取血清白蛋白溶于氯化鈉水溶液或雙蒸去離子水中，得到含有血清白蛋白的水溶液； 2)在磁力攪拌下加入無(wú)水乙醇溶液，形成乳白色血清白蛋白混懸液； 3)放入水浴鍋中在高溫下進(jìn)行熱變性固化處理，離心、干燥后形成穩(wěn)定的血清白蛋白空白微球； 4)以羅丹明B為模型藥物與微球共混依靠物理吸附形成粉紅色復(fù)合緩釋微球載制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征為可以包載一系列藥物如激素類、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類、抗自由基類、治療眩暈類、顱內(nèi)抗腫瘤類等藥物。
3.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述的制備過(guò)程中血清白蛋白配制的濃度是10?15mg/ml。
4.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述的氯化鈉的濃度為5mmol?20mmol。
5.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于按體積比氯化鈉溶液與無(wú)水乙醇的加入比例為1: 3?1: 8。
6.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于無(wú)水乙醇的加入的速度控制在2.0?3.0ml/min。
7.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于熱變性溫度控制在70?100°C，固化時(shí)間控制在1min?2h。
8.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于離心后處理為真空干燥。
9.如權(quán)利要求所述的的內(nèi)耳跨圓窗膜局部給藥緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于加入的模型藥物為物理混合吸附方式形成復(fù)合緩釋制劑。
【文檔編號(hào)】A61P27/16GK104337769SQ201310337363
【公開(kāi)日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】于湛 申請(qǐng)人:于湛