Talen在制備靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及TALEN技術(shù)在靶向乙肝病毒基因組即cccDNA及治療慢性乙肝病毒感染中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶在制備靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，其中靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的活性成分為針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶。本發(fā)明還提供了一種針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，以及利用其抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中的乙肝病毒的方法。本發(fā)明采用TALEN技術(shù)在細(xì)胞系中可通過特異性靶向乙肝病毒cccDNA顯著抑制乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄活性并導(dǎo)致乙肝病毒基因組DNA含量的下降。
【專利說明】TALEN在制備靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及TALEN技術(shù)在靶向乙肝病毒基因組及治療慢性乙肝病毒感染中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]乙肝病毒(HBV)是一種肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纖維化和肝癌嚴(yán)重危害著人類的健康。全球約3.5億人慢性感染有乙肝，其中亞洲占約3/4。
[0003]乙肝病毒病毒核衣殼內(nèi)的乙肝病毒基因組是含有不完全雙鏈的DNA (rcDNA),在病毒感染人肝細(xì)胞后，隨著核衣殼脫去，rcDNA會入核并經(jīng)由修補(bǔ)機(jī)制形成共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA (cccDNA)。cccDNA可經(jīng)由宿主RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄出包括乙肝病毒病毒前基因組RNA(PgRNA)在內(nèi)的多條長短不一的乙肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作為模板進(jìn)行翻譯，其中PgRNA還可以作為模板通過逆轉(zhuǎn)錄生成rcDNA，進(jìn)而包裝入病毒核衣殼蛋白而進(jìn)入新的一輪復(fù)制周期。此外，研究表明cccDNA可以結(jié)合宿主組蛋白以形成微小染色體結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定以致cccDNA的最終消失可能要伴隨其所在肝細(xì)胞的死亡。正是由于cccDNA在乙肝病毒復(fù)制過程中作為DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA很難徹底于肝內(nèi)清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再發(fā)及治療停止耐藥中扮演重要角色。
[0004]當(dāng)前用于治療慢性乙肝病毒感染的藥物有干擾素α (IFN-α )或阻斷病毒RNA或DNA合成的核苷類似物，但是IFN- α治療應(yīng)答率僅30%而核苷類似物的長期使用易導(dǎo)致乙肝病毒耐藥，同時(shí)這兩種藥物但都不直接靶向cccDNA，這也是目前的治療手段應(yīng)用于許多慢性乙肝病毒感染患者中效果不佳且易引起復(fù)發(fā)的原因之一。發(fā)明一種特異性靶向cccDNA的治療方法對于乙肝病毒治療乃至根治乙肝病毒慢性感染有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子(Transcript1nactivator-1ikeeffectors, TALE)核酸酶在制備祀向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種針對乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶。
[0007]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中乙肝病毒的方法。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先設(shè)計(jì)了兩對針對乙肝病毒基因組的特異性TALEN,在設(shè)計(jì)過程除考慮TALEN識別長度(12_19bp)及左右臂間隔長度(14_19bp)外還額外考慮了以下兩點(diǎn)以保證TALEN對乙肝病毒的有效性:
[0009]1、根據(jù)NCBI公布的已有乙肝病毒A型、B型、C型序列(其中我國主要是B型和C型)，下載并比對了各型別代表株的序列，確定了各型別乙肝病毒基因組的保守序列區(qū)段，進(jìn)而針對這些區(qū)段設(shè)計(jì)TALEN，以利于設(shè)計(jì)出的TALEN可以廣譜靶向各型別的乙肝病毒。
[0010]2、設(shè)計(jì)TLANE時(shí)避開了根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可能結(jié)合有宿主組蛋白的cccDNA區(qū)段，以利于TALEN結(jié)合至cccDNA。
[0011]本發(fā)明最終設(shè)計(jì)并構(gòu)建完成的TALEN分別針對在cccDNA序列中轉(zhuǎn)錄pgRNA相關(guān)的片段的頭尾，其中頭部設(shè)計(jì)在與Core、Po 1、HBeAg和pgRNA轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的區(qū)段；尾部設(shè)計(jì)在HBx啟動子區(qū)域，其亦為乙肝病毒其他各條病毒RNA轉(zhuǎn)錄所共有的區(qū)域。
[0012]利用細(xì)胞和小鼠模型，經(jīng)過無數(shù)次試驗(yàn)摸索以及反復(fù)優(yōu)化條件，本發(fā)明最終獲得了一種TALEN,其不僅可以抑制乙肝病毒抗原標(biāo)志物HBsAg和HBeAg的產(chǎn)生,并且可以部分降低cccDNA的含量及可以使cccDNA特定位點(diǎn)發(fā)生突變進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活；此外,在合適時(shí)間加入IFN- α ( α干擾素)等乙肝治療藥物可以進(jìn)一步降低pgRNA轉(zhuǎn)錄水平和cccDNA的含量，顯示聯(lián)用TALEN和其他抗病毒及免疫調(diào)節(jié)藥物在治療乃至根治乙肝病毒感染中的可能性。
[0013]本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶在制備抑制乙肝病毒藥物中的應(yīng)用。
[0014]所述的抑制乙肝病毒藥物的活性成分是針對乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶。
[0015]本發(fā)明提供了一種抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中乙肝病毒的方法，將針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)入含有乙肝病毒的體外培養(yǎng)細(xì)胞。
[0016]所述的體外培養(yǎng)細(xì)胞源自肝細(xì)胞。
[0017]所述的體外培養(yǎng)細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
[0018]所述的抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白轉(zhuǎn)錄和cccDNA 活性。
[0019]本發(fā)明提供的種抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中乙肝病毒的方法，包括如下步驟:
[0020](I)設(shè)計(jì)并預(yù)處理針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶；
[0021](2)將步驟(I)所得的針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)細(xì)胞。
[0022]針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)1-4天，能夠達(dá)到較好的抑制乙肝病毒的效果。
[0023]較好的，針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，然后加入IFN-α，從而達(dá)到更好的抑制乙肝病毒的效果。
[0024]另一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶特異性針對乙肝病毒基因組。
[0025]所述的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶包括針對在cccDNA序列中轉(zhuǎn)錄pgRNA片段的頭部和尾部；其中頭部設(shè)計(jì)在與Core、Po 1、HBeAg和pgRNA的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的區(qū)段，尾部設(shè)計(jì)在HBx啟動子區(qū)域。
[0026]另一方面，本發(fā)明提供了所述的方法的應(yīng)用，即利用乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶加入收到乙肝病毒感染的細(xì)胞中，抑制乙肝病毒HbeAg、HbsAg,HBcAg病毒蛋白的產(chǎn)生，抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，或者抑制pgRNA、cccDNA的含量。
[0027]本發(fā)明提供了 TALEN在靶向乙肝病毒cccDNA及治療慢性乙肝中的作用，并為TALEN最終應(yīng)用于乙肝慢性感染的治療展示了非常好的前景并提供了實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。
[0028]本發(fā)明經(jīng)由細(xì)胞和動物模型水平的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，針對乙肝病毒cccDNA所設(shè)計(jì)的TALEN對乙肝病毒編碼蛋白的產(chǎn)生、基因組的轉(zhuǎn)錄活性、及cccDNA含量均有顯著抑制作用；同時(shí)，TALEN與IFN等藥物聯(lián)用具有更強(qiáng)的抗病毒效果。本發(fā)明將TALEN技術(shù)用于靶向乙肝病毒cccDNA，為TALEN最終應(yīng)用于乙肝慢性感染的治療及根治展示了非常好的前景并提供了實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)，同時(shí)為優(yōu)化治療乙肝病毒慢性感染提供了新的思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1.乙肝病毒的cccDNA結(jié)構(gòu)以及TALEN設(shè)計(jì)。
[0030]圖2.TALEN 對 HBsAg，HBeAg, pgRNA 和 cccDNA 含量等的影響。
[0031]圖3.小鼠高壓尾靜脈注射模型驗(yàn)證TALEN抗乙肝病毒作用。
[0032]圖4.TALEN和IFN聯(lián)用顯示出更強(qiáng)的抑制乙肝病毒效應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明設(shè)計(jì)了特異性靶向乙肝病毒cccDNA的TALEN。該發(fā)明為人們靶向cccDNA并進(jìn)而調(diào)控cccDNA轉(zhuǎn)錄活性提供了實(shí)用的手段，更為有效治療甚至根治慢性乙肝病毒感染提供了新的策略。
[0034]有報(bào)道顯示，鋅指蛋白(ZNPs)可以直接結(jié)合鴨乙肝病毒的cccDNA，而針對乙肝病毒的鋅指蛋白偶聯(lián)的核酸酶(ZFNs)可以顯著降低pgRNA的水平，為人們控制乙肝病毒感染提供了新的思路。轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子(Transcript1nactivator-likeeffectors,TALE)技術(shù)是一種薪新的分子生物學(xué)工具。科學(xué)家發(fā)現(xiàn),來自植物細(xì)菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的?；赥ALE技術(shù)的TALE核酸酶(TALEnuclease，TALEN)技術(shù)可構(gòu)建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點(diǎn)打斷目標(biāo)基因DNA，進(jìn)而調(diào)控該位點(diǎn)所在基因的轉(zhuǎn)錄和功能。TALEN技術(shù)克服了常規(guī)的ZFN方法不能識別任意目標(biāo)基因序列，以及識別序列經(jīng)常受上下游序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的活性，且細(xì)胞毒性低、脫靶率低，是一種簡單便捷的基因靶向技術(shù)。
[0035]本發(fā)明的TALEN技術(shù)在干預(yù)乙肝病毒感染中，是一種全新的靶向乙肝病毒基因組DNA (即cccDNA)及治療和根治慢性乙肝病毒感染的策略和手段。
[0036]TALEN技術(shù)可以應(yīng)用于革巴向乙肝病毒cccDNA。
[0037]TALEN技術(shù)可以應(yīng)用于抑制乙肝病毒感染。
[0038]TALEN技術(shù)可以和其他抗病毒及免疫調(diào)節(jié)藥物聯(lián)用用于治療乙肝病毒感染。
[0039]TALEN技術(shù)對乙肝病毒HBeAg，HBsAg, HBcAg等病毒蛋白的產(chǎn)生，cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，及pgRNA和cccDNA含量的抑制作用。
[0040]為便于理解，以下將通過具體的實(shí)施例和附圖對本發(fā)明的TALEN設(shè)計(jì)及應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，該附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出修改，這些修改也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0041 ] 實(shí)施例1、HBV復(fù)制型細(xì)胞系模型實(shí)施方式
[0042]將具有靶向乙肝病毒cccDNA功能的TALEN轉(zhuǎn)染入乙肝病毒復(fù)制的細(xì)胞，乙肝病毒的病毒蛋白轉(zhuǎn)錄和cccDNA活性均受顯著抑制。
[0043](I)肝癌細(xì)胞系Huh7的培養(yǎng):采用DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素和400mg/mlG418)在5%C02飽和水蒸氣環(huán)境下37°C恒溫培養(yǎng)；
[0044](2)采用羅氏公司生產(chǎn)的轉(zhuǎn)染試劑將乙肝病毒復(fù)制型質(zhì)粒:體外酶切線性化了的乙肝病毒基因組質(zhì)粒(A基因型)，P乙肝病毒1.3 (B基因型)，P乙肝病毒1.3 (C基因型)或pCMV-乙肝病毒(D基因型)等導(dǎo)入Huh7細(xì)胞；
[0045](3)將編碼TALEN (特異靶向cccDNA)的質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒同樣以轉(zhuǎn)染試劑導(dǎo)入細(xì)胞；
[0046](4)細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率平衡的基礎(chǔ)上，收集細(xì)胞上清檢測病毒抗原標(biāo)志物HBeAg，HBsAg ;固定或裂解細(xì)胞，檢測胞漿中HBcAg，及pgRNA和cccDNA等的含量；
[0047](5)結(jié)果顯示TALEN處理組相較空白處理組，乙肝病毒病毒蛋白和pgRNA及cccDNA水平全面下調(diào)，其中HBeAg下調(diào)可達(dá)70%，pgRNA和cccDNA下調(diào)50%左右，另表達(dá)有TALENs的細(xì)胞中鮮見HBcAg表達(dá)。
[0048](6)若在轉(zhuǎn)染TALEN后36小時(shí)加入1000IU/mlIFN-α，在72小時(shí)時(shí)所檢測得到的抑制效果比單獨(dú)使用TALEN或IFN- α進(jìn)一步增強(qiáng)近一倍，提示TALEN和IFN等其他抗病毒藥物具有協(xié)同作用。
[0049]上述實(shí)例說明，本發(fā)明采用TALEN技術(shù)在細(xì)胞系中可通過特異性靶向乙肝病毒cccDNA顯著抑制乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄活性并導(dǎo)致乙肝病毒基因組DNA含量的下降。
[0050]實(shí)施例2、小鼠模型實(shí)施方式
[0051](1)7周齡C3H/HeN雄性小鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中；
[0052](2)高壓尾靜脈注射以PBS稀釋的乙肝病毒線性化質(zhì)粒和TALEN或?qū)φ召|(zhì)粒；
[0053](3)注射后3天取血檢測血清中HBsAg和HBeAg含量，注射后6天老鼠取材，其中血清用于檢測HBsAg，HBeAg和乙肝病毒DNA，肝臟用于檢測肝內(nèi)pgRNA和cccDNA ；
[0054](4)結(jié)果顯示，TALEN組血清和肝臟中病毒蛋白和核酸含量均顯著低于對照組。其中HBsAg和HBeAg含量下降約50%，血清病毒DNA及肝內(nèi)pgRNA和cccDNA下降約60_80%。
[0055]上述實(shí)例說明本發(fā)明采用TALEN技術(shù)在小鼠體內(nèi)通過特異性靶向乙肝病毒cccDNA，對乙肝病毒病毒蛋白的產(chǎn)生、基因組的轉(zhuǎn)錄活性、及乙肝病毒基因組DNA含量均有顯著抑制作用。
【權(quán)利要求】
1.轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶在制備靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，其特征在于，靶向干預(yù)乙肝病毒的藥物中的活性成分為針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的干預(yù)乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白轉(zhuǎn)錄和⑶⑶嫩活性。
3.一種抑制體外培養(yǎng)細(xì)胞中乙肝病毒的方法，其特征在于，所述的方法是將針對乙肝病毒的轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸酶加入體外培養(yǎng)細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的體外培養(yǎng)細(xì)胞源自肝細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的體外培養(yǎng)細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟: (1)設(shè)計(jì)并預(yù)處理針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶； (2)將步驟(1)所得的針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)1-4天。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，針對乙肝病毒基因組的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，然后加入11^-0。
9.一種轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶特異性針對乙肝病毒基因組。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶包括針對在⑶⑶嫩序列中轉(zhuǎn)錄？成嫩片段的頭部和尾部；其中頭部設(shè)計(jì)在與001*6、？01、耶6^和的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的區(qū)段，尾部設(shè)計(jì)在啟動子區(qū)域。
【文檔編號】A61P31/20GK104367994SQ201310354673
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】袁正宏, 陳捷亮 申請人:復(fù)旦大學(xué)