一種新型狂犬病疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型狂犬病疫苗及其制備方法。本發(fā)明人基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體，構建了一種新型狂犬病疫苗載體。本發(fā)明還提供了以所述的疫苗載體制備的可高效表達且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
【專利說明】一種新型狂犬病疫苗及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術和病毒學領域；更具體地，本發(fā)明涉及一種新型狂犬病疫苗及其制備方法。
【背景技術】
[0002]狂犬病是由狂犬病毒引發(fā)的以侵犯中樞神經系統(tǒng)為特征的致死性人畜共患傳染病?？袢≡谌蛎磕陮е?萬多人死亡，給生命健康和社會經濟造成巨大影響?？袢《臼菃喂韶撴淩NA病毒，屬于彈狀病毒科彈狀病毒屬，外形呈彈狀，核衣殼呈螺旋對稱，表面具有包膜?？袢《就饽ど系奶堑鞍?Gp)抗原是病毒表面棘突的成分，有凝集細胞的能力，能與乙酰膽堿受體結合使病毒具有嗜神經性；糖蛋白能誘導機體產生中和抗體并誘導細胞免疫，中和抗體對于病毒感染具有完全保護作用。按世界衛(wèi)生組織(WHO)的要求，人或動物血清狂犬病毒中和抗體的效價高于0.5IU/ml被認為達到有效保護水平(Nishizono A等，Evaluation of an improved rapid neutralizing antibody detection test(RAPINA)for qualitative and semiquantitative detection of rabies neutralizing antibodyin humans and dogs.Vaccine.2012;30 (26):3891-6)。
[0003]病犬是狂犬病主要的傳染源，其次是貓、豬及狐貍等各種野生或家養(yǎng)動物。狂犬病毒主要的傳播方式是經咬傷傳播或病犬唾液經損傷的粘膜或皮膚而入侵。另有報道證實狂犬病毒可通過氣溶膠散布傳播，動物通過吸入途徑使狂犬病毒進入嗅神經末梢從而迅速到達中樞神經系統(tǒng)。因此犬等與人類密切接觸是導致人狂犬病發(fā)病率居高不下的重要因素。接種狂犬病疫苗是預防和控制狂犬病發(fā)生的有效途徑，目前廣泛采用的原代細胞培養(yǎng)疫苗和傳代細胞精制純化疫苗由于生產成本昂貴，給藥次數較多，以及需要聯合佐劑等諸多限制因素，不便應用于狂犬病毒儲存宿主的免疫接種。因此，在我國，制備質優(yōu)、價廉、方便、易接種的狂犬病疫苗對于預防控制動物狂犬病十分重要。有效控制狂犬病毒的傳染源、切斷其傳播途徑有賴于新一代基因工程疫苗的發(fā)展。
[0004]腺病毒載體在疫苗研究以及基因治療方面的應用已取得一定成果，如重組腺病毒AdHu5表達p53( “今又生”)已在腫瘤基因治療方面發(fā)揮重要作用。在病毒防治的研究中，利用腺病毒載體表達外源基因制備重組基因工程疫苗以及通過結合RNA干擾技術來阻礙病毒依賴宿主的生活周期等均有廣泛報道。腺病毒作為載體應用于疫苗的開發(fā)具有以下優(yōu)點:①感染的宿主范圍廣，能感染分裂和非分裂細胞，導入細胞的效率較高。②遺傳背景清楚，致病性低，不整合到染色體中，不會導致插入突變。③外源基因表達水平高，可以容納約8-10kb的外源基因，能同時表達多個基因。④增殖速度快，易培養(yǎng)，可以產生較高的病毒滴度，適用多種途徑免疫。⑤免疫原性強，能夠協(xié)同外源蛋白引起強烈的特異性細胞免疫和體液免疫?；谏鲜鰞?yōu)點，腺病毒是一種大有潛力值得試驗和推廣的疫苗載體，在新型基因工程疫苗研究中越來越顯示出良好的應用前景。
[0005]由于常用的人血清型腺病毒如AdHu5、AdHu2等普遍感染人，因此人群中60_80%的個體存在相應的中和抗體，將削弱以AdHu5、AdHu2等為載體的疫苗的免疫效果。為克服這個問題，開發(fā)稀有人血清型或來自其它動物來源的腺病毒為疫苗或基因治療載體是有必要的。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種狂犬病疫苗及其制備方法。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供一種狂犬病疫苗載體，所述表達載體包括:復制缺陷型重組腺病毒載體，以及連接于該載體酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I之間的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的編碼序列；
[0008]其中，所述的復制缺陷型重組腺病毒載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列(Linker)替換；所述的連接序列中設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0009]在一個優(yōu)選例中，所述的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的編碼序列如SEQ ID NO:1所
示ο
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的連接序列如SEQ ID N0:3所示。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0012]在另一優(yōu)選例中，所述的復制缺陷型重組腺病毒載體制備方法為:
[0013]將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列；
[0014]所述的4個片段分別是:
[0015]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位；
[0016]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位；
[0017]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和
[0018]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。
[0019]在另一優(yōu)選例中，各片段的氨基酸位點計算基于GenBank登錄號AC_000011的核苷酸序列。
[0020]在另一優(yōu)選例中，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點切除腺病毒El的大部份編碼序列，大小約為3.5kb，將其替換為含有內切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的骨架載體是PNEB193載體。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備狂犬病疫苗的方法，所述方法包括:
[0023](I)提供所述的狂犬病疫苗載體；
[0024](2)將(I)的狂犬病疫苗載體轉染病毒生產細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
[0025]在本發(fā)明的另一方面，提供一種狂犬病疫苗，所述疫苗由上面所述的方法制備獲得。
[0026]在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥盒，所述的藥盒中含有所述的狂犬病疫苗。
[0027]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括:前面所述的狂犬病疫苗載體。
[0028]在一個優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括:病毒生產細胞。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的病毒生產細胞是HEK293細胞。[0030]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1、新型狂犬病疫苗載體構建策略。
[0032]圖2、pUC57-0/Gp載體和腺病毒穿梭載體pAdshuttle_CMV/Gp酶切鑒定。
[0033]A、酶切鑒定。l、lKb DNA marker ;2、Nhe I 和 Xba I 雙酶切鑒定 pUC57_0/Gp 載體；
3、Nhe I和Xba I雙酶切鑒定pshuttle-CMV載體。
[0034]B、Nhe I 和 Xba I 雙酶切鑒定 pAdshuttle-CMV/Gp 載體；I: IKb DNA laddermarker ;2,3、反向克??；4、正確克隆。
[0035]C、Nhe I 和 EcoR I 雙酶切鑒定 pAdshuttle-CMV/Gp 載體。
[0036]圖3、重組腺病毒載體pAdC68_Gp和重組病毒基因組酶切鑒定。
[0037]1、IKb DNA ladder marker ；
[0038]2，3，4、Bgl II，BamH I 和 Xho I 酶切 pAdC68_Gp 重組腺病毒基因組。
[0039]5、IKb DNA ladder marker ；
[0040]6，7，8、Bgl II，BamH I 和 Xho I 酶切重組腺病毒質粒 DNA pAdC68_Gp。
[0041]圖4、重組腺病毒感染滴度的檢測。
[0042]A、重組腺病毒 pAdC68-Gp 以 IO8 和 101Qvps 感染 HEK293 細胞(B卩 293A) (24h)。
[0043]B、重組腺病毒 pAdC68_Gp 以 IO8 和 101Qvps 感染 Huh7 細胞(24h)。
[0044]圖5、重組腺病毒遺傳穩(wěn)定性的檢測。
[0045]A、重組腺病毒AdC68_Gp基因組第5代和第15代的酶切鑒定。
[0046]1、IKb DNA ladder marker?
[0047]2，3，4、Bgl II，BamH I和Xho I酶切第5代重組腺病毒基因組。
[0048]5、IKb DNA ladder marker?
[0049]6，7，8、Bgl II，BamH I和Xho I酶切第15代重組腺病毒基因組。
[0050]B、第15代重組腺病毒pAdC68-Gp以101Qvps分別感染HEK293和Huh7細胞(24h)。
[0051]圖6、血清中狂犬病毒中和抗體效價檢測。左:重組腺病毒AdC68_Gp免疫組小鼠中和抗體效價；右:腺病毒空載體AdC68-印t免疫小鼠中和抗體效價。
【具體實施方式】
[0052]本發(fā)明人經過深入的研究，通過改進構建方法，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體，構建了一種新型狂犬病疫苗載體。所述的疫苗載體可應用于制備可高效表達且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0053]為解決現有技術的問題，本發(fā)明人選擇稀有血清型或其他種屬來源的腺病毒作為疫苗載體，由于人群一般不存在針對黑猩猩型腺病毒的中和抗體，以黑猩猩型腺病毒為疫苗載體可獲得較好的免疫效果。因此，本發(fā)明人構建了黑猩猩型腺病毒AdC68為復制缺陷型重組表達載體，經檢驗該載體具有良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性。在該AdC68載體的基礎上，本發(fā)明人進一步制備了新型狂犬病疫苗。該新型疫苗免疫小鼠后，能有效地誘導針對狂犬病毒的中和抗體，對病毒感染產生強大的抵抗力。[0054]因此，本發(fā)明提供了一種腺病毒表達載體，所述表達載體包括:復制缺陷型重組腺病毒載體，以及連接于該載體酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I之間的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的編碼序列；其中，所述的復制缺陷型重組腺病毒載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列(Linker)替換；所述的連接序列中設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0055]針對腺病毒AdC68基因組，本發(fā)明人經過細致的序列比對，最終確定了應用酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I作為外源基因的插入位點，從而不會導致在腺病毒表達載體的其它位置造成剪切。
[0056]由于腺病毒的基因組比較大，大約有36kb，使直接克隆重組腺病毒載體成為技術瓶頸。因此，本發(fā)明人開發(fā)了能通過酶切連接的快速方法直接構建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作為疫苗載體，即充分利用腺病毒基因組中存在的某些酶切位點。根據對腺病毒AdC68整個基因組序列的分析，將其分成KE，AK，XA和PX四個片段，然后通過酶切連接的方法再逐步克隆到PNEB193的載體中，最終獲得一個復制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點刪除了與腺病毒復制相關的El部分，大小約為3.5kb，將其替換為含有歸位內切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。此方法構建的復制缺陷型腺病毒AdC68經過線性化能夠在HEK293細胞中成功包裝并擴增出遺傳穩(wěn)定的重組腺病毒。KE，AK, XA和PX四個片段之間可包括限制性的酶切位點，這樣有利于各元件的有機連接。
[0057]所述的表達載體通常還含有復制起點和/或標記基因等。本領域的技術人員熟知的方法能用于構建本發(fā)明所需的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子(如CMV)上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。
[0058]本發(fā)明還提供了密碼子優(yōu)化的狂犬病毒糖蛋白(Gp)抗原的編碼序列，如SEQ IDNO:1所示，其能夠實現高效的表達。
[0059]本發(fā)明還提供了一種制備腺病毒表達載體的方法，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El編碼序列；所述的連接序列中，設置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0060]本發(fā)明還提供了一種制備狂犬病疫苗的方法，所述方法包括:提供所述的狂犬病疫苗載體；將該表達載體轉染病毒生產細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
[0061]獲得所述腺病毒表達載體后，將之轉染病毒生產細胞，進行病毒的繁殖。轉染后的一段時間后，可以收獲病毒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，收獲的病毒可反復感染病毒生產細胞，持續(xù)傳代。病毒滴度(TCID5tl)的測定可以根據本領域常規(guī)方法進行。因此，本發(fā)明還提供了一種狂犬病疫苗，所述疫苗由本發(fā)明所述的方法制備獲得。
[0062]基于本發(fā)明的新改進，本發(fā)明還提供了一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括所述的狂犬病疫苗載體。
[0063]所述的試劑盒還可包括病毒生產細胞，如HEK293細胞。此外，所述的試劑盒中還可包括說明疫苗制備方法的使用說明書。
[0064]下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。 [0065]1、材料和方法
[0066]1.1質粒及菌株
[0067]穿梭載體pShuttle-CMV 購自 Clontech Laboratories, Inc。
[0068]野生型腺病毒AdC68 (GenBank 登錄號 AC_000011)購于 ATCC。
[0069]pNEBl93 質粒購自 New England Biolabs。
[0070]攜帶有優(yōu)化密碼子的目的基因Gp (ERA株)的重組質粒PUC57_0/Gp由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0071]感受態(tài)菌株Stbl2 購自 Invitrogen。
[0072]腺病毒包裝細胞系HEK293 (293A)細胞購自ATCC。
[0073]El缺失的復制缺陷型腺病毒載體pAdC68 (pAdC68-El_deleted)構建方法如下:
[0074](I)質粒 PNEBl93-KE 的構建
[0075]根據pNEB193載體上的多克隆位點和腺病毒AdC68基因組的序列，設計擴增KE片段的引物(表1)，PCR擴增目的產物KE片段。PCR擴增體系總體積為50uL，反應循環(huán)參數為:95°C預變性 5min ;94°C變性 Imin ;退火溫度 57°C 30s ;72°C延伸 2.2min。EcoR I 和 KpnI雙酶切PCR擴增的KE片段，瓊脂糖凝膠純化KE片段，連接至經相同酶切的PNEB193載體，轉化入DH5 α感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，經酶切和測序鑒定得到ρΝΕΒ193-ΚΕ。
[0076]表1、PCR引物序列
[0077]
擴增片段_引物序歹!J_
KE F: CGGAATTCCCTTAATTAACCATCATCAATAATAT (SEQ ID NO: 5)
R: CACCACCTCCCGGTACCACA (SEQ ID NO: 6)
PX F: GGG1TTAAACCCTTAATTAACCATCTTCAATA.ATATACCTCAAAC(SEQ ID NO: 7)
R: CCGGAATTCCCGTTTCTAGAAACTGACAACCYSEQ ID NO: 8)
Linker F: AGCTACGTAGTTCCGCGCACATTTCCCCGAA(SEQ ID NO: 9)
_R: CGACATATGCGCGCGTTGGCCGATTCATTA(SEQ ID NO: 10)_
[0078]下劃線標示限制性內切酶位點。
[0079](2)質粒 ρΝΕΒ193_ΚΕ_ΑΚ 的構建
[0080]Asc I和Kpn I雙酶切AdC68基因組，低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收AK片段，連接至經相同酶切的PNEB193-KE載體，轉化入Stbl2感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，經酶切鑒定得到 pNEB193-KE-AK。
[0081](3)質粒 ρΝΕΒ193_ΚΕ-ΑΚ_ΧΑ 的構建
[0082]Xba I和Asc I雙酶切AdC68基因組，由于Asc I在腺病毒AdC68存在三個酶切位點，對Asc I進行部分酶切，置于37°C酶切AdC68基因組10s，低熔點凝膠回收酶切的最大的XA片段，連接至經相同酶切的pNEB193-KE-AK載體，酶切鑒定得到pNEB193_KE-AK_XA。
[0083](4)質粒 pNEB193-PX 的構建[0084]根據PNEB193載體上的多克隆位點和腺病毒基因組的序列，設計擴增PX片段的引物(表1)，PCR擴增目的產物PX片段。PCR擴增體系總體積為50uL，反應循環(huán)參數為:95°C預變性5min ;94°C變性Imin ;退火溫度55°C Imin ;72°C延伸6min。Pme I和Xba I雙酶切PCR擴增回收的PX片段，瓊脂糖凝膠回收目的產物PX片段，連接至經相同酶切的PNEB193載體，轉化入Stbl2感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，其中靠近腺病毒AdC68左端ITR的區(qū)域經測序鑒定。Xba I酶切腺病毒AdC68基因組，低熔點瓊脂糖凝膠回收獲得AdC68中的Xba1-Xba I部分，并替換連接至經Xba I酶切的pNEB193_PX載體中，轉化入Stbl2感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，酶切鑒定得到PNEB193-PX。
[0085](5)刪除pNEB193-PX質粒中AdC68基因組中El部分
[0086]EcoR I和Mfe I雙酶切pShuttle_CMV質粒，依據同尾酶的性質將空載體連接，轉化入DH5a感受態(tài)細胞中得到pShuttle-EM的質粒。根據pShuttle_EM質粒的序列設計擴增Linker的引物(表1)，PCR擴增Linker產物，PCR擴增體系總體積為50uL，反應循環(huán)參數為:95°C預變性5min ;94°C變性Imin ;退火溫度55°C Imin ;72°C延伸lmin。SnaB I和Nde I雙酶切PCR擴增的Linker片段,瓊脂糖凝膠回收Linker產物,連接至經相同酶切的PNEB193-PX載體(通過對AdC68基因組序列分析，利用SnaB I和Nde I兩個酶切位點能將其El部分序列刪除)，轉化入DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，經酶切鑒定得到pNEB193-PX-Linker。
[0087]Linker的序列插入在AdC68基因組第459-3011位之間，替換El的大部份序列。Linker 的序列如 SEQ ID N0:3。
[0088](6)復制缺陷型腺病毒pAdC68質粒構建
[0089]Xba I和Pme I雙酶切pNEB193-PX_Linker質粒DNA，并利用瓊脂糖凝膠回收PX-Linker片段，連接至經相同酶切的低熔點瓊脂糖凝膠回收的pNEB193_KE-AK_XA載體，轉化入Stbl2感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆，經酶切鑒定得到pAdC68-El-deleted。
[0090]復制缺陷型重組腺病毒載體pAdC68-El-deleted的核苷酸序列如SEQ ID N0:2。
[0091]1.2實驗動物
[0092]6-8周齡雌性ICR小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。
[0093]1.3主要試劑
[0094]T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒等均購自寶生物工程(大連)有限公司。Bgl II ,BamH 1、Nhe I,Pac I等限制性內切酶購自NEB公司。Lipofectamine2000DNA 轉染試劑購自 Invitrogen。
[0095]1.4目的基因的獲得
[0096]根據GenBank中狂犬病毒ERA株中Gp編碼區(qū)的核酸序列，合成經密碼子優(yōu)化后的Gp基因(SEQ ID NO:1)，并在已優(yōu)化密碼子的目的基因的5’端依次接入EcoR I和Nhe I酶切位點，3’端接入Xba I酶切位點(圖1)，通過EcoR I和Xba I雙酶切將優(yōu)化后的Gp基因克隆到商品化載體PUC57載體，獲重組質粒PUC57-0/Gp。
[0097]1.5重組腺病毒穿梭載體的獲得[0098]將PUC57_0/Gp質粒經Nhe I和Xba I雙酶切后形成帶有粘性末端的目的基因，同時將腺病毒穿梭載體pshuttle-CMV經Nhe I和Xba I雙酶切得到線性化的載體，使用T4DNA連接酶對上述產物的粘端進行連接。按常規(guī)方法將連接產物轉化，在含卡那霉素抗性的瓊脂平板上篩選，在LB培養(yǎng)基中37 °C過夜培養(yǎng)，提取質粒DNA。采用酶切、PCR等方法進行鑒定，得到陽性重組質粒，命名為pAdshuttle-CMV/Gp。
[0099]1.6獲得重組腺病毒質粒
[0100]質粒pshuttle-CMV/Gp經過P1-Sce I和1-Ceu I雙酶切后形成帶有粘性末端的目的基因，同時將腺病毒載體pAdC68-El-deleted經過P1-Sce I和1-Ceu I雙酶切得到線形化的載體。利用低熔點瓊脂糖膠分離目的片段，將含有目的片段和載體的凝膠65°C孵育5分鐘，待完全溶解后使用T4DNA連接酶對上述產物的粘端進行連接。在感受態(tài)菌Stbl2中按常規(guī)方法將連接產物轉化，取適量的轉化產物涂至含氨芐抗性的瓊脂平板上，于30°C培養(yǎng)24h，挑選氨芐抗性克隆，小量提取質粒DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳遷移率分析，并分別進行Bgl I1、BamH 1、Xho I酶切圖譜分析。將所得的重組腺病毒質粒菌液擴大培養(yǎng)(I:1000)獲得大量高質量的質粒DNA。獲得含狂犬病毒基因的重組腺病毒載體命名為pAdC68-Gp。
[0101]1.7制備重組腺病毒
[0102]用限制性內切酶Pac I線性化重組腺病毒質粒pAdC68_Gp，應用脂質體轉染的方法將質粒轉入HEK293細胞(6孔板)中，37°C孵育6-8天，出現明顯的噬斑。待細胞變圓、懸浮后收集細胞，反復凍融三次后取病毒上清感染HEK293細胞(75ml細胞培養(yǎng)瓶)。重復以上步驟直至收集適量病毒(約20-40個150ml細胞培養(yǎng)瓶)，利用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，測定OD值，加入終濃度為10%的甘油存于-80°C。提取病毒基因組DNA (病毒含量IO12Vps),并進行Bgl I1、BamH 1、Nhe I酶切圖譜分析。利用CMV promoter通用引物檢測目的片段的核酸序列。純化后的病毒在HEK293細胞中連續(xù)傳15代，驗證重組載體的遺傳穩(wěn)定性。
[0103]1.8免疫原性分析
[0104]取一定滴度的重組腺病毒經肌注免疫ICR小鼠，3周后檢測血清中中和抗體的濃度，中和抗體滴度由武漢生物制品研究所測定。
[0105]實驗組:10只ICR小鼠注射IOiciVps重組腺病毒AdC68_Gp ;對照組:10只ICR小鼠注射10lclvps腺病毒空載體AdC68_ept。
[0106]2、實施例
[0107]實施例1、狂犬病毒Gp編碼區(qū)的克隆
[0108]瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切PUC57-0/Gp與預期大小(bp)相符，如圖2 ;由于Nhe I和Xba I為同尾酶,在篩選重組穿梭質粒pAdshuttle-CMV/gp時可能出現反向克隆,首先應用Nhe I和Xba I雙酶切鑒定陽性克隆，再利用pAdshuttle-CMV/gp目的片段以外區(qū)域的單酶切位點EcoR I再次鑒定，酶切重組腺病毒穿梭載體pAdshuttle-CMV/Gp，結果與預期一致。測序結果表明，得到的核酸序列與目的片段優(yōu)化密碼子后的核酸序列相同。
[0109] 實施例2、重組腺病毒的鑒定
[0110]P1-Sce I 和 1-Ceu I 雙酶切 pAdshuttle-CMV/gp 和 pAdC68，用 T4DNA 連接酶對上述產物進行連接。挑選氨芐抗性的克隆后，酶切鑒定質粒pAdC68-Gp，如圖3，與預期大小一致。測序結果表明，得到的核酸序列與目的片段優(yōu)化密碼子后的核酸序列相同。
[0111]大量制備重組腺病毒質粒DNA，將Pac I酶切后的重組質粒轉染HEK293細胞。6-8天后出現明顯的細胞病變。病變初期細胞中出現噬斑，逐漸變大，后期呈拉網狀態(tài)，最終細胞全部漂浮。將已感染病毒的20瓶150ml的細胞收集起來，反復凍融的混合物用氯化銫密度梯度離心法純化病毒，測定重組腺病毒OD值為8.9X 1012vpS/ml。提取病毒基因組，酶切鑒定，片段大小與預期一致。
[0112]實施例3、重組腺病毒感染滴度的測定及遺傳穩(wěn)定性分析
[0113]用不同數量的病毒感染HEK293細胞和肝癌細胞系Huh7，如圖4。感染24h后，在HEK293細胞中出現噬斑(病毒量為IO8Vps);而感染后的Huh7細胞(病毒量為108vps)與對照組無明顯差別，當病毒量達到IOltVps, Huh7細胞中也出現噬斑。將純化后的病毒在HEK293細胞中連續(xù)傳15代，小量收集病毒并且純化，酶切分別鑒定第5代和第15代病毒的基因組，結果證明重組病毒沒有突變，并保持原代病毒的感染能力，如圖5。
[0114]實施例4、血清中中和抗體滴度的測定
[0115]將重組腺病毒載體AdC68_Gp免疫ICR小鼠，3周后測定血清中的中和抗體效價，如圖6。免疫組小鼠血清中中和抗體效價(平均值38.3IU/ml)明顯高于對照組，該重組黑猩猩型腺病毒AdC68-Gp能夠有效地誘導高效價中和抗體。
[0116]綜上，本發(fā)明人已經完成新型重組狂犬病疫苗載體的構建、遺傳穩(wěn)定性的檢測以及免疫原性的監(jiān)測，結果表明新型基于腺病毒載體AdC68的狂犬病疫苗在小鼠體內能誘導出高滴度的特異性中和抗體，遠超出WHO指定的保護性效果的標準。
[0117]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【權利要求】
1.一種狂犬病疫苗載體，其特征在于，所述表達載體包括:復制缺陷型重組腺病毒載體，以及連接于該載體酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I之間的狂犬病毒糖蛋白抗原的編碼序列； 其中，所述的復制缺陷型重組腺病毒載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列替換；所述的連接序列中設置酶切位點1-CeuI 和 P1-Sce I。
2.如權利要求1所述的狂犬病疫苗載體，其特征在于，所述的狂犬病毒糖蛋白抗原的編碼序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如權利要求1所述的狂犬病疫苗載體，其特征在于，所述的連接序列如SEQID NO: 3所示。
4.如權利要求1所述的狂犬病疫苗載體，其特征在于，所述的腺病毒表達載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
5.如權利要求1所述的狂犬病疫苗載體，其特征在于，所述的復制缺陷型重組腺病毒載體制備方法為: 將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列； 所述的4個片段分別是: 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。
6.一種制備狂犬病疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供權利要求1-5任一項所述的狂犬病疫苗載體； (2)將(I)的狂犬病疫苗載體轉染病毒生產細胞，病毒在細胞內包裝，從而獲得具有免疫原性的狂犬病疫苗。
7.—種狂犬病疫苗，其特征在于，所述疫苗由權利要求6所述的方法制備獲得。
8.一種藥盒，其特征在于，所述的藥盒中含有權利要求7所述的狂犬病疫苗。
9.一種用于制備疫苗的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 權利要求1-5任一項所述的狂犬病疫苗載體。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:病毒生產細胞。
【文檔編號】A61K39/205GK103468743SQ201310362921
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權日:2013年8月19日
【發(fā)明者】周東明, 遲喻丹, 鄧飛, 藍柯 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所, 成都遠睿生物技術有限公司