基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的plga載藥空心微囊的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，包括：將PLGA溶于油相，將鹽酸阿霉素DOX溶于超純水中，得到水相；然后將油相和水相混合，超聲處理，得到W/O乳液；將W/O乳液加入PVA溶液中，均質(zhì)化，得到W/O/W乳液；將W/O/W乳液加入異丙醇水溶液中，磁力攪拌，離心洗滌，得PLGA-DOX微囊；將該微囊分散在水中；轉(zhuǎn)入PEI-PEG-FA聚合物水溶液中，攪拌混合，再離心洗滌，冷凍干燥，即得。本發(fā)明的制備過程簡單，實(shí)驗條件為常溫常壓；本發(fā)明制備得到的材料具有良好的藥物緩釋性能，腫瘤細(xì)胞靶向治療效果，為多功能靶向藥物制劑的開發(fā)提供了借鑒。
【專利說明】基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于載藥納米材料領(lǐng)域,特別涉及一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]PLGA具有良好的生物相容性、生物降解性、成膜成囊等特性，使其廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在我們前期工作中，我們采用雙乳化法制備了包裹水溶性抗癌藥物DOX的PLGA空心微囊，可用于超聲成像、磁共振成像及藥物緩釋(申請?zhí)?201310207836.4)，但該法制備的微球系統(tǒng)缺乏對癌組織的特異靶向性，一定程度上限制了其生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。PLGA為鏈狀聚合物，以往使其具備腫瘤細(xì)胞靶向性的改性方式是對其末端基團(tuán)進(jìn)行接枝，但改性效率較低。最近，Ke 等人(H.Ke, et al.Angew.Chem.2011，123，3073 - 3077.)以 PLA 制備微囊，以靜電吸附方法在PLA微 囊外層包裹PAH以達(dá)到改性及改變電荷的目的。另外，Liang等人(B.Liang et al.Biomaterial.2009，30，4014-4020)以 FA 和 PEG 接枝改性 PEI 使其具備良好的腫瘤細(xì)胞靶向性用于膠質(zhì)瘤的抑制。結(jié)合上述方法，在本專利中，我們設(shè)計了一種高效的改性方法，先將腫瘤靶向分子葉酸(FA)接枝在聚乙二醇(PEG)上，進(jìn)而修飾在聚乙烯亞胺(PEI)上，再用靜電吸附法將合成的PE1-PEG-FA包裹在PLGA載藥空心微囊外部。我們評價了 PLGA-D0X-PE1-PEG-FA空心微囊良好的腫瘤細(xì)胞(KB)的靶向差異性，及藥物緩釋性能。制備的PLGA-D0X-PE1-PEG-FA空心微囊有望成為一種新型的靶向載藥制劑。
[0003]檢索國內(nèi)外有關(guān)PLGA微球的藥物制劑方面的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明:目前，還沒有發(fā)現(xiàn)基于PE1-PEG-FA改性的PLGA空心微囊包裹抗癌藥物的制備與應(yīng)用方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，該發(fā)明的制備過程簡單，實(shí)驗條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的制備，用于癌細(xì)胞的靶向化學(xué)治療，具有很好的實(shí)用價值；該發(fā)明制備得到的功能化PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有良好的DOX藥物負(fù)載和緩釋效果以及良好的靶向抗腫瘤活性，為新型多功能靶向藥劑的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明的一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，包括:
[0006](I)將葉酸FA溶于溶劑中，加入N-羥基琥珀酰亞胺NHS及碳二亞胺EDC活化羧基，再加入氨基聚乙二醇羧酸NH2-PEg-COOH,然后在25-28°C條件下，攪拌反應(yīng)2_3d，透析，凍干，再復(fù)溶于溶劑中，加入N-羥基琥珀酰亞胺NHS和碳二亞胺EDC活化羧基，再加入聚乙烯亞胺PEI (Sigma公司)，在25_28°C條件下，攪拌反應(yīng)2_3d，透析，凍干，得到PE1-PEG-FA聚合物；其中投料摩爾比PEI:PEG =FA=I:22:15 ；[0007](2)將聚乳酸羥基乙酸共聚物PLGA (山東濟(jì)南岱罡公司)溶于有機(jī)溶劑中得到油相；將鹽酸阿霉素DOX.Ηα (北京華奉聯(lián)博科技有限公司)溶于超純水中，得到水相；然后將油相和水相混合，在冰水浴中超聲處理20-30S，得到油包水W/0乳液；其中PLGA與DOX -HCl的質(zhì)量比為100:1 ;油相和水相的體積比為5-10:1 ；
[0008](3)將上述W/0乳液加入聚乙烯醇PVA (sigma公司)水溶液中，冰水浴條件下進(jìn)行均質(zhì)化，得到水包油包水W/0/W乳液；其中W/0/W乳液三相(從外到內(nèi))體積比為25-100:5-10:1 ；
[0009](4)將上述W/0/W乳液加入異丙醇水溶液中，攪拌l_4h，使有機(jī)溶劑(PLGA溶液的溶劑)揮發(fā)，并使形成的乳液液滴固化成微球，離心洗滌，得到PLGA-DOX載藥空心微囊；其中W/0/W乳液和異丙醇水溶液的體積比為1:50-100 ；
[0010](5 )將上述PLGA-DOX載藥空心微囊分散于水中，加入PE1-PEG-FA聚合物水溶液，攪拌15_30min，使聚合物充分靜電吸附在微囊表面，離心洗滌，再分散在水中，冷凍干燥，得到基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊(PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊)；其中PLGA-DOX載藥空心微囊與PE1-PEG-FA質(zhì)量比為1-4:1 ;PLGA-D0X載藥空心微囊分散于水中的水的體積、PE1-PEG-FA聚合物水溶液及再次分散的水的體積比為1:50:30。
[0011]所述步驟(I)中溶劑均為二甲基亞砜中DMSO ;產(chǎn)物PE1-PEG-FA分子個數(shù)比為1:15:6 ；PEI分子量為25000，PEG分子量為2000。
[0012]所述步驟(2)中PLGA的分子量Mw為20000-40000，PLGA的有機(jī)溶劑為二氯甲烷CH2Cl2, PLGA溶液的濃度為0.0500mg/L ；D0X.HCl水溶液的濃度為5mg/mL。
[0013]所述步驟(2)中超.聲處理為細(xì)胞破碎儀超聲處理。
[0014]所述步驟(3)中PVA的分子量Mw為20000，PVA溶液的質(zhì)量百分濃度為2%_5%。
[0015]所述步驟(3)中均質(zhì)化為均質(zhì)機(jī)剪切，轉(zhuǎn)速為9500rpm,時間為5_10min。
[0016]所述步驟(4)中離心洗漆為離心轉(zhuǎn)速為3000-3500rpm,離心3_5min,棄去上清液，離心殘留物用超純水水洗，重復(fù)3-5次至離心液澄清無色。
[0017]所述步驟(5)中PE1-PEG-FA聚合物水溶液的濃度為0.25mg/ml-0.5mg/ml。
[0018]所述步驟(5)中冷凍干燥溫度為-50?_80°C，時間為12_20h。
[0019]所述步驟(5)中所得的基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊用于藥物緩釋及癌細(xì)胞靶向治療。
[0020]所述步驟(5)中所制得PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊中DOX經(jīng)紫外-可見分光光度計測定含量為0.8%。
[0021]本發(fā)明中使用均質(zhì)機(jī)對乳液液滴進(jìn)行高速剪切，使乳液液滴尺寸分布均一。兩步乳化過程中均使用冰水浴給乳液降溫，以降低液滴的自由運(yùn)動，也有助于保持液滴的尺寸均一性。
[0022]本發(fā)明中兩步乳化后將乳液轉(zhuǎn)入較大體積的異丙醇溶液中，進(jìn)一步降低乳液液滴之間的相互碰撞，減小液滴之間的匯聚。異丙醇與所使用的有機(jī)溶劑CH2Cl2相混溶，與PLGA不相溶，從而可以促進(jìn)PLGA微球的固化，巧妙地結(jié)合了溶劑揮發(fā)與相分離兩種制備固化微球的技術(shù)。
[0023]PLGA為鏈狀大分子，較難進(jìn)行修飾改性；PEI分子具有較多的氨基，可以通過共價接枝反應(yīng)與腫瘤細(xì)胞靶向分子葉酸結(jié)合，再通過靜電吸附，將接枝的PE1-PEG-FA吸附在PLGA-DOX微囊表面，成功賦予微囊腫瘤細(xì)胞靶向性。
[0024]使用SEM (掃描電子顯微鏡)、CLSM (激光共聚焦顯微鏡)、動態(tài)光散射儀、MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗、FCM (流式細(xì)胞儀)驗證本發(fā)明獲得的具有藥物緩釋功能及腫瘤細(xì)胞靶向治療性能的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的結(jié)果分別如下:
[0025]( I)動態(tài)光散射儀粒徑、電勢測試結(jié)果
[0026]動態(tài)光散射儀測試結(jié)果顯示PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊粒徑較均勻，水合粒徑為3019nm，表面電勢為-4mv。參見說明書附圖2。
[0027](2) SEM測試結(jié)果
[0028]SEM測試結(jié)果顯示了 PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的外形及尺寸分布，參見說明書附圖3?？梢郧逦乜吹絇LGA-DOX-PE1-PEG-FA的囊狀結(jié)構(gòu)，尺寸分布較窄，具有良好的單分散性。平均直徑為2.5 μ m，參見說明書附圖3。
[0029](3) CLSM 測試結(jié)果
[0030]CLSM測試結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了 PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的核殼結(jié)構(gòu)，參見說明書附圖4。經(jīng)油溶性染色劑異硫氰酸熒光素(FITC)染色后，殼層PLGA-PE1-FA呈綠色熒光；D0X吸附在PLGA囊狀內(nèi)核結(jié)構(gòu)顯示為紅色熒光。
[0031](4)體外藥物釋放測試結(jié)果
[0032]以PH7.4的PBS緩沖液和pH5.6的乙酸-乙酸鈉緩沖液做為藥物釋放緩沖液測得PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的體外DOX釋放。測試結(jié)果表明制備的材料具有良好的藥物緩釋效果，72小時后藥物達(dá) 到58%的釋放率，且酸性環(huán)境下釋放稍快。參見說明書附圖
5。(5) MTT測試結(jié)果
[0033]將PLGA-PE1-PEG-FA 空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊和藥物 DOX 與 KB細(xì)胞共培養(yǎng)48h后用MTT法檢測材料的細(xì)胞毒性。PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的體外MTT毒性測試結(jié)果表明制備的材料具有較高的細(xì)胞毒性，包裹的藥物DOX能有效殺死KB細(xì)胞，藥效與自由DOX相近，參見說明書附圖6。不含DOX的PLGA-PE1-PEG-FA空心微囊則和PBS對照組相近，不具有細(xì)胞毒性。
[0034](6) MTT靶向測試結(jié)果
[0035]將PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊和 PLGA_D0X_PE1-PEG-FA 空心微囊與 KB 細(xì)胞共培養(yǎng)4h后洗去微囊材料，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用MTT方法檢測細(xì)胞活力，做靶向性分析。結(jié)果表明，葉酸接枝的PEI修飾的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性，具有良好的腫瘤細(xì)胞靶向性，參見說明書附圖7。
[0036](7) FCM測試結(jié)果
[0037]PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊和 PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊的 FCM 測試結(jié)果表明，與葉酸接枝修飾的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊共培養(yǎng)的KB細(xì)胞具有更高的熒光強(qiáng)度，因而具有更高的細(xì)胞吞噬效果，PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有腫瘤細(xì)胞的靶向性，參見說明書附圖8。
[0038]本發(fā)明方法制備的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊，其微囊尺寸分布較窄，具有良好的分散性。微囊能在酸性環(huán)境下較快的釋放出包裹的抗腫瘤藥物DOX ；MTT結(jié)果表明PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有良好的細(xì)胞毒性，能有效殺死腫瘤細(xì)胞；MTT靶向性分析及FCM測試結(jié)果表明PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有良好的腫留細(xì)胞靶向性和癌細(xì)胞革巴向治療效果。
[0039]以PLGA為基材，制備了功能化的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊靶向藥物制劑。
[0040]本發(fā)明涉及了三個基本原理:
[0041](I)雙乳化法制備的微球固化前為W/0/W乳滴結(jié)構(gòu)，最內(nèi)層水相經(jīng)冷凍干燥后全部揮發(fā)使微囊為空心結(jié)構(gòu)，是后期制備超聲造影劑的基礎(chǔ)。
[0042](2)雙乳化法可引入水溶性的藥物分子，使制備的微囊具有多功能。水溶性藥物DOX -HCl可在第一步乳化過程中進(jìn)入乳滴從而被PLGA吸附在微囊核層，從而使制備的微球具有載藥功能。
[0043](3)靶向性葉酸分子可以通過乙?；磻?yīng)接枝到PE1-PEG聚合物上，再通過靜電吸附的方法對制備的微囊進(jìn)行表面改性，使得制備的微囊具有腫瘤細(xì)胞靶向治療效果，是一種高效率的改性修飾方法。
[0044]本發(fā)明制備靶向載藥制劑的關(guān)鍵要素就是找到一個合適的載體平臺以負(fù)載藥物分子以及靶向分子，形成多功能復(fù)合體。PLGA由兩種單體——乳酸和羥基乙酸聚合而成，是一種可降解的功能高分子，具無毒、良好的成囊和成膜的性能，具有良好的生物相容性?？杀恢苽涑晌⑶蛴糜卺t(yī)學(xué)成像 、藥物輸送、基因治療等領(lǐng)域。雙乳化方法可以制備出空心結(jié)構(gòu)的微球，油溶性以及水溶性的藥物或功能顆?？梢栽谌榛倪^程中載入到微球中。水溶性的DOX.HCl具有較高的抗腫瘤活性，可以在乳化過程中加入到乳滴體系中，微球固化時被吸附在PLGA殼層中，使藥物得到輸送，降低其對正常細(xì)胞的毒害作用。而PLGA為鏈狀大分子，較難進(jìn)行修飾改性；PEI分子具有較多的氨基，可以通過共價反應(yīng)與功能分子進(jìn)行接枝，再通過靜電吸附，將接枝的PE1-PEG-FA吸附在PLGA-DOX微囊表面，成功賦予了微囊的腫瘤細(xì)胞靶向性。
[0045]有益.效果
[0046](I)本發(fā)明的制備過程簡單，實(shí)驗條件為常溫常壓，易于操作，所采用的制備程序可用于PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的制備，用于癌細(xì)胞的靶向化學(xué)治療，具有很好的實(shí)用價值；
[0047](2)本發(fā)明制備得到的功能化PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有良好的DOX藥物負(fù)載和緩釋效果以及良好的靶向抗腫瘤活性，為新型多功能靶向藥劑的開發(fā)打下了良好的基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1為本發(fā)明制備方法簡圖；
[0049]圖2為本發(fā)明制備的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊粒徑(a)及電勢圖(b)；
[0050]圖3為本發(fā)明制備的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的SEM圖片(a)和粒徑分布直方圖(b);圖4為本發(fā)明制備的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊經(jīng)FITC染色的CLSM圖片;
[0051]圖5為本發(fā)明制備的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊的體外藥物釋放圖；藥物釋放所用緩沖液分別為PH7.4的PBS緩沖液和pH5.6的乙酸鹽緩沖液；
[0052]圖6為本發(fā)明制備的PLGA-PE1-PEG-FA空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊以及藥物DOX的MTT細(xì)胞活力圖(KB細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的上述材料，培養(yǎng)48h后，實(shí)施MTT檢測)；
[0053]圖 7 為 PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊與 KB 細(xì)胞共培養(yǎng)4h后洗去材料，繼續(xù)培養(yǎng)48h后用MTT法檢測的MTT細(xì)胞活力測試圖；
[0054]圖8 為本發(fā)明制備的 PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊的KB細(xì)胞FCM熒光強(qiáng)度分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0055]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0056]實(shí)施例1
[0057](I)用2mL CH2Cl2溶解IOOmg PLGA ;用200 μ L超純水溶解Img D0X,將有機(jī)相和水相兩相混合，冰水浴狀態(tài)下用細(xì)胞破碎儀超聲處理30s，形成W/0乳液；
[0058](2)將步驟I的W/0乳液轉(zhuǎn)入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴狀態(tài)下用均質(zhì)機(jī)剪切(9500rpm, 5min)使液滴形成尺寸較為均一的W/0/W乳液；
[0059](3)將步驟2的W/0/W乳液傾倒入80mL2%異丙醇水溶液中磁力攪拌Ih后，離心(3500rpm,3min),棄去上清液,離心殘留物用90mL超純水水洗。重復(fù)上述離心水洗操作三次以上至離心液澄清無色，離心后將離心殘留物重新分散于ImL超純水中；
.[0060](4)將步驟3的離心殘留物溶液快速加入50ml PE1-PEG-FA聚合物水溶液中，磁力攪拌15min，離心水洗三次以上，再重新分散于30ml超純水中，_80°C冰箱冷凍12h后，置于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥處理，即得功能化的殼層具有腫瘤細(xì)胞靶向分子葉酸、內(nèi)層為包裹抗腫瘤藥物DOX的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊。
[0061](5)相同方法制備未包裹DOX的PLGA-PE1-PEG-FA空心微囊，即步驟I中水相不加DOX.HCl。
[0062]合成過程中對離心液用紫外-可見分光光度計進(jìn)行表征。由481nm處DOX.HCl特征吸收峰畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得離心液DOX含量為0.68mg, DOX包裹量為0.32mg, PLGA微球中DOX的百分含量為0.8%。SEM圖片(附圖3a)表明PLGA微球顆粒直徑約2.5 μ m，尺寸分布較窄，具有良好的單分散性。CLSM圖片(附圖4)表明PE1-PEG-FA外部殼層結(jié)構(gòu)及PLGA-DOX內(nèi)層囊狀空心結(jié)構(gòu)。這些測試結(jié)果表明已成功制備了設(shè)計合成的功能化的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊。
[0063]實(shí)施例2
[0064]以pH7.4的PBS緩沖液和pH5.6的乙酸鹽緩沖液做為藥物釋放緩沖液測試PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊的體外 DOX 釋放。取 IOmg PLGA-D0X-PE1-PEG-FA 空心微囊用3mL緩沖液分散后轉(zhuǎn)入透析袋(Mw截留為10000)，將透析袋裝入25mL容量的玻璃瓶內(nèi)，并在玻璃瓶內(nèi)加入7mL相同緩沖液使透析袋內(nèi)外緩沖液總體積為10mL。將上述玻璃瓶放入37°C恒溫?fù)u床，不同時間節(jié)點(diǎn)(0.25，0.5，1，2，4，8，12，24，48，72h)取出3mL緩沖液并補(bǔ)充相同體積相同種類的緩沖液，每個材料濃度做三組平行樣檢測標(biāo)準(zhǔn)偏差。最終將取出的緩沖液在紫外-可見分光光度計下481nm處測試液體吸光度,并進(jìn)一步計算緩沖液中藥物含量及各時間點(diǎn)藥物釋放率。結(jié)果表明制備的材料具有良好的藥物緩釋效果，72小時后藥物達(dá)到58%的釋放率，且酸性環(huán)境下釋放稍快。參見說明書附圖5。
[0065]實(shí)施例3
[0066]通過MTT法檢測細(xì)胞活力來研究PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊復(fù)合物的抗腫瘤活性，用PBS溶液做對照。取人類上皮癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)種于96孔板，種板密度為每孔5 X IO3個KB細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后，將PLGA-PE1-PEG-FA空心微囊、PLGA-D0X-PE1-PEG-FA空心微囊(微球濃度為 3.375，6.75，12.5，25，50，100mg/L, DOX 濃度為 0.025，0.05，0.10，0.20，0.40，
0.80mg/L)與相同濃度的純藥DOX分別與KB細(xì)胞共培養(yǎng)，48h后，將每孔加入20 μ L MTT溶液(5mg/mL)后再培養(yǎng)4h，然后倒出培養(yǎng)基，加入200 μ L DMS0，放入搖床慢速搖動15min，用酶標(biāo)儀在490nm處檢測吸光度，每個材料濃度做三組平行樣檢測標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0067]PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊體外MTT法測試結(jié)果顯示，隨著載藥微囊材料PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊和純藥DOX濃度的增加，細(xì)胞存活率下降，表明制備的材料具有抗腫瘤活性，包裹的藥物DOX能有效殺死KB細(xì)胞，藥效與自由DOX相近，參見說明書附圖6。
[0068]實(shí)施例4
[0069]通過MTT法檢測細(xì)胞活力來研究PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊復(fù)合物的靶向抗腫瘤活性，用PBS溶液做對照。取人類上皮癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)種于96孔板，種板密度為每孔5 X IO3 個 KB 細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后，將 PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA 空心微囊(微球濃度為12.5，25mg/L, DOX濃度為0.10，0.20mg/L)分別與KB細(xì)胞共培養(yǎng)，4h后洗去材料。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，將每孔加入20 μ L MTT溶液(5mg/mL)后再培養(yǎng)4h，然后倒出培養(yǎng)基，加入200 μ L DM SO,放入搖床慢速搖動15min，用酶標(biāo)儀在490nm處檢測吸光度，每個材料濃度做三組平行樣檢測標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0070]PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊體外MTT法測試結(jié)果顯示，葉酸接枝修飾的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊具有更高抗腫瘤毒性，證實(shí)了材料的靶向抗腫瘤活性。參見說明書附圖7。
[0071]實(shí)施例5
[0072]通過FCM法檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度來研究PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊復(fù)合物的腫瘤細(xì)胞靶向性，用PBS溶液做對照。取人類上皮癌細(xì)胞(KB細(xì)胞)種于24孔板，種板密度為每孑 L I X IO5 個 KB 細(xì)胞。培養(yǎng)過夜后，將 PLGA-D0X-PE1-mPEG 空心微囊、PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊(微球濃度為12.5，25mg/L, DOX濃度為0.10，0.20mg/L)分別與KB細(xì)胞共培養(yǎng)，4h后洗去材料，并用0.1ml胰酶將細(xì)胞消化后分散在0.5ml PBS溶液中，冰浴使細(xì)胞降低活力。用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度。每個材料濃度做三組平行樣檢測標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0073]PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊FCM法靶向性測試結(jié)果顯示，葉酸接枝修飾的PLGA-DOX-PE1-PEG-FA空心微囊共培養(yǎng)的KB細(xì)胞具有更高的熒光強(qiáng)度，說明有葉酸靶向分子的材料能被腫瘤細(xì)胞特異地結(jié)合。參見說明書附圖8。
[0074]對比例I
[0075](I)用2mL CH2Cl2溶解IOOmg PLGA ;用200 μ L超純水溶解Img D0X,將有機(jī)相和水相兩相混合，冰水浴狀態(tài)下用細(xì)胞破碎儀超聲處理30s，形成W/0乳液；[0076](2)將步驟I的W/0乳液轉(zhuǎn)入10mL5%PVA水溶液中，冰水浴狀態(tài)下用均質(zhì)機(jī)剪切(9500rpm, 5min)使液滴形成尺寸較為均一的W/0/W乳液；
[0077](3)將步驟2的W/0/W乳液傾倒入80mL2%異丙醇水溶液中磁力攪拌Ih后，離心(3500rpm,3min),棄去上清液,離心殘留物用90mL超純水水洗。重復(fù)上述離心水洗操作三次以上至離心液澄清無色，離心后將離心殘留物重新分散于ImL超純水中
[0078](4)將步驟3的離心殘留物溶液快速加入50ml PEI_mPEG聚合物水溶液中，磁力攪拌15min，離心水洗三次以上，再重新分散于30ml超純水中，_80°C冰箱冷凍12h后，置于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥處理，即得功能化的殼層與實(shí)施例1結(jié)構(gòu)相同但殼層無腫瘤細(xì)胞靶向分子葉酸、內(nèi)層為包裹抗腫瘤藥物DOX的PLGA-D0X-PE1-mPEG空心微囊。
[0079](5)相同方 法制備未包裹DOX的PLGA-PE1-mPEG空心微囊，即步驟I中水相不加DOX.HCl。
【權(quán)利要求】
1.一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，包括: (1)將葉酸FA溶于溶劑中，加入N-羥基琥珀酰亞胺NHS及碳二亞胺EDC，再加入氨基聚乙二醇羧酸NH2-PEG-COOH，然后在25-28°C條件下，攪拌反應(yīng)2_3d，透析，凍干，再復(fù)溶于溶劑中，加入N-羥基琥珀酰亞胺NHS和碳二亞胺EDC，再加入聚乙烯亞胺PEI，在25-28°C條件下，攪拌反應(yīng)2-3d，透析，凍干，得到PE1-PEG-FA聚合物；其中投料摩爾比PEI:PEG =FA=I:22:15 ； (2)將聚乳酸羥基乙酸共聚物PLGA溶于有機(jī)溶劑中得到油相；將鹽酸阿霉素DOX-HCl溶于超純水中，得到水相；然后將油相和水相混合，在冰水浴中超聲處理20-30S，得到油包水ff/Ο乳液；其中PLGA與DOX.HCl的質(zhì)量比為100:1 ;油相和水相的體積比為5-10:1 ； (3)將上述W/0乳液加入聚乙烯醇PVA水溶液中，冰水浴條件下進(jìn)行均質(zhì)化，得到水包油包水W/0/W乳液；其中W/0/W乳液三相體積比為25-100:5-10:1 ； (4)將上述W/0/W乳液加入異丙醇水溶液中，攪拌l_4h，離心洗滌，得到PLGA-DOX載藥空心微囊；其中W/0/W乳液和異丙醇水溶液的體積比為1:50-100 ； (5)將上述PLGA-DOX載藥空心微囊分散于水中，加入PE1-PEG-FA聚合物水溶液，攪拌15-30min，離心洗滌，分散在水中，冷凍干燥，得到基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊；其中PLGA-DOX載藥空心微囊與PE1-PEG-FA質(zhì)量比為1_4:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微球的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中溶劑均為二甲基亞砜中DMSO ;產(chǎn)物PE1-PEG-FA分子個數(shù)比為I:15:6 ；PEI分子量為25000，PEG分子量為2000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中PLGA的分子量Mw為20000-40000，PLGA的有機(jī)溶劑為二氯甲烷CH2Cl2, PLGA溶液的濃度為0.0500mg/L ；D0X -HCl水溶液的濃度為 5mg/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中超聲處理為細(xì)胞破碎儀超聲處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中PVA的分子量Mw為20000，PVA溶液的質(zhì)量百分濃度為2%-5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中均質(zhì)化為均質(zhì)機(jī)剪切，轉(zhuǎn)速為9500rpm，時間為 5-lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中離心洗滌為離心轉(zhuǎn)速為3000-3500rpm,離心3_5min，棄去上清液，離心殘留物用超純水水洗，重復(fù)3_5次至離心液澄清無色。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中PE1-PEG-FA聚合物水溶液的濃度為.0.25mg/ml-0.5mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中冷凍干燥溫度為-50?-80°C，時間為12-20h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于聚乙烯醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空心微囊的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中所得的基于聚乙二醇及葉酸接枝的聚乙烯亞胺改性的PLGA載藥空.心微囊用于藥物緩釋及癌細(xì)胞靶向治療。
【文檔編號】A61K47/22GK103432100SQ201310371108
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】史向陽, 劉偉娜, 溫詩輝 申請人:東華大學(xué)