白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用。本發(fā)明所述白楊素促進(jìn)了IL-4激活的鼠巨噬細(xì)胞替代活化：促進(jìn)抑炎細(xì)胞因子IL-10的釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代活化典型標(biāo)志分子精氨酸酶活的上升，表面分子MGL1/2的上調(diào)，經(jīng)典分子CD206，Ym1，F(xiàn)izz的上調(diào)。特別是在高脂飼喂誘發(fā)的肥胖小鼠C57/B6中，白楊素可以抑制血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、血清中AST和ALT的釋放，提高抑炎細(xì)胞因子IL-10的釋放，并改善了肝臟和脂肪組織的病變，抑制腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，抗原遞呈能力以及NO的釋放能力并且下調(diào)了巨噬細(xì)胞典型活化表面分子CCR7，CD80的表達(dá)。本發(fā)明為治療肥胖相關(guān)代謝炎癥疾病開(kāi)發(fā)了一種新的治療藥物。
【專利說(shuō)明】白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用
一、【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用。
二、【背景技術(shù)】
[0002]白楊素(Chrysin)，化學(xué)名5，7_ 二羥基黃銅，是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種具有廣泛藥理作用的天然黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物、蜂膠和蜂蜜中，是蜂膠的主要成分。由于其抗氧化、抗腫瘤，抗病毒、抗焦慮、抗過(guò)敏和抑制芳香酶活性等廣泛的藥理活性而備受人們關(guān)注。
[0003]白楊素發(fā)揮其抑炎作用主要包括:通過(guò)阻斷組胺的釋放和促炎因子的基因表達(dá)抑制肥大細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏炎癥反應(yīng)；抑制多種細(xì)胞因子、NO和前列腺素E 的釋放而緩解結(jié)腸炎的癥狀，改善結(jié)腸結(jié)構(gòu)的破壞情況；通過(guò)抑制TNF- α誘導(dǎo)的NF- λ B和caspase-1的活性，降低促炎因子的釋放等。但是關(guān)于白楊素在促使巨噬細(xì)胞替代活化從而抑制炎癥的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]巨噬細(xì)胞在炎癥和機(jī)體抵抗外來(lái)微生物入侵時(shí)起一個(gè)中樞的作用，且具有很高的可塑性。在不同的環(huán)境中，巨噬細(xì)胞接受不同的刺激能夠表現(xiàn)出不同的激活方式:典型活化和替代活化。巨噬細(xì)胞的典型活化在維持機(jī)體免疫功能正常運(yùn)行中具有重要的生理功能。細(xì)菌感染如脂多糖(LPS)和IFN-Y等刺激可以使巨噬細(xì)胞發(fā)生經(jīng)典激活，使巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)并具有較強(qiáng)的吞噬和殺菌能力。其紊亂及失調(diào)會(huì)導(dǎo)致各種免疫性疾病，如包括獲得性免疫功能缺失綜合癥(AIDS)、遲發(fā)性超敏反應(yīng)在內(nèi)的免疫缺陷綜合癥，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。而在一些寄生蟲(chóng)感染如血吸蟲(chóng)卵抗原時(shí)，IL-4和IL-13可以使巨噬細(xì)胞發(fā)生替代活化，從而促進(jìn)抗寄生蟲(chóng)感染并參與組織修復(fù)和重塑。發(fā)生替代活化的巨噬細(xì)胞，相對(duì)于典型活化的巨噬細(xì)胞在表型及功能方面均有較大差異。典型活化的巨噬細(xì)胞發(fā)揮促炎功能，可以迅速摧毀入侵的細(xì)菌，誘導(dǎo)氧自由基(ROS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，并分泌促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1 β和IL-12，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，表現(xiàn)出強(qiáng)大的內(nèi)吞作用，清除胞內(nèi)異源性物質(zhì)，殺傷體內(nèi)微環(huán)境中的微生物病原體和腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)造成組織損傷。與典型活化不同，替代活化巨噬細(xì)胞低表達(dá)IL-12、IL-23和TNF-a，高表達(dá)IL-10，同時(shí)還高表達(dá)一些表面受體如I型誘導(dǎo)型精氨酸酶、甘露糖受體、清除劑受體等，以及選擇素CCL12和CCL17和一些分泌產(chǎn)物如Yml (Chi313)和Fizzl (Retnla)，在體內(nèi)發(fā)揮組織修復(fù)、促腫瘤生長(zhǎng)、促血管新生和免疫抑制功能。
[0005]在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞有三項(xiàng)功能:抗原呈遞、吞噬作用以及通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。巨噬細(xì)胞分泌的一些活性分子會(huì)參與有益的炎癥反應(yīng)，也會(huì)參與有害的炎癥反應(yīng)。所以對(duì)巨噬細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物進(jìn)行干預(yù)治療，可為控制炎癥性疾病開(kāi)啟新的途徑。
[0006]代謝性炎癥是由營(yíng)養(yǎng)物和代謝過(guò)剩觸發(fā)炎癥的過(guò)程，其分子及信號(hào)通道相似傳統(tǒng)(低度)的炎癥反應(yīng)。代謝系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)是人類生存最基本的要素系統(tǒng)。很多代謝反應(yīng)途徑和免疫反應(yīng)途徑以及營(yíng)養(yǎng)素和病原體的感知系統(tǒng)，在物種進(jìn)化的過(guò)程中呈高度保守(conserved)。因此，免疫反應(yīng)和代謝調(diào)節(jié)是高度整合的，任何一方的正常作用都依賴于另一方。這個(gè)相互作用的交界面被認(rèn)為是穩(wěn)態(tài)機(jī)制的核心(a central homeostaticmechanism);其功能失?？梢詫?dǎo)致一些慢性代謝性疾病，特別是肥胖、2型糖尿病及心血管病的發(fā)生和聚集。所有這些疾患極大地威脅全球人類的健康和安寧。
[0007]1948年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)將肥胖定義為一種疾病，即肥胖癥。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)肥胖癥本身存在內(nèi)分泌及代謝功能的紊亂外，同時(shí)還伴隨有炎癥的發(fā)生，且肥胖相關(guān)性炎癥反應(yīng)參與了肥胖并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，并有可能影響應(yīng)激情況下全身炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。
[0008]目前治療肥胖相關(guān)代謝炎癥的策略，從代謝和炎癥二者的交界面來(lái)尋找其治療靶點(diǎn)，可從肽類(peptides)和脂質(zhì)介導(dǎo)的兩類通道著手；前者有細(xì)胞因子，趨化因子及其受體。己知抗TNF或抗CCR2 (抗趨化因子受體)的效果有限；因而認(rèn)為處理更為中心的位點(diǎn)可能更為有益。有報(bào)道針對(duì)JNK_IKK通道，用高劑量水楊酸抑制IKK在肥胖小鼠和糖尿病患者可以改善葡萄糖代謝。針對(duì)JNK靶點(diǎn)在用抑制肽類，合成小分子抑制劑或RNA干擾技術(shù)(RNAi )，在不同小鼠模型顯示有改善胰島素作用。在脂質(zhì)相關(guān)的信號(hào)通道方面，用噻唑烷二酮(thiazolidinediones TZDs)取得效果,如PPAR Y配體作為胰島素增敏劑，可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和抗炎效應(yīng)。因此控制肥胖相關(guān)炎癥的持續(xù)，或者說(shuō)消退肥胖相關(guān)炎癥對(duì)于控制代謝性疾病具有重要的意義。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明所述白楊素購(gòu)買于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，白楊素可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向替代活化方向轉(zhuǎn)化，抑制其向典型活化方向轉(zhuǎn)化；并且在動(dòng)物水平上白楊素明顯改善了肝臟組織和脂肪組織的脂變性，極顯著抑制了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力、N0、TNF- α的釋放量，抑制了在典型活化巨噬細(xì)胞中高表達(dá)的表面分子CCR7，MHCII，⑶80的表達(dá)；另外，在動(dòng)物血清水平上也顯著 抑制了炎癥相關(guān)分子的表達(dá)。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
[0012]目前關(guān)于白楊素在調(diào)控巨噬細(xì)胞替代活化方面的研究還屬空白，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上研究這一調(diào)控作用，對(duì)巨噬細(xì)胞及其分泌產(chǎn)物進(jìn)行干預(yù)治療，可為控制炎癥性疾病開(kāi)啟新的途徑。本發(fā)明首次公開(kāi)了白楊素在促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代活化方面的應(yīng)用，本發(fā)明為治療肥胖相關(guān)代謝炎癥疾病開(kāi)發(fā)了一種新的治療藥物。
四、【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1.白楊素在巨噬細(xì)胞中ANA-1中的活性檢測(cè)
[0014]圖2.白楊素抑制了 LPS激活的小鼠典型活化巨噬細(xì)胞表面Marker⑶80，CCR7的表達(dá)；抑制了炎性細(xì)胞因子IL-1 β，TNF-α的釋放。
[0015]圖3.白楊素促進(jìn)了 IL-4激活的替代活化巨噬細(xì)胞表面MarkerMGLl/2的表達(dá)；促進(jìn)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子IL-10的釋放；增強(qiáng)了精氨酸酶活性以及巨噬細(xì)胞替代活化相關(guān)基因CD206，YMl, Fizzl的表達(dá)水平。[0016]圖4.白楊素對(duì)肥胖誘導(dǎo)的小鼠C57/B6的肝臟組織中肝細(xì)胞小泡型脂變具有改善作用，并且對(duì)脂肪組織中脂肪細(xì)胞面積增大、間質(zhì)結(jié)締組織以及單核巨噬細(xì)胞的浸軟具有明顯的改善作用。
[0017]圖5.白楊素極顯著的抑制了高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠C57/B6的炎性細(xì)胞因子的釋放能力以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶的釋放，并且對(duì)血脂以及葡萄糖的含量也有所降低。
[0018]圖6.白楊素極顯著抑制了高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠C57/B6的腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，培養(yǎng)上清中NO和細(xì)胞因子TNF- α的釋放能力，同時(shí)在基因水平也檢測(cè)白楊素抑制了巨噬細(xì)胞的典型活化及抗原遞呈能力。
五、【具體實(shí)施方式】:
[0019]1.白楊素在巨噬細(xì)胞中的活性檢測(cè)
[0020]選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞株ANA-1，離心后用DMEM培養(yǎng)基稀釋成5*104/mL，接種于96孔板中。37°C培養(yǎng)過(guò)夜后加入不同濃度(10 μ M，20 μ M，50 μ M，100 μ M)白楊素，并設(shè)對(duì)照組，370C，5%C02培養(yǎng)箱孵育24h，加入10 μ L MTT溶液，37°C孵育4h，酶標(biāo)儀測(cè)定在570nm吸光度。結(jié)果如圖 1，發(fā)現(xiàn)，白楊素在ANA-1巨噬細(xì)胞中的活性存在劑量和時(shí)間依賴性。藥物濃度在10 μ Μ, 12小時(shí)，與正常組即存在明顯差異，隨著濃度或時(shí)間的增加，細(xì)胞的增殖率明顯下降。
[0021]2.白楊素抑制了巨噬細(xì)胞的典型活化
[0022]2.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)白楊素對(duì)Ml型巨噬細(xì)胞表面Marker⑶80和CCR7表達(dá)的影響
[0023]在6孔板中接種5*105/ml巨噬細(xì)胞,5 μ M或者10 μ M白楊素孵育2小時(shí)后,加入500ng/mlLPS,作用 24h 后，收集細(xì)胞于 1.5mL Eppendorf (EP)管中，300g 離心 5min, 4°C ；用含2%BSA的PBS洗滌細(xì)胞沉淀一次，加入100 μ L抗體工作液(含2%BSA的PBS+熒光抗體)重懸細(xì)胞；陰性對(duì)照樣品中加入相應(yīng)的同型IgG熒光抗體；4°C避光孵育PE-⑶80或PE-CCR730min,期間不停的搖動(dòng)EP管以防止細(xì)胞沉積。用預(yù)冷的PBS洗滌3遍，300g離心5min，加500yL PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FL2通道檢測(cè)其表達(dá)量。結(jié)果如圖2A顯示:LPS可以使巨噬細(xì)胞中⑶80和CCR7的表達(dá)升高，而10 μ M白楊素明顯抑制了其表達(dá)，⑶80從57.95% 降到 47.75%, CCR7 從 21.47% 到 9.47%。
[0024]2.2ELISA檢測(cè)白楊素對(duì)細(xì)胞因子，IL-1 β，TNF- α表達(dá)的影響
[0025]本實(shí)驗(yàn)采用ebioscience的試劑盒,具體操作如下:
[0026]I)預(yù)包被Corning Costar901896孔ELISA板，每孔加入100 μ L含有捕獲抗體的包被緩沖液，Parafilem封住包被孔,4 °C放置過(guò)夜。
[0027]2)吸干每孔的包被液，每孔加入250 μ L0.1%PBST洗滌包被孔，微量振蕩器上振蕩Imin,倒扣洗漆液,吸水紙吸去殘余液體。反復(fù)操作，洗5次。
[0028]3)每孔加入 200 μ LI XAssay Buffer,室溫封閉 lh。
[0029]4)同2)洗滌每孔。
[0030]5)每孔加入100μ L細(xì)胞培養(yǎng)基，同時(shí)用試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。Parafilem封住包被孔,室溫反應(yīng)2h。
[0031]6)同2)洗滌每孔。[0032]7)每孔加入100 μ L檢測(cè)抗體(用IXAssay Buffer稀釋),Parafilem封住包被孔，室溫反應(yīng)Ih。
[0033]8)同2)洗滌每孔。
[0034]9)每孔加入100 μ L親和素偶聯(lián)辣根過(guò)氧化酶(Avidin-HRP,用I XAssay Buffer稀釋)，Parafilem封住包被孔,室溫反應(yīng)30min。
[0035]10)同 2)，洗滌 14 次。
[0036]11)每孔加入100 μ L底物反應(yīng)液，室溫反應(yīng)15min。
[0037]12)每孔加入 50 μ L 終止液(IM H2SO4)
[0038]13)測(cè)定450nm吸光度，并扣除570nm吸光度。
·[0039]14)將測(cè)定的吸光值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可知樣品中細(xì)胞因子的濃度。結(jié)果如圖2B顯示白楊素抑制了巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1 β , TNF-α的釋放。
[0040]3白楊素對(duì)IL-4誘導(dǎo)的替代活化型巨噬細(xì)胞的促進(jìn)作用
[0041]3.1流式細(xì)胞儀檢測(cè)白楊素對(duì)替代活化型巨噬細(xì)胞表面Marker MGLI/2表達(dá)的影響
[0042]檢測(cè)方法同2.1，PE-MGLI/2抗體使用比例皆為1:100，利用FL2通道。結(jié)果如圖3A顯示白楊素促進(jìn)了巨噬細(xì)胞替代活化型表面Marker MGLI/2的表達(dá)，從41.58%升高到59.35%。
[0043]3.2精氨酸酶活性檢測(cè)
[0044]精氨酸酶活性增加作為巨噬細(xì)胞替代活化的經(jīng)典標(biāo)志，我們檢測(cè)了白楊素對(duì)巨噬細(xì)胞精氨酸酶活性的影響。按照以下步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn):
[0045]I)細(xì)胞因子或共培養(yǎng)處理結(jié)束的細(xì)胞全部吹散下來(lái)收集于離心管里，離心機(jī)預(yù)冷至4°C,300g離心5min,棄上清,保留細(xì)胞沉淀。
[0046]2)用ImL預(yù)冷的PBS緩沖液吹洗沉淀一次，300g離心5min。棄上清，保留細(xì)胞沉淀。
[0047]3)每孔加入100 μ L含0.l%TritonX_100的PBS，在振蕩器上振蕩30min，裂解細(xì)胞。
[0048]4)將上一步裂解的細(xì)胞，于4°C，I, OOOg離心5min，小心收集上清，丟棄沉淀。
[0049]5)取上一步收集到的上清裂解液25 μ L，加入20 μ L25mM Tris.HCl(pH7.5)，5 μ LlOmMMnCl2,混合均勻，于56°C反應(yīng)2min激活精氨酸酶。
[0050]6)在上一步溶液中加入 25 μ L0.5Μ L-arginine, 37°C水浴 90min。
[0051]7)加入 200 μ L 終止液(H2S04/H3P04/H20)終止反應(yīng)
[0052]8)加入25 μ L2-異硝基苯丙酮，ParafiIm膜封住EP管口，95°C加熱IOmin。異硝基苯丙酮不溶于水，加入時(shí)會(huì)立即變渾濁，加熱后可溶解，冷卻后又會(huì)變渾濁。
[0053]9)在上步溶液中加200 μ L95%乙醇，溶液立即變澄清，混勻。吸取200 μ L于酶標(biāo)板中，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔。540nm測(cè)定吸光度。
[0054]10)配制IM尿素溶液，按照上述步驟，分別測(cè)定0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M尿素對(duì)應(yīng)的0D540，制作尿素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0055]11)將9)中獲得結(jié)果與尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比即可知最終尿素生成量。BCA法測(cè)定蛋白濃度，得到每毫克蛋白中精氨酸酶的相對(duì)活性。[0056]結(jié)果發(fā)現(xiàn)白楊素極顯著增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞精氨酸的活性(圖3B)。
[0057]3.3ELISA檢測(cè)白楊素對(duì)IL-10表達(dá)的影響
[0058]實(shí)驗(yàn)方法同2.2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白楊素極顯著增強(qiáng)了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)抑炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)(圖3C)。
[0059]3.4Q-PCR檢測(cè)白楊素對(duì)巨噬細(xì)胞替代活化基因m RNA水平的影響
[0060]3.4.1mRNA 的提取
[0061]I)吸去六孔板中每孔中細(xì)胞培養(yǎng)液；每孔中分兩次(0.6ml+0.4ml)共加入ImlTripue,反復(fù)吹打以消化細(xì)胞,收集細(xì)胞懸液于1.5ml Eppendorf管中；
[0062]2) RT靜置5min (冷凍離心機(jī)提前預(yù)冷)；加入CHCl30.2ml (相對(duì)于Tripue，0.2mlCHCl3/mlTripure),劇烈振蕩，靜置 5min ；
[0063]3)4°C放置，12000g 離心 15min ;取 400ul 上清移至新的 1.5ml eppendof 管,加異丙醇0.5ml (相對(duì)于Tripue, 0.5ml異丙醇/mlTripue),反復(fù)顛倒搖勻，靜置5-lOmin ；
[0064]4)4°C下12000g離心IOmin (如果細(xì)胞量較大,可以看見(jiàn)淡黃色少量沉淀);棄去上清，加入75%乙醇Iml (無(wú)水乙醇:DEPC = 3:1現(xiàn)配)；4°C下7500g離心5min ；
[0065]5)棄掉上清，清潔處晾干；加入DEPC水(10-20 μ I)溶解mRNA ;_70°C保存待用。
[0066]3.4.2RT-PCR
[0067]I)按如下體系配制第一反應(yīng)液:
【權(quán)利要求】
1.白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白楊素在制備治療肥胖相關(guān)代謝炎癥藥中的應(yīng)用，其特征是在促進(jìn)巨噬細(xì)胞替代活化，抑制巨噬細(xì)·胞典型活化中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/352GK103432112SQ201310376829
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】沈萍萍, 豐秀靜, 秦浩瀚, 楊威威 申請(qǐng)人:南京大學(xué)