一種重組人干擾素β-1b凍干制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的重組人干擾素β-1b凍干制劑及其制備方法。所述凍干制劑由重組人干擾素β-1b、人血白蛋白、磷酸鹽緩沖液等按一定的比例配置而成，經(jīng)過真空冷凍干燥技術得到凍干制劑，同時制劑制備方法能夠保證該制劑復溶后具有良好的穩(wěn)定性和活性。
【專利說明】-種重組人干擾素 P-1b凍干制劑及其制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術制藥領域，更具體的涉及一種穩(wěn)定的重組人干擾素3 -Ib凍 干制劑及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 干擾素（interferons，IFN)是一類具有抗病毒活性、抑制細胞增殖、抗腫瘤和免 疫調節(jié)功能的細胞因子，根據(jù)與受體結合的原則不同被分為兩個亞型，其中I型目前包括 IFN- a、IFN-P、IFN- T、IFN-co，II型干擾素只有IFN-Y -種，根據(jù)制備方法的不同分為 天然干擾素和基因工程重組干擾素。
[0003] 干擾素作用機制研究表明，它并非直接作為反式作用因子對其效應分子的基因進 行調控，而是借助受體介導的信號轉導系統(tǒng)，引發(fā)一系列特異的生化反應而調控效應分子。 IFN通過誘生多種抗病毒蛋白，抑制病毒在細胞中的復制，以增強NK細胞活性及其免疫調 節(jié)能力，有效遏制病毒侵襲和感染的發(fā)生，抑制腫瘤細胞生長，清除早期惡變細胞。
[0004] 自干擾素被發(fā)現(xiàn)以來，人們對其臨床應用給予極大的希望。早期干擾素是用病毒 和誘生劑誘導人體細胞產(chǎn)生自然干擾素，近年來，隨著基因工程技術的不斷發(fā)展，大量高效 價的重組干擾素基因工程產(chǎn)品越來越多。以1980年干擾素基因的首次克隆為轉折點,干擾 素生產(chǎn)進入了基因工程時代。利用DNA重組技術將特定類型的干擾素基因整合到特定的生 物載體上，通過誘導表達，分離提取純化等復雜步驟，可以得到特定的干擾素單體，通過制 劑工藝得到不同劑型的制劑，其中部分已在臨床上得到廣泛的應用，且療效顯著。
[0005] IFN-P為分子量約為20kD的糖蛋白，由166個氨基酸組成的單鏈蛋白。據(jù)報道重 組人￠-干擾素在大腸桿菌和倉鼠細胞中都有表達。已知重組￠-干擾素能夠有效的延緩 多發(fā)性硬化癥狀患者多發(fā)性硬化的發(fā)展，減輕病人痛苦，同時在免疫調節(jié)和抗腫瘤方面也 有一定效果。目前可以從商業(yè)上獲得的重組￠-干擾素的商品名有：Betaseron，Avonex, Rebif。其中Betaseron-注射用重組人干擾素 P -Ib是第一個被批準用于多發(fā)性硬化疾病 的治療性生物藥，主要通過抑制神經(jīng)中樞系統(tǒng)的免疫反應治療多發(fā)性硬化疾病。
[0006] 大腸桿菌中表達的IFN-P，純化后表達產(chǎn)物活性低且很不穩(wěn)定。其原因可能 與第17位的Cys可在分子間形成二硫鍵有關。1984年，Mark等報道可用任何氨基酸 替代第17位的Cys，從而獲得一系列IFN-P的同系物。1993年美國FDA批準上市的 Betaseron(IFN-P-Ib)即為此類。大腸桿菌表達的重組IFN-P存在一個很重要的問題，就 是由于不含有糖基，分子具有很強的疏水性，使其在水中的溶解度降低。為解決這一問題， 在純化過程中需引入一定量的表面活性劑(如0. 1%SDS)。SDS是一種強陰離子去垢劑，對多 種細胞膜蛋白及疏水蛋白具有很好的溶解效果，已用于多種重組蛋白質包涵體的溶解，但 SDS對許多蛋白的構象可產(chǎn)生不可逆的破壞作用導致活性喪失。IFN-P與其它蛋白質不 同，被SDS溶解后，活性未見明顯降低，其在體外的穩(wěn)定性反而增加。加入SDS后重組人干 擾素P -Ib可以很好地溶解，溶解度在1?5mg/ml，有利于純化過程中的操作。通常在中性 環(huán)境下，SDS會與蛋白結合，SDS會影響內(nèi)毒素western blot等質檢方法的檢測，并有一定 的毒性，影響制劑品質，而干擾素具有較強的疏水性，脫離SDS助溶環(huán)境后，會沉淀析出。如 何有效去除所引入的表面活性劑，同時又要保證干擾素凍干制劑活性不變，成為一項重要 的技術問題。
[0007] 應用n丫陡橙分光光度法來檢測原液和成品中的十二燒基硫酸（sodium dodecyl sulfate，SDS)殘留量：吖啶橙可以與SDS定量結合，形成橙色的SDS-吖啶橙復合物，該復 合物可以用有機溶劑如甲苯從水溶液中抽提出來，可以據(jù)此計算水溶液中SDS的含量。
[0008] 干擾素制劑在臨床上具有廣泛的應用前景，但是在實際生產(chǎn)中，液體制劑的干擾 素制劑存在熱穩(wěn)定性差、不宜長時間保存和遠距離運輸?shù)葐栴}，而凍干后則可解決一些問 題并具有一定的優(yōu)勢，所以干擾素凍干制劑越來越受青睞。常見的蛋白質藥物干燥技術有 冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧-冷凍干燥、超臨界干燥等。干擾素對熱比較敏感，常用真空冷凍 干燥方法干燥。
[0009] 美國專利US6994847公開了一種IFN-P制劑，其中除含有人血白蛋白外，還含有 甘露醇可以作為穩(wěn)定劑，能夠增加干擾素的結合力，但同時增加了該制劑的添加成分，增加 了不良反應風險。
[0010] 中國專利CN200580025725. 5公開了 一種干擾素液體制劑，該專利發(fā)明制劑在 2_8°C儲存條件下能夠保存12-24個月，但是干擾素活性會有部分喪失。
[0011] 美國專利US5702699公開了一種IFN-P的制劑及純化制備方法，但是在純化過程 中用到了 2-丁醇及2-甲基-2-丁醇等有機溶劑，增加了溶劑殘留的風險。
[0012] 和所有蛋白類藥物一樣，如何保證藥物制劑的穩(wěn)定性和有效性是一個關鍵問題， 在藥物制劑中，導致多肽失活和功效降低的性質包括變性、溶解性、水解、氧化等，這些物理 和化學性質的改變有些會導致蛋白質藥效的喪失或降低，因此良好的制劑工藝和凍干工藝 也是穩(wěn)定其活性重要因素。
[0013] 對制劑的穩(wěn)定性檢測不僅進行外觀形態(tài)、效價、內(nèi)毒素、水分等檢測項目，同時也 進行了穩(wěn)定性Dot blotting鑒別和穩(wěn)定性活性檢測。制劑的體外生物學活性的測定主要 依據(jù)其抗病毒細胞病變能力，采用細胞病變抑制法（CPE)計算IFN-P的生物學活性。依據(jù) 干擾素可以保護人羊膜細胞(WISH)免受水泡性口炎病毒（VSV)破壞的作用，用結晶紫對存 活的WISH細胞染色，于波長570nm處測定其吸光度，可得到干擾素對WISH細胞的保護效應 曲線，以此測定干擾素的生物學活性。
[0014] 本專利的制劑配方與制備方法同上述文獻公開的內(nèi)容有所不同，經(jīng)實驗證明本專 利所述方法，能夠擁有比市售產(chǎn)品更長穩(wěn)定性，且所有理化、活性等指標均符合藥典要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的重組人干擾素P-Ib凍干制劑。本發(fā) 明提供的重組人干擾素3 -Ib凍干制劑，不含有甘露醇，在不影響產(chǎn)品質量的前提下，本制 劑配方擁有更少的制劑添加劑，因此減少不良反應風險，使產(chǎn)品更安全。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的在于提供上述重組人干擾素P-Ib凍干制劑的制備方法。該 方法可以使干擾素溫和地脫除SDS，并在沒有SDS助溶的情況下，使目標蛋白穩(wěn)定溶解，并 不影響干擾素的活性、純度，且工藝穩(wěn)定可靠。
[0017] 本發(fā)明提供的重組人干擾素 P -Ib凍干制劑，含有濃度為0. 1?0. 5mg/mL的干擾 素e-ib，1%?3%的人血白蛋白，該凍干制劑用磷酸鹽緩沖液配制。該制劑的緩沖體系濃 度范圍為10?30mM，pH范圍為6. 5-8. 0。
[0018] 所述磷酸鹽緩沖液，為現(xiàn)有技術，本發(fā)明中所使用的磷酸鹽緩沖液配制方法如 下：
[0019] 母液的配制：
[0020] 0? 2M Na2HPO4 :稱取 71. 6g Na2HPO4 ? 12H20,用注射水充分溶解并定容至 1000ml。
[0021] 0. 2M NaH2PO4 :稱取 31. 2g NaH2PO4 ? 2H20,用注射水充分溶解并定容至 1000ml。
[0022] 各種濃度、各種pH的磷酸緩沖液的配置，可將上述兩種母液按照一定比例混合稀 釋后即得。
[0023] 本發(fā)明采用了下述技術方案，將重組的人P -Ib干擾素與穩(wěn)定劑結合進行真空冷 凍干燥得到穩(wěn)定的制劑：
[0024] a、通過大腸桿菌發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)提取分離、變性復性、精細純化等工藝得到重組人 3 -Ib干擾素溶液；
[0025] b、將純化得到的重組人0 -Ib干擾素溶液去除SDS，得到干擾素制劑原液；
[0026] c、將重組人0-Ib干擾素制劑原液，按一定的比例加入穩(wěn)定劑，定溶至一定的體 積后制成半成品；
[0027] d、半成品進行無菌過濾分裝，凍干得到其凍干制劑。
[0028] 其中，步驟a中所述重組人0 -Ib干擾素溶液，是由大腸桿菌表達，經(jīng)純化之后得 到的蛋白溶液，所述干擾素溶液的緩沖體系為PH7. 0-7. 4、濃度為10?IOOmM磷酸鹽緩沖 液，其中含有〇. 1%的SDS、濃度為3-5mg/mL的重組人P -Ib干擾素。
[0029] 其中，步驟b中去除P-Ib溶液體系中的SDS方法，選自下列之一：透析、超濾、SEC 色譜脫鹽法，優(yōu)選SEC色譜脫鹽及超濾法。
[0030] 所述超濾方法中，超濾膜的截留分子量選自下列之一 ：5KD，10KD，20KD，30KD* 50KD，超濾換液過程，膜的平衡體系為濃度為10?IOOmM pHll. 5的NaOH，并進行至少5倍 體系洗慮。
[0031] 所述SEC色譜脫鹽所使用的介質選自下列之一：Sephacryl S200, S100, Sephadex G75, G50, S印hadex G-25, SEC 色譜脫鹽流動相為 1 ?IOmM 的 NaOH，pHll. 0 ?11. 5。
[0032] 其中SEC色譜脫鹽所使用的介質優(yōu)選S印hadex G-25，脫鹽流動相優(yōu)選2. 5mM pHll. 5 的 NaOH。
[0033] 其中選用S印hadex G-25介質進行SEC色譜脫鹽時，清洗準操作方法為：（1)上樣 管、buffer管和柱尾收集管路均浸泡在0. 5MNa0H中；（2)色譜柱經(jīng)0. 5M NaOH處理時間大 于10h，處理體積大于8L ; (3)樣管和buffer管路用注射用水沖洗至中性；（4)色譜柱用注 射用水沖洗至中性。
[0034] 選用S印hadex G-25SEC色譜脫鹽時，上樣前平衡至少2個柱體積，樣品上樣濃度 2. 0-2. 5mg/mL，上樣體積為 0? 5-1%。
[0035] 選用S印hadex G-25SEC色譜脫鹽，其中樣品收集方式為UV280起峰5mAu?峰尾 5mAu，收集樣品混合均勻用0. 22 ii m膜過濾除菌。
[0036] 其中，步驟c所述穩(wěn)定劑為人血白蛋白，半成品的配置過程為在干擾素制劑原液 中，加入一定量的人血白蛋白和磷酸鹽緩沖液，使半成品緩沖體系濃度范圍為10?30mM， pH為6. 5?8. 0,其中以20mM，pH7. O時效果最佳。干擾素P -Ib濃度為0? 1?0? 5mg/mL， 白蛋白含量為1%?3%。
[0037] 其中，步驟d凍干方法為真空冷凍干燥；制劑冷凍干燥前進行0. 22pm濾膜過濾除 菌、分裝至2ml西林瓶，分裝規(guī)格為I. ImL/瓶。
[0038] 整個凍干過程是在擱架溫度保持在一 40°C?30°C下進行的。
[0039] 凍干方法為一 40°C預凍2?3小時，抽真空，保持4?6小時，然后在保持真空下 升溫，每小時升高5?KTC，溫度升高到30°C后，保持溫度與真空3?5小時，最后，通入氮 氣，進行容器封口。
[0040] 本發(fā)明提供的穩(wěn)定的重組人干擾素P -Ib凍干制劑及其制備方法，不僅含有安全 有效的重組人干擾素3-lb，經(jīng)實驗證明本專利所述方法，能夠擁有比市售產(chǎn)品更長穩(wěn)定 性，且所有理化、活性等指標均符合藥典要求。
[0041] 本發(fā)明的配方和制備方法和現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：
[0042] 1、本發(fā)明的制劑，不含甘露醇，在不影響產(chǎn)品質量的前提下，本制劑配方擁有更少 的制劑添加劑，因此減少不良反應風險，使產(chǎn)品更安全。
[0043] 2、本發(fā)明的純化方法，可以使干擾素溫和地脫除SDS，并在沒有SDS助溶的情況 下，使目標蛋白穩(wěn)定溶解，并不影響干擾素的活性、純度，且工藝穩(wěn)定可靠。
[0044] 3、本發(fā)明的凍干方法，可使凍干后的制劑具有良好的穩(wěn)定性和活性特性，在常溫 條件下能夠儲存6-18個月，且能夠保持很好的制劑活性。
[0045] 以下實驗用于說明本發(fā)明的有益效果。
[0046] 實驗一 ：S印hadex G-25色譜脫鹽實驗及SDS殘留檢測，具體方法詳見實施例2。
[0047] 實驗二：制劑活性穩(wěn)定性實驗：采用細胞病變抑制法（CPE)計算IFN-P的生物學 活性；干擾素穩(wěn)定性效價檢測；dot-blotting檢測干擾素穩(wěn)定性實驗等，具體方法詳見實 施例5、6。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0048] 圖1、重組人P -Ib干擾素G25置換緩沖液圖
[0049] 圖2、SDS-PAGE電泳檢測重組人P -Ib干擾素制劑原液純度結果圖
[0050] (1 :脫鹽前2 :脫鹽后3 :脫鹽前⑶4 :脫鹽后⑶M :蛋白標準marker )
[0051] 圖3、穩(wěn)定性Dot blotting鑒別結果圖
[0052] 圖4、121230批干擾素穩(wěn)定活性檢測結果圖
[0053] (A-E分別為25°C條件下不同時間段活性檢測結果。A:3個月：3. 24E+07 ;B:6個 月：3. 31E+07 ;C:9 個月：3. 37E+07 ;D: 12 個月：3. 10E+07 ;E: 18 個月：1. 78E+07)

【具體實施方式】
[0054] 以下通過具體實施例進一步說明本發(fā)明。
[0055] 實施例1 :制劑原液制備
[0056] SEC色譜脫鹽制備制劑原液
[0057] 收集大腸桿菌發(fā)酵液，經(jīng)純化得到重組人P-Ib干擾素溶液。此時的溶液體系 為0. 1% (w/v) SDS+10?IOOmM磷酸緩沖溶液，pH7. 0?7. 4,因此需要采用緩沖液置換的 方法將干擾素原緩沖體系更換為制劑原液體系，同時將原體系中的相關物質殘留量降低 到藥典規(guī)定水平以下。采用SEC色譜脫鹽的方法進行換液。SEC色譜脫鹽選用S印hadex G_25Superfine，尺寸：5. 0X40cm，流速：10mL/min，流動相為 2. 5Mm pHll. 5 的 NaOH。樣品 收集從UV280起峰5mAu?峰尾5mAu的蛋白。收集樣品混合均勻用0. 22 ii m膜過濾除菌。 脫鹽結果見圖1，電泳結果見圖2。
[0058] 超濾法脫鹽制備制劑原液
[0059] 收集大腸桿菌發(fā)酵液，經(jīng)純化得到重組人P-Ib干擾素溶液。此時的溶液體系為 0. 1% (w/v)SDS+10?IOOmM磷酸緩沖溶液，pH7. 0?7. 4,因此需要采用緩沖液置換的方法 將干擾素原緩沖體系更換為制劑原液體系，同時將原體系中的相關物質殘留量降低到藥典 規(guī)定水平以下。本實施例采用超濾的方法進行換液。超濾選用IOKD膜包，膜的平衡體系為 3mM pHll. 5的NaOH，并進行8倍體系洗濾。
[0060] 相關物質殘留檢測選用吖啶橙-分光光度計法檢測制劑原液制品中SDS含量。該 方法可以有效地將目標蛋白與原緩沖體系分離，收率大于85%，相關物質殘留量：SDS小于 0.002%。
[0061] 實施例2 :n丫啶橙-分光光度法檢測SDS殘留
[0062] 將SDS標準品按不同濃度與吖啶橙混合作用后，經(jīng)甲苯萃取，再測定甲苯萃取相 在可見光499nm處的吸光光度值，得到標準曲線，根據(jù)待測樣品的499nm吸光光度值，求出 其SDS濃度。
[0063] 精密配置濃度分別為 0、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04g/L 的 SDS 溶液各 10ml。 0. 5mol/L的NaHSO4溶液配置的0. 4%的吖啶橙溶液50ml。
[0064] 分別取IOOul不同濃度的SDS溶液和待檢品于帶塞試管中，并加入IOOulO. 5mol/ L的NaHSO4溶液配置的0.4mol/L的吖啶橙溶液混勻。加入3ml甲苯后塞緊試管，劇烈振蕩 3min，2000g/min離心5min，取上清測定499n m處光吸收值。
[0065] 表ISDS殘留檢測標準曲線數(shù)據(jù)
[0066]

【權利要求】
1. 一種重組人干擾素P -lb凍干制劑，其特征在于，所述制劑含有濃度為0. 1? 0. 5mg/mL的干擾素0 -lb, 1%?3%的人血白蛋白，該凍干制劑用磷酸鹽緩沖液配制，所述制 劑緩沖體系濃度范圍為10?30mM，pH范圍為6. 5-8. 0。
2. 權利要求1的凍干制劑的制備方法，其特征在于，步驟如下： a、 通過大腸桿菌發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)提取分離、變性復性、精細純化等工藝得到重組人 3 -lb干擾素溶液； b、 將純化得到的重組人0 -lb干擾素溶液去除SDS，得到干擾素制劑原液； c、 將重組人3 -lb干擾素制劑原液，按一定的比例加入穩(wěn)定劑，定溶至一定的體積后 制成半成品； d、 半成品進行無菌過濾分裝，凍干得到其凍干制劑。
3. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟a中所述重組人0-lb干擾素 溶液，是由大腸桿菌表達，經(jīng)純化之后得到的蛋白溶液，所述干擾素溶液的緩沖體系為 pH7. 0-7. 4、濃度為10?lOOmM磷酸鹽緩沖液，其中含有0. 1%的SDS、濃度為3-5mg/mL的重 組人0-lb干擾素。
4. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟b中所述去除0-lb溶液體系中的 SDS方法，選自下列之一：透析、超濾、SEC色譜脫鹽法，優(yōu)選SEC色譜脫鹽及超濾法。
5. 如權利要求4所述的制備方法，其中所述超濾方法中，超濾膜的截留分子量選自下 列之一 ：5KD，10KD，20KD，30KD或50KD，超濾換液過程，膜的平衡體系為濃度為10?lOOmM、 pHll. 5的NaOH，并進行至少5倍體系洗濾。
6. 如權利要求4所述的制備方法，其中所述SEC色譜脫鹽所使用的介質選自下列之一： S印hacryl S200, S100, S印hadex G75, G50, S印hadex G-25, SEC 色譜脫鹽流動相為 1 ? 10mM 的 NaOH pHll. 0 ?11. 5。
7. 如權利要求6所述的制備方法，其中所述SEC色譜脫鹽所使用的介質優(yōu)選Sephadex G-25, SEC色譜脫鹽流動相優(yōu)選2. 5mM pHll. 5的NaOH。
8. 如權利要求6或7任一所述的制備方法，其中選用Sephadex G-25介質進行SEC色 譜脫鹽時，清洗標準操作方法為：（1)上樣管、buffer管和柱尾收集管路均浸泡在0. 5MNaOH 中；（2)色譜柱經(jīng)0.5M NaOH處理時間大于10h，處理體積大于8L; (3)樣管和buffer管路 用注射用水沖洗至中性；（4)色譜柱用注射用水沖洗至中性。
9. 如權利要求6或7任一所述的制備方法，其中選用S印hadex G-25介質進行SEC色譜 脫鹽時，上樣前平衡至少2個柱體積，樣品上樣濃度為2. 0-2. 5mg/mL，上樣體積為0. 5-1%。
10. 如權利要求6或7任一所述的制備方法，其中選用Sephadex G-25介質進行SEC色 譜脫鹽時，其樣品收集方式為UV280起峰5mAu?峰尾5mAu，收集樣品混合均勻用0. 22 ii m 膜過濾除菌。
11. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟c所述的穩(wěn)定劑為人血白蛋白， 半成品的配置過程為，在干擾素制劑原液中，加入一定比例的人血白蛋白和磷酸鹽緩沖液， 使半成品緩沖體系濃度范圍為10?30mM，pH為6. 5?8.0,干擾素@-lb濃度為0. 1? 0? 5mg/mL，白蛋白含量為1%?3%。
12. 如權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟d凍干方法為真空冷凍干燥；制 劑冷凍干燥前進行〇. 22 y m濾膜過濾除菌、分裝至2ml西林瓶，分裝規(guī)格為1. lmL/瓶。
13.如權利要求12所述的制備方法，其特征在于，整個凍干過程是在擱架溫度保持 在一 40°C?30°C下進行的；所述凍干方法為一 40°C預凍2?3小時，抽真空，保持4?6 小時，然后在保持真空下升溫，每小時升高5?1(TC，溫度升高到30°C后，保持溫度與真空 3?5小時，最后，通入氮氣，進行容器封口。
【文檔編號】A61K47/42GK104415325SQ201310377609
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權日:2013年8月27日
【發(fā)明者】曹小丹, 李靜, 徐立華, 范寶慶, 張玲, 張學況, 薛雯, 李劍 申請人:天士力制藥集團股份有限公司